西伯利亞白刺鹽脅迫響應(yīng)NsCIPKs基因鑒定及表達(dá)分析

摘 要 鈣離子作為普遍存在的第二信使能夠?qū)⑼饨缑{迫快速轉(zhuǎn)化為信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，使植物對(duì)脅迫做出響應(yīng)，而鈣調(diào)磷酸酶B互作蛋白激酶（CBL interacting" protein kinase，CIPKs）是鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)途徑的核心和關(guān)鍵之一。本研究以鹽生植物西伯利亞白刺 （Nitraria sibirica） 作為試驗(yàn)材料，基于鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組，利用生物信息學(xué)方法對(duì)NsCIPKs家族鹽脅迫相關(guān)基因進(jìn)行鑒定，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析鹽脅迫響應(yīng)NsCIPKs基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明：共鑒定到8個(gè)響應(yīng)鹽脅迫的NsCIPKs成員，均編碼堿性親水蛋白且定位于細(xì)胞核，不同基因理化性質(zhì)存在差異但結(jié)構(gòu)保守。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明：8個(gè)NsCIPKs可分為4組，存在于6個(gè)亞族中，基因分化均出現(xiàn)于單雙子葉植物分化后。qRT-PCR結(jié)果顯示：NsCIPKs各成員均對(duì)不同鹽濃度處理的鹽脅迫有響應(yīng)，且集中于根部與莖部表達(dá)，根中對(duì)鹽脅迫響應(yīng)持久、迅速且高表達(dá)的基因?yàn)?NsCIPK1與 NsCIPK7，莖中為 NsCIPK3、 NsCIPK7與 NsCIPK8，葉中為 NsCIPK3。綜上， NsCIPK1、 NsCIPK3、 NsCIPK7與 NsCIPK8可能在鹽脅迫下發(fā)揮重要的作用。相關(guān)研究結(jié)果可為西伯利亞白刺耐鹽分子機(jī)制探索及轉(zhuǎn)基因新品種創(chuàng)制提供候選基因。

關(guān)鍵詞 鹽脅迫；CIPK；西伯利亞白刺;表達(dá)分析

目前，全球20%以上耕地受到土壤鹽漬化影響，到2050年受影響的面積將達(dá)到50%^[1]，由此導(dǎo)致的糧食損失每年將高達(dá)2 730億美元^[2]。植物不像動(dòng)物一樣通過(guò)移動(dòng)來(lái)避免不良環(huán)境，因此在進(jìn)化過(guò)程中形成極為復(fù)雜的鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制。從植物響應(yīng)鹽脅迫的分子水平來(lái)看，植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)是涉及多個(gè)功能與調(diào)控蛋白基因參與的動(dòng)態(tài)調(diào)控過(guò)程^[3-4]。鹽脅迫響應(yīng)基因根據(jù)編碼蛋白功能可分成兩大類(lèi)：一類(lèi)是編碼執(zhí)行離子區(qū)隔化、轉(zhuǎn)運(yùn)和分配，以及保護(hù)功能蛋白的基因，如鈉離子反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、LEA（late embriogenesis abundant protein，LEA）蛋白基因、水通道蛋白基因等；另一類(lèi)是調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)、參與信號(hào)接收、轉(zhuǎn)導(dǎo)及編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)類(lèi)蛋白等相關(guān)的基因，涉及轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、激素、鈣離子等分子信號(hào)^[5]。

Ca²⁺作為植物中普遍存在的第二信使，在植物受到脅迫刺激時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度迅速增加，游離的鈣離子與鈣感受器蛋白結(jié)合從而進(jìn)行調(diào)控。常見(jiàn)的鈣感受器-類(lèi)鈣調(diào)磷酸酶B樣蛋白（Calcineurin B like protein，CBL）與其互作蛋白絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（CBL interacting protein kinase，CIPK）結(jié)合，激活靶蛋白使其對(duì)脅迫產(chǎn)生反饋^[6-8]，被稱為CBL-CIPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑。擬南芥（Arabidopsis thaliana）根部SOS（salt"" overly" sensitives，SOS）途徑是植物中第一個(gè)鑒定出的CBL-CIPK網(wǎng)絡(luò)，由3個(gè)部分組成，SOS3（CBL4）接受到來(lái)自鈣離子的信號(hào)后與SOS2（CIPK24）結(jié)合利用CBL4/CIPK24復(fù)合物磷酸化激活Na⁺/H⁺離子通道SOS1，從而控制Na⁺外排^[9-10]；此外，CBL10與SOS2結(jié)合也可以激活SOS1通道，且有研究表明其與CIPK2結(jié)合可能通過(guò)NHX蛋白將Na⁺區(qū)隔化在液泡中^[11]。如今在水稻（Oryza sativa）^[12]、棉花（Gossypium）^[13]和蘋(píng)果（Malus pumila）^[14]等植物中也發(fā)現(xiàn)了該途徑的存在。不同的SOS途徑中，CIPK基因均發(fā)揮了不可替代的作用。

西伯利亞白刺^[15]又名小果白刺，是蒺藜科白刺屬多年生木本灌木，為典型稀鹽型鹽生植物，可在含鹽量高于15 g/kg的重鹽堿地正常生長(zhǎng)，對(duì)惡劣生境有極強(qiáng)的適應(yīng)能力，亦可作為牲畜飼料，是防風(fēng)固沙、保持水土及重鹽堿地改良的先鋒型植物，分布于中國(guó)西北及華北鹽堿地區(qū)、東北蘇打鹽堿地區(qū)和環(huán)渤海濱海鹽堿地區(qū)及西伯利亞地區(qū)，具有極高的生態(tài)應(yīng)用價(jià)值，也是研究植物耐鹽分子機(jī)制與挖掘耐鹽抗逆等基因資源的重要材料。目前有關(guān)西伯利亞白刺耐鹽分子機(jī)制研究較少，多集中在脅迫后生理生化響應(yīng)機(jī)制特征的分析。

截至目前，尚未有西伯利亞白刺CIPK家族耐鹽基因篩選挖掘相關(guān)報(bào)導(dǎo)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以快速獲得某一物種或組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)情況，為功能基因挖掘提供可能^[16-17]。為此，本項(xiàng)研究基于轉(zhuǎn)錄組二代及三代測(cè)序序列組裝、注釋和表達(dá)水平定量結(jié)果的共同參考，擬對(duì)西伯利亞白刺全株CIPK響應(yīng)鹽脅迫的基因進(jìn)行篩選鑒定，并從進(jìn)化關(guān)系、保守結(jié)構(gòu)域、結(jié)構(gòu)特征、鹽脅迫下的表達(dá)量等方面進(jìn)行系統(tǒng)分析，最終篩選出鹽脅迫相關(guān)重要NsCIPK家族成員。研究可為豐富西伯利亞白刺基因庫(kù)，揭示西伯利亞白刺響應(yīng)鹽脅迫反饋與調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 西伯利亞白刺鹽脅迫響應(yīng)NsCIPKs家族成員的鑒定

本研究所用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為西伯利亞白刺根和葉短期鹽脅迫（10 min），滲透壓脅迫及無(wú)脅迫的三代測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組，在NR、Swiss-prot和Pfam 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋，初步注釋后去除重復(fù)序列及冗余轉(zhuǎn)錄本。通過(guò)NCBI上的CDD（Conserved Domains Database）在線工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ bwrpsb/bwrpsb.cgi）及pfam（http：//pfam.xfam.org/）對(duì)鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組中獲得的候選基因進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)與鑒定^[18]，最終保留具有含保守結(jié)構(gòu)域的CIPK家族基因序列。

1.2 NsCIPKs生物信息學(xué)分析

在ExPasy（https：//web.expasy.org/protparam/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)NsCIPKs家族成員基本理化性質(zhì)，使用在線程序 SOPMA（https ：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin /secpred sopma .pl ）進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。使用在線軟件 Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）對(duì)西伯利亞白刺CIPK蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用在線軟件MEME（https：//meme-suite.org/meme/）分析西伯利亞白刺CIPK家族蛋白的保守基序。通過(guò)Mega 7.0中鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，重復(fù)值設(shè)為 1 000^[19]。

1.3 不同濃度鹽處理下西伯利亞白刺不同組織中NsCIPKs表達(dá)水平

以西伯利亞白刺無(wú)性系組培苗為材料，在 25 ℃、長(zhǎng)日照[光照16 h；黑暗8 h；光照強(qiáng)度：120"" μmol/（m2·s）]溫室中培養(yǎng)8周后選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株進(jìn)行200 mmol/L與400 mmol/L NaCl脅迫處理，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3～6次，分別提取0、6、12、24、48、72 h共6個(gè)時(shí)間段兩種處理的根莖葉總RNA并分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為qPCR模板。

對(duì)本研究所篩選的NsCIPKs基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)各基因特異序列設(shè)計(jì)上下游定量引物，引物序列見(jiàn)表1，退火溫度（T_m）均為（60±0.5）" ℃。選用actin基因^[20]為內(nèi)參，各基因0 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量為1，檢測(cè)各基因在不同時(shí)間和鹽濃度下的表達(dá)情況，根據(jù)TransStart Top Green qPCR SuperMix（全式金）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)液的配制，在MJ MiniTM personal thermal cycler（BIO-RAD） Real-time PCR儀器上進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，采用2^-ΔΔCT的方法^[21]計(jì)算NsCIPKs基因的相對(duì)表達(dá)量并使其可視化。

1.4 鹽脅迫響應(yīng)NsCIPKs編碼蛋白序列比對(duì)

將不同鹽處理下篩選出的F01_transcript_8177（ NsCIPK1）、F01_transcript_15178（ NsCIPK3）、F01_transcript_89644 （ NsCIPK7）與F01_transcript_10527 （ NsCIPK8） 4個(gè)重要NsCIPK家族基因編碼蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，比較其保守結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 西伯利亞白刺鹽脅迫響應(yīng)CIPK家族成員鑒定

基于西伯利亞白刺鹽脅迫、滲透壓脅迫及三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在NR、Swiss-prot和 Pfam 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋，根據(jù)注釋初步獲得30個(gè)CIPK基因。利用primer 5將已鑒定的基因序列翻譯成蛋白序列，并通過(guò)CDD及Pfam對(duì)其進(jìn)行鑒定，去除重復(fù)序列及不含NAF保守結(jié)構(gòu)域的CIPK序列，最終得到西伯利亞白刺的8個(gè)CIPK家族成員，命名為NsCIPK1、NsCIPK2、NsCIPK3、NsCIPK4、NsCIPK5、NsCIPK6、NsCIPK7和NsCIPK8。

2.2 NsCIPKs生物信息學(xué)分析

2.2.1 NsCIPKs家族理化性質(zhì)

由表2可知，已鑒定的CIPK氨基酸全長(zhǎng)除NsCIPK6為251 aa外，其余均在438～462 aa，除NsCIPK6為 28.71 ku外，其余CIPK的分子質(zhì)量均在50 ku左右。等電點(diǎn)及不穩(wěn)定系數(shù)顯示所有蛋白均為堿性穩(wěn)定蛋白。此外NsCIPKs蛋白的平均親水系數(shù)在―0.473與―0.198之間，但均為負(fù)值，表明研究中所有NsCIPK鹽脅迫相關(guān)家族成員都是親水蛋白。

2.2.2 NsCIPKs二級(jí)結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)（表3），篩選出的所有NsCIPKs蛋白均具有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈與無(wú)規(guī)則卷曲，其中α-螺旋與無(wú)規(guī)則卷曲的比例較高，范圍由最低33.47%至最高42.08%，β-轉(zhuǎn)角比例最低，在10%左右。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示這些蛋白均定位在細(xì)胞核上，推測(cè)NsCIPK家族鹽脅迫相關(guān)通路成員均在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。

2.2.3 NsCIPKs結(jié)構(gòu)域與保守基序分析

利用TBtools軟件將NsCIPKs基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域與基序進(jìn)行結(jié)構(gòu)可視化分析，圖1可見(jiàn)所有NsCIPKs均含有NAF蛋白激酶（Pkinase，protein kinase）結(jié)構(gòu)域及與AMPK互作的結(jié)構(gòu)域（AMPKA_C_like superfamily）。根據(jù)前人對(duì)于研究的CIPK各個(gè)基序所在位置的研究推測(cè)，位于C端的基序6為PPI，而其N(xiāo)端為NAF結(jié)構(gòu)域。其余4個(gè)基序組成kinase結(jié)構(gòu)域部分，目前已知Pkinase結(jié)構(gòu)域中均包含有ATP結(jié)合位點(diǎn)及活性位點(diǎn)（active site）。

2.2.4 NsCIPKs系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)本研究鑒定出的NsCIPKs進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，比較擬南芥、水稻及其他已驗(yàn)證響應(yīng)鹽脅迫的CIPK與西伯利亞白刺的進(jìn)化關(guān)系，其中西伯利亞白刺用綠色標(biāo)注出來(lái)。圖2顯示，CIPK被分成6個(gè)簇，分為4個(gè)group，其中g(shù)roup 1和group 2中均只有1個(gè)西伯利亞白刺的基因，group 1中的NsCIPK8與擬南芥的CIPK5及CIPK25均有較高的同源性，而group 2中的NsCIPK7與胡楊（Populus euphratica）的CIPK26有較高的同源性。西伯利亞白刺的CIPK家族成員大多聚集在group 3與group 4中，其中NsCIPK5與AtCIPK11、NsCIPK6與AtCIPK14、NsCIPK3與AtCIPK7及AtCIPK14、NsCIPK2與AtCIPK6、NsCIPK1與AtCIPK15、NsCIPK4與AtCIPK2及AtCIPK10均為高度同源。整體看來(lái)，西伯利亞白刺N(yùn)sCIPKs家族與單子葉植物水稻進(jìn)化樹(shù)距離遠(yuǎn)，與雙子葉植物胡楊與擬南芥存在于同一亞族。說(shuō)明該西伯利亞白刺該家族鹽脅迫響應(yīng)基因的分化選擇可能出現(xiàn)于單雙子葉植物分化后。

2.3 不同濃度鹽處理下西伯利亞白刺不同組織中NsCIPKs表達(dá)水平

進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了各家族成員在不同鹽脅迫下的時(shí)空表達(dá)模式，并進(jìn)行可視化。如圖3，根部不同鹽濃度處理下，隨著鹽脅迫時(shí)間增加，8個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量均出現(xiàn)變化，尤以 NsCIPK1與 NsCIPK7在所有時(shí)間段相對(duì)表達(dá)量持續(xù)變化。200 mmol/L鹽處理下， NsCIPK1、 NsCIPK2、 NsCIPK3、 NsCIPK5、 NsCIPK7及 NsCIPK8呈先升高后降低的趨勢(shì)，達(dá)到峰值后逐漸降低，相對(duì)表達(dá)量峰值出現(xiàn)在 12 h與24 h。400 mmol/L鹽處理下， NsCIPK1、 NsCIPK4、 NsCIPK5、 NsCIPK7、 NsCIPK8呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)，相對(duì)表達(dá)量峰值大都出現(xiàn)在6 h與24 h，早于200 mmol/L鹽處理。

如圖4，莖部不同鹽濃度處理下，隨著時(shí)間增加，8個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)變化，且 NsCIPK3、 NsCIPK7與 NsCIPK8相對(duì)表達(dá)量在所有時(shí)間均發(fā)生變化， NsCIPK8相對(duì)表達(dá)量均呈先升高后降低的趨勢(shì)，NsCIPK6呈降低趨勢(shì)。200 mmol/L鹽處理下 NsCIPK1、 NsCIPK2、 NsCIPK3、 NsCIPK4、 NsCIPK5、 NsCIPK7相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)，并于第1次升高時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，大都出現(xiàn)在6 h。400 mmol/L鹽處理下， NsCIPK2、 NsCIPK3、 NsCIPK5、 NsCIPK7、 NsCIPK8呈先升高后降低的趨勢(shì)， NsCIPK8變化峰值出現(xiàn)早于200 mmol/L鹽 處理。

如圖5，在葉中隨著鹽脅迫時(shí)間增加，僅 NsCIPK3、 NsCIPK5、 NsCIPK7與 NsCIPK8四個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量在12 h出現(xiàn)不同程度上升，其余整體均呈下降趨勢(shì)，200 mmol/L鹽處理下峰值出現(xiàn)于12 h，400 mmol/L鹽處理下相對(duì)表達(dá)量峰值大都出現(xiàn)在48 h，尤以 NsCIPK3基因表達(dá)持久，但莖部不同處理下相對(duì)表達(dá)量變化情況均弱于根部與莖部表達(dá)。

結(jié)果顯示不同NsCIPKs基因在不同濃度鹽處理下表達(dá)模式存在差異，集中在根部與莖部 表達(dá)。

2.4 鹽脅迫響應(yīng)NsCIPKs編碼蛋白序列比對(duì)

通過(guò)不同濃度鹽處理下西伯利亞白刺不同組織中NsCIPKs表達(dá)水平研究，篩選出 NsCIPK1、 NsCIPK3、 NsCIPK7與 NsCIPK8這4個(gè)耐鹽相關(guān)重要CIPK基因。經(jīng)多序列比對(duì)（圖6），本研究鑒定的鹽脅迫相關(guān)西伯利亞白刺CIPK基因N端均包含有AMPKA激活結(jié)構(gòu)域，C端存在NAF特征結(jié)構(gòu)域，為典型CIPK家族成員，且不同基因編碼蛋白在443～462 aa，后續(xù)需通過(guò)構(gòu)建鹽脅迫cDNA文庫(kù)對(duì)這些基因進(jìn)行克隆并具體分析其功能。

3 討" 論

鈣離子調(diào)控途徑作為一種應(yīng)對(duì)脅迫的重要反饋機(jī)制，在植物響應(yīng)各種脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。作為典型稀鹽鹽生植物，西比利亞白刺對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制的解析無(wú)疑為鹽生植物的耐鹽途徑研究提供重要參考。國(guó)家林業(yè)和草原局鹽堿地中心耐鹽堿植物育種團(tuán)隊(duì)前期基于轉(zhuǎn)錄組共鑒定到全長(zhǎng)大約214～262個(gè)氨基酸的CBL基因7個(gè)，與擬南芥（10個(gè)）、水稻（10個(gè)）、玉米（Zea mays，12個(gè)）、植物棉（Gossypiumar soreum，13個(gè)）、雷蒙地棉（Gossypium" raimondii，13個(gè)）、祖先二倍體棉（Gossypium arSoreum，22個(gè)）^[13]、毛果楊（Populus triShoSarpa，10個(gè)）、菠蘿（Ananas somosus，8個(gè)）、葡萄（Vitis vinifera，8個(gè)）、茄子（Solanum melongena L，5個(gè)）、胡楊（10個(gè)）相比，西伯利亞白刺無(wú)論是在個(gè)數(shù)、長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)均與已鑒定的CBL相似，這表明西伯利亞白刺的CBL表達(dá)較為穩(wěn)定，在鹽脅迫或滲透壓脅迫初期甚至是無(wú)脅迫的情況下均有一定的表達(dá)，后續(xù)對(duì)其中NsCBL5進(jìn)行了功能分析，證實(shí)了其確實(shí)參與耐鹽調(diào)節(jié)。本研究中鑒定到8個(gè)西伯利亞白刺CIPK基因，與擬南芥（26個(gè)）、水稻（33個(gè)）^[22]、菠蘿（21個(gè)）^[23]、葡萄（20個(gè)）^[24]、蘋(píng)果（34個(gè)）^[14]、茄子（15個(gè)）^[25]的長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)相似，但個(gè)數(shù)差異明顯，推測(cè)與生物進(jìn)化，mRNA降解或僅獲得轉(zhuǎn)錄功能蛋白有關(guān)，而這些篩選結(jié)果正好說(shuō)明了這些基因?qū)Χ唐邴}脅迫響應(yīng)較強(qiáng)，可能發(fā)揮了重要作用。

研究表明不是所有CBL-CIPK途徑都與耐鹽相關(guān)，如CBL9-CIPK1，CBL1-CIPK1均證實(shí)參與干旱脅迫^[26]，CBL9-CIPK3被證實(shí)參與ABA調(diào)控^[27]，CBL9/CBL1與CIPK26被證實(shí)參與ROS途徑^[27]，有意思的是，這些CBL在其他研究中被證明與其他CIPK結(jié)合參與鹽脅迫的調(diào)控，如CBL9-CIPK23結(jié)合參與鉀離子通道HAK5的調(diào)節(jié)^[28]。由此可見(jiàn)，CBL的個(gè)數(shù)及表達(dá)量在各個(gè)物種中均較為穩(wěn)定，而CIPK卻表達(dá)差異較大，究其原因是大多數(shù)CBL均參與鹽脅迫，接受不同的鈣信號(hào)后激活相應(yīng)的下游CIPK并對(duì)脅迫進(jìn)行調(diào)控。因此，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方式可以鑒定出一些對(duì)鹽響應(yīng)具有較強(qiáng)響應(yīng)能力的家族基因，代表了基因家族中幾乎全部的鹽脅迫響應(yīng) 基因。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：雖然8個(gè)NsCIPKs蛋白理化性質(zhì)有差異，但均為堿性穩(wěn)定親水蛋白，定位于細(xì)胞核。同時(shí)，鑒定出的家族基因編碼蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)與保守基序分析發(fā)現(xiàn)：8個(gè)NsCIPKs蛋白均NAF蛋白激酶結(jié)構(gòu)域及與AMPK互作的結(jié)構(gòu)域，屬于典型的CIPK家族蛋白，推測(cè)行使的生物學(xué)功能也基本相似。通過(guò)與擬南芥，水稻及其他已驗(yàn)證響應(yīng)鹽脅迫的CIPK蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，西伯利亞白刺均能較好分組，基因功能研究可參考進(jìn)化樹(shù)其同簇他物種成員進(jìn)行作為鹽生植物，西伯利亞白刺能夠在15" g/kg（約256" mmol/L）以上的鹽濃度正常生長(zhǎng)，200 mmol/L鹽脅迫甚至有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，但這個(gè)濃度卻限制了大多數(shù)甜土植物的生長(zhǎng)^{[4，29-30]}，此外，400 mmol/L的鹽濃度被證實(shí)為明顯抑制西伯利亞的生長(zhǎng)^[13]，采用這兩個(gè)濃度作為脅迫濃度可更好的對(duì)比不同鹽處理下8個(gè)NsCIPKs成員表達(dá)情況。通過(guò)對(duì)200 mmol/L與400 mmol/L鹽處理下西伯利亞白刺的8個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示：鑒定的西伯利亞白刺CIPK基因在不同的時(shí)間及脅迫下表達(dá)量差異明顯，主要在根與莖中表達(dá)，且大多數(shù)對(duì)高鹽脅迫更為敏感，這與植物在不同時(shí)間及不同鹽濃度需要響應(yīng)的不同脅迫相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明在西伯利亞白刺鹽脅迫響應(yīng)中，NsCIPKs家族基因發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，且該家族對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)是復(fù)雜的，具有組織特異性。

在不同物種鑒定的CIPK中，擬南芥^[31]、胡楊^[32]及番茄的" CIPK24^[33]，蘋(píng)果中的" MdCIPK24 NsCIPK1與 NsCIPK7，莖部為 NsCIPK3、 NsCIPK7與 NsCIPK8，葉中為 NsCIPK3，4個(gè)基因編碼蛋白長(zhǎng)度相似。后續(xù)可通過(guò)對(duì)篩選出的4個(gè)基因進(jìn)行克隆與功能分析驗(yàn)證，研究西伯利亞白刺的鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制，進(jìn)一步豐富耐鹽植物新品種基因庫(kù)。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ SINGH A.Soil salinization management for sustainable development： A review[J].Journal of Environmental Management，2021，277：111383.

[2]QADIR M，QUILLROU E，NANGIA V，et al.Economics of salt-induced land degradation and restoration[J].Natural Resources Forum，2014，38（4）：282-295.

[3]KOSTER P，WALLRAD L，EDEL K H，et al.The battle of two ions： Ca²⁺ signalling against Na⁺ stress[J].Plant Biology，2019，21（1）：39-48.

[4]MENG X，ZHOU J，SUI N.Mechanisms of salt tolerance in halophytes： current understanding and recent advances[J].Open Life Sciences，2018，13（1）： 149-154.

[5]ZHU J.Salt and drought stress signal transduction in plants[J].Annual Review of Plant Biology，2002，53：247-273.

[6]DEMIDCHIK V，SHABALA S，ISAYENKOV S，et al.Calcium transport across plant membranes： mechanisms and functions[J].New Phytologist，2018，220（1）：49-69.

[7]LIN H，YANG Y，QUAN R，et al.Phosphorylation of SOS3-LIKE CALCIUM BINDING PROTEIN8 by SOS2 protein kinase stabilizes their protein complex and regulates salt tolerance in" Arabidopsis[J].Plant Cell，2009，21（5）：1607-1619.

[8]SANDERS D，BROWNLEE C，HARPER J F.Communicating with calcium[J].Plant Cell， 1999，11（4）：691-706.

[9]MAHAJAN S，PANDEY G K，TUTEJA N.Calcium- and salt-stress signaling in plants： shedding light on SOS pathway[J].Archives of Biochemistry and Biophysics， 2008，471（2）：146-158.

[10] TANG R J，WANG C，LI K，et al.The CBL-CIPK calcium signaling network： unified paradigm from 20 years of discoveries[J].Trends Plant Science，2020，25（6）：604-617.

[11]MAHAJAN S，SOPORY S K，TUTEJA N.CBL-CIPK paradigm： role in calcium and stress signaling in plants[J].Proceedings of the Indian National Science Academy June，2006，72：63-78.

[12]KOLUKISAOGLU U，WEINL S，BLAZEVIC D，et al.Calcium sensors and their interacting protein kinases： genomics of the Arabidopsis and rice CBL-CIPK signaling networks[J].Plant Physiol，2004，134（1）： 43-58.

[13]LU T，ZHANG G，SUN L，et al.Genome-wide identification of CBL family and expression analysis of CBLs in response to potassium deficiency in cotton[J].PeerJ，2017，5：e3653.

[14]NIU L，DONG B，SONG Z，et al.Genome-wide" identification and characterization of CIPK family and analysis responses to various stresses in apple （Malus domestica）[J].International Journal of Molecular Sciences，2018，19（7）： 21-31.

[15]ZHANG H，LIU Z，HU A，et al.Full-length transcriptome analysis of the halophyte Nitraria sibirica Pall[J].Genes （Basel），2022，13（4）：661.

[16]XIAO J，JIN X，JIA X，et al.Transcriptome-based discovery of pathways and genes related to resistance against Fusarium head blight in wheat landrace Wangshuibai[J].BMC Genomics，2013，14：197.

[17]JIANG S，ZHENG X，LI L.De novo assembly of Auricularia polytricha transcriptome and discovery of genes involved in the degradation of lignocellulose[J].Biotechnology and Applied Biochemistry，2021，68（5）：983-991.

[18]SISI C，JIERU D，PEIDONG C，et al.Transcriptome-wide identification of walnut PP2C family genes in response to external stimulus[J].BMC Genomics，2022，23（1）：640.

[19]WANG M，HONG W，WANG Y，et al.Identification，characterization and expression analysis of wheat RSH family genes under abiotic stress[J].Frontiers in Plant Science，2023，14：1283567.

[20]TANG X，ZHANG H，SHABALA S，et al.Tissue tolerance mechanisms conferring salinity tolerance in a halophytic perennial species Nitraria sibirica Pall[J].Tree Physiology，2021，41（7）：1264-1277.

[21]LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using Real-Time Quantitative PCR and the 2^-ΔΔCT method[J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[22]KOLUKISAOGLU ，WEINL S，BLAZEVIC D，et al.Calcium sensors and their interacting protein kinases： genomics of the Arabidopsis and Rice CBL-CIPK signaling networks[J].Plant Physiology（Bethesda），2004， 134（1）：43-58.

[23]ASLAM M，F(xiàn)AKHER B，JAKADA B H，et al.Genome-wide identification and expression profiling of CBL-CIPK gene family in" pineapple （Ananas comosus） and the role of AcCBL1 in abiotic and biotic stress response[J].Biomolecules，2019，9（7）：293.

[24]XI Y，LIU J，DONG C，et al.The CBL and CIPK gene family in grapevine （ Vitis vinifera ）： genome-wide analysis and expression profiles in response to various abiotic stresses[J].Frontiers in Plant Science，2017，8：978.

[25]LI J，JIANG M M，REN L，et al.Identification and characterization of CBL and CIPK gene families in eggplant （Solanum melongena" L.）[J].Mol Genet Genomics，2016， 291（4）：1769-178.

[26]LI R，ZHANG J，WEI J，et al.Functions and mechanisms of the CBL-CIPK signaling system in plant response to abiotic stress[J].Progress in Natural Science，2009， 19（6）：667-676.

[27]PANDEY G K，GRANT J J，CHEONG Y H，et al.Calcineurin-B-Like protein CBL9 interacts with target kinase CIPK3 in the regulation of ABA response in seed germination[J].Molecular Plant，2008，1（2）：238-248.

[28]RAGEL P，RDENAS R，GARCA-MARTN E，et al.The CBL-interacting protein kinase CIPK23 regulates HAK5-mediated high-affinity K⁺ uptake in Arabidopsis roots[J].Plant" Physiology （Bethesda），2015，169（4）：2863-2873.

[29]FLOWERS T J，MUNNS R，COLMER T D.Sodium chloride toxicity and the cellular basis of salt tolerance in halophytes[J].Annals of Botany，2015，115（3）：419-431.

[30]FLOWERS T J，GALAL H K，BROMHAM L.Evolution of halophytes： multiple origins of salt tolerance in land plants[J].Functional Plant Biology，2010，37（7）：604-612.

[31]STEINHORST L，HE G，MOORE L K，et al.A Ca²⁺-sensor switch for tolerance to elevated salt stress in Arabidopsis[J].Developmental Cell，2022，57（17）：2081-2094.

[32]ZHANG H，L F，HAN X，et al.The calcium sensor PeCBL1，interacting with PeCIPK24/25 and PeCIPK26，regulates Na⁺/K⁺ homeostasis in Populus euphratica[J].Plant Cell Reports，2013，32（5）：611-621.

[33]CHO J H，SIM S C，KIM K N.Calcium sensor SlCBL4 associates with SlCIPK24 protein kinase and mediates salt tolerance in Solanum lycopersicum[J].Plants （Basel），2021，10（10）：2173.

[34]HU D G，MA Q J，SUN C H，et al.Overexpression of MdSOS2L1，a CIPK protein kinase，increases the antioxidant metabolites to enhance salt tolerance in apple and tomato[J].Physiologia Plantarum，2016，156（2）：201-214.

Identification and" Expression Level Analysis of Nitraria sibirica NsCIPKs in Response to Salt Stress

HUANG Anying^{1，2，3}，YAN Qing^{1，2，4}，YANG Xiuyan^1，2，ZHANG Huilong^1，2" and ZHANG Huaxin^1，2

（1.The Comprehensive Experimental Center of Chinese Academy of Forestry in Yellow River Delta，Dongying Shandong 257500，China; 2.Institute of Ecological Conservation and Restoration，Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091，China;

3.Research Institute of Fast-growing Trees，Chinese Academy of Forestry，Zhanjiang Guangdong 524300，China;

4.Zhanjiang Experimental Station，Chinese Academy of" Tropical Agricultural" Sciences，Zhanjiang" Guangdong 524013，China）

Abstract Ca²⁺，as a universal second messenger，can quickly transform external stress into signal transduction within cells.The CBL interacting" protein" kinase （CIPKs） represent a pivotal component in this calcium signaling pathway.The transcriptome of Nitraria sibirica" treated with salt stress was used to identify the members of NsCIPKs family in response to salt stress，and verify the expression levels using the real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） method. The results showed the presence of eight NsCIPK genes responsive to salt stress，encoding basic hydrophilic proteins located in the nucleus. Despite differences in their physicochemical properties，these genes displayed conserved structures.Phylogenetic tree analysis classified the eight NsCIPKs into four groups across six subfamilies，indicating that the differentiation of NsCIPKs occurred after the differentiation of monocotyledonous and dicotyledonous plants. Tissue-specific expression analysis indicated a preference for roots and stems under salt stress. NsCIPK1 and" NsCIPK7 exhibited high expression levels in roots，indicating a prolonged and rapid response to salt stress， in contrast， NsCIPK3， NsCIPK7，and NsCIPK8 were predominant in stems，while" NsCIPK3 showed preferential expression in leaves. This study provides theoretical and practical references for exploration of genes in Nitraria sibirica.

Key words Salt stress; CIPK; Nitraria sibirica; Expression analysis

Received" 2024-01-04""" Returned 2024-02-06

Foundation item Special Fund for Scholars" of the Yellow River Delta（No.2020）; the National Natural Science Foundation of China（No. 31770640）.

First author HUANG" Anying，female，master，assistant research fellow.Research area：forest genetic breeding，genetic foundation and functional gene. E-mail： 2319486242@qq.com

Corresponding"" author ZHANG" Huaxin，male，Ph.D，research fellow.Research area：breeding of saline-alkali tolerant plants and biological treatment of saline-alkali land.E-mail：zhanghx1998@126.com

（責(zé)任編輯：史亞歌 Responsible editor：SHI Yage）

基金項(xiàng)目：黃河三角洲學(xué)者專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（2020）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31770640）。

第一作者：黃安瀛，女，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)榱帜具z傳育種、遺傳基礎(chǔ)與功能基因研究。E-mail：2319486242@qq.com

通信作者：張華新，男，博士，研究員，研究方向?yàn)槟望}堿植物選育與鹽堿地生物治理。E-mail：zhanghx1998@126.com