新疆野蘋果種子 MsWRKY33基因的克隆、亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析

摘 要 WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠通過調(diào)節(jié)種子休眠和發(fā)芽來適當(dāng)介導(dǎo)生命周期的啟動(dòng)。為探究新疆野蘋果種子 WRKY33轉(zhuǎn)錄因子在低溫層積中的作用機(jī)理，通過對(duì)新疆野蘋果[Malus sieversii （Ledeb.） M.Roem.]種子 "MsWRKY33進(jìn)行克隆，生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位及不同低溫層積時(shí)期種子的基因表達(dá)量水平檢測(cè)，初步揭示 "MsWRKY33基因在新疆野蘋果種子低溫層積下的功能。采用沙藏法進(jìn)行低溫（4 ℃）層積處理，常規(guī)保存（室溫）種子作為對(duì)照，以0 d、30 d、60 d、90 d處理的新疆野蘋果種子種胚為研究材料，提取種胚RNA，利用同源重組的方法克隆 "MsWRKY33，測(cè)序后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。并構(gòu)建表達(dá)載體，進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。最后通過實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR）分析新疆野蘋果種子在不同低溫層積時(shí)期 "MsWRKY33的表達(dá)水平。結(jié)果表明， "MsWRKY33全長CDS序列為1 560 bp，編碼520個(gè)氨基酸。保守結(jié)構(gòu)域表明， "MsWRKY33為GroupⅠ家族WRKY轉(zhuǎn)錄因子成員；序列相似性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示：新疆野蘋果MsWRKY33與NP_001281056.1（栽培蘋果Malus domestica）、XP_050143309.1（歐洲野蘋果Malus sylvestris）序列相似性度極高，親緣關(guān)系最近；亞細(xì)胞定位分析顯示MsWRKY33定位在細(xì)胞核中；不同低溫層積時(shí)期qRT-PCR表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)， "MsWRKY33基因在低溫層積60 d時(shí)表達(dá)水平最高，顯著高于未層積時(shí)表達(dá)量。由此說明，新疆野蘋果種子基因 "MsWRKY33在低溫層積過程對(duì)解除種子休眠具有調(diào)控功能。

關(guān)鍵詞 新疆野蘋果；種子； "MsWRKY33；亞細(xì)胞定位；表達(dá)分析

新疆野蘋果[Malus sieversii（Ledeb.）Roem]．屬薔薇科（Rosaceae" Juss.），蘋果屬（Malus Mill.），是中亞天山山脈的第三紀(jì)孑遺樹種^[1] ，為現(xiàn)代栽培蘋果（Malus domestica）的起源種，種內(nèi)變異豐富，在種質(zhì)資源保存及遺傳發(fā)育研究中有著不可替代的作用，現(xiàn)已被列為中國的優(yōu)先保護(hù)物種^[2-4]。但由于病蟲害及人類活動(dòng)的干擾，種群繁衍受到嚴(yán)重影響，目前分布面積已不足5 000 hm²，已于1991年在《中國植物紅皮書》中被列為中國瀕危二級(jí)保護(hù)植物^[5-6]。

新疆野蘋果種群更新繁育方式為實(shí)生和根蘗繁殖，實(shí)生繁殖方式為主。成熟果實(shí)被動(dòng)物取食后排出、或人為將種子在低溫下層積，于來年春季萌發(fā)^[7] 。陳開秀等^[8] 對(duì)新疆野蘋果層積的種子研究發(fā)現(xiàn)種子休眠的原因是生理后熟；或是種皮包被導(dǎo)致空氣透性不良。而低溫層積處理能夠有效地軟化種皮，增加種子透性，能夠促進(jìn)完成生理變化和后熟過程，降低內(nèi)源抑制物，增強(qiáng)新陳代謝活動(dòng)，將貯藏物質(zhì)轉(zhuǎn)換為簡(jiǎn)單化合物使胚胎更易吸收，有利于誘導(dǎo)種子解除休眠^[9] ，是目前新疆野蘋果種子休眠解除最常用且最有效的方法。

WRKY家族是一類廣泛分布于植物中的轉(zhuǎn)錄因子，通過與其他轉(zhuǎn)錄因子的自主和交叉調(diào)控，在植物的生長、發(fā)育和逆境信號(hào)傳導(dǎo)等過程中發(fā)揮作用^[10] ，能夠幫助植物抵御不利條件，在作物育種中具有廣泛的應(yīng)用前景。如 ClWRKY20的表達(dá)量因鹽、干旱和植物激素（ABA、ET和SA）處理而升高，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過表達(dá) ClWRKY20提高了在低溫、鹽和種子萌發(fā)過程中對(duì)ABA的敏感性^[11] 。種子休眠作為決定種子性能的重要農(nóng)藝性狀，其潛在的分子機(jī)制仍不完全清楚。在擬南芥中，Ⅰ型 AtWRKY TF識(shí)別的兩個(gè)W box能夠激活 AtFUS3表達(dá)^[12] ，從而結(jié)合AtFUS3啟動(dòng)子并正調(diào)控該休眠相關(guān)基因的表達(dá)。種子中 AtWRKY41的沉默會(huì)導(dǎo)致種子初級(jí)休眠減少，并下調(diào)成熟和吸水種子中AtABI3的轉(zhuǎn)錄。并且 AtWRKY41能夠直接結(jié)合AtABI3啟動(dòng)子中3個(gè)相鄰的W box以正向調(diào)節(jié)表達(dá)^[13] 。在水稻中， "OsWRKY29是休眠的負(fù)調(diào)控因子。在不存在ABA的情況下， "OsWRKY29結(jié)合水稻ABA響應(yīng)基因VIVIPAROUAl（OsVPl）和脫落酸響應(yīng)元件結(jié)合因子1（OsABFl）的啟動(dòng)子以下調(diào)其表達(dá)。但ABA的存在會(huì)抑制 "OsWRKY29的表達(dá)，使OsVPl和OsABFl轉(zhuǎn)錄增加，最終導(dǎo)致ABA響應(yīng)增強(qiáng)和種子休眠增加^[14] 。此外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子的不同類群在不同植物中的分布也存在差異，如擬南芥和水稻中GroupI的WRKY蛋白豐度高于草莓^[15] 。同樣，楊樹基因組中50%的WRKY轉(zhuǎn)錄因子屬于Group Ⅰ，桑樹中Group Ⅰ成員僅構(gòu)成Group Ia亞組^[16] 。在所有Ia組成員和IIb組家族中一個(gè)成員的C末端都發(fā)現(xiàn)了一個(gè)明顯的GGDFDDNEPEAKR-WKGE基序^[17] 。谷彥冰等^[18] 發(fā)現(xiàn)蘋果（Malus domestica）基因組中有132個(gè)WRKY基因，其中Ⅰ類成員24個(gè)，Ⅱ類成員79個(gè)和Ⅲ類成員29個(gè)。蘋果中WRKY基因家族保守性較高，大部分都具有WRKYGQK七肽序列和鋅指結(jié)構(gòu)。其在各個(gè)部位中均能表達(dá)有12個(gè)MdWRKY基因，并且表達(dá)模式不同。

目前，新疆野蘋果基因研究主要集中在抗逆性以及抗病性^[19-21]，而種子的休眠及萌發(fā)過程中分子調(diào)控機(jī)理研究相對(duì)較少。筆者課題組前期利用RNA Seq測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)新疆野蘋果種子在低溫層積處理下不同時(shí)期與正常儲(chǔ)存（常溫）的總體差異，對(duì)其測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示， "MsWRKY33在低溫層積過程中差異表達(dá)，可能參與調(diào)控新疆野蘋果種子休眠。因此，本研究從新疆野蘋果種胚中克隆 "MsWRKY33，并對(duì)其理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、亞細(xì)胞定位以及在低溫層積的不同時(shí)期的表達(dá)水平進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能及其分子調(diào)控休眠機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以塔城額敏縣新疆野蘋果林的當(dāng)年野生蘋果種子為試驗(yàn)材料，于2022年10月采集。挑選顆粒飽滿、大小均勻、無機(jī)械損傷、無病蟲害的種子作試驗(yàn)。樣品采用低溫層積沙藏法，將濕沙與種子按3∶1均勻混合，容器底部鋪一層濕沙，裝入種子后其上再覆一層濕沙置于容器內(nèi)4 ℃處理。層積時(shí)間分別為0 d、30 d、60 d、90 d，層積完成后，液氮速凍后于-80" ℃保存。同時(shí)以常規(guī)保存（室溫）種子作為對(duì)照。

1.2 方" 法

1.2.1 MsWRKY33全長CDS序列克隆與基因載體構(gòu)建

根據(jù)新疆野蘋果的同屬物種栽培蘋果（Malus domestica）基因組 "MdWRKY33的參照CDS序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增目標(biāo)基因的特異引物WRKY33F和WRKY33R（表1）。利用NovoRec^{[HT5”SS]○[KG-*3/4][HT6”SS]R}[HT]" PCR一步定向克隆試劑盒（近岸蛋白Novoprotein），用同源重組的方法，PCR產(chǎn)物一步定向克隆，完成目的片段與載體無縫連接。以新疆野蘋果種子cDNA為模板，通過PCR的方法克隆目的基因。制備1%瓊脂糖凝膠，回收目的片段。用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒CAM-EGFP，酶切后，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)，切取載體大片段對(duì)應(yīng)條帶的凝膠，試劑盒（百泰克膠回收試劑盒）回收酶切產(chǎn)物；構(gòu)建出融合表達(dá)載體pART-CAM-MsWRKY33-EGFP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR檢測(cè)后，挑選3個(gè)單克隆菌株進(jìn)行測(cè)序得到 "MsWRKY33序列。

1.2.2 MsWRKY33生物信息學(xué)分析

使用NCBI網(wǎng)站里的ORF finder軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對(duì)克隆的序列預(yù)測(cè)開放閱讀框（ORF）。利用NCBI在線軟件Conserved Domain Search Service分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域。利用Ex PASy-Prot Prama tool在線軟件（http：//web.expasy.org/prot param/）進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析;利用Expasy中的Prot Salec在線軟件（http：//web.expasy.org/protscale/）分析親水性和疏水性;利用TMHM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）軟件在線預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)，通過SignalP-5.0Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）軟件在線預(yù)測(cè)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。通過Plant-mPLoc Server（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。用MEGA7.0.21軟件，通過最大似然法（ML）構(gòu)建MsWRKY33蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，Boot strap值取1 000次。

1.2.3 亞細(xì)胞定位

將構(gòu)建出的融合表達(dá)載體pART-CAM-MsWRKY33-EGFP導(dǎo)入農(nóng)桿菌。利用注射法，將測(cè)序結(jié)果正確的陽性克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌（GV3101）。將農(nóng)桿菌菌液注射到3～4周齡本氏煙草倒三葉和倒四葉兩葉脈之間，葉片噴水，黑暗放置過夜，弱光培養(yǎng)2～3 d后，切取侵染區(qū)域，撕表皮制片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 MsWRKY33在不同低溫層積時(shí)期的表達(dá)量

分別在低溫層積處理0 d、30 d、60 d、90 d取種胚樣品，每個(gè)時(shí)期3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，液氮冷凍，-80 ℃下儲(chǔ)存，備用。設(shè)計(jì) "MsWRKY33的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物 "MsWRKY33F2和 "MsWRKY33R2（表1）。利用SYBR" Premix Ex TaqTM II試劑盒（TAKARA），以不同低溫層積時(shí)期種子cDNA為模板，b-actin為內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量分析，檢測(cè) "MsWRKY33在新疆野蘋果種子不同低溫層積時(shí)期的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsWRKY33基因的克隆和序列分析

利用基因特異引物，以新疆野蘋果種子cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增測(cè)序到一條約1 600 bp的條帶，與預(yù)期條帶大小相似（圖1）。對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用NCBI網(wǎng)站中ORFFinder 在線工具分析該序列開放閱讀框，發(fā)現(xiàn)該基因序列開放閱讀框長為1 560 bp，可編碼520個(gè)氨基酸。利用NCBI在線軟件分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)新疆野蘋果MsWRKY33蛋白具有2個(gè)植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的典型保守區(qū)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)儆赪RKY超基因家族（superfamily）。

2.2 MsWRKY33蛋白的理化性質(zhì)分析及二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì)新疆野蘋果MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)特征分析結(jié)果如表2所示。此外， MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子所編碼蛋白的分子式為C₂₄₉₀H₃₈₄₀N₇₂₄O₈₃₆S₁₂，為疏水性蛋白。不存在信號(hào)肽，N端、C端均在膜外，無跨膜結(jié)構(gòu)，其亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)定位在細(xì)胞核中。

利用在線網(wǎng)站（https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）預(yù)測(cè)MsWRKY33蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)主要由4種二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，即隨機(jī)卷曲（random coil）占79.04%；延伸鏈（extended strand）占9.42%；α-螺旋（Alpha helix）占8.65%；β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）占 2.88%。此外，利用SWISS-MODEL對(duì)MsWRKY33蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，MsWRKY33蛋白主要由2個(gè)α-螺旋元件和2個(gè)無規(guī)則卷曲元件組成（圖2）。

2.3 不同物種WRKY33蛋白序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為解析MsWRKY33蛋白在植物系統(tǒng)進(jìn)化中的關(guān)系，本研究通過NCBI網(wǎng)站利用blastp工具將MsWRKY33蛋白氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源比對(duì)，獲取了16條與MsWRKY33蛋白同源性較高的蛋白序列（identity＞60%），其他物種蛋白序列為NP_001281056.1（栽培蘋果Malus domestica）、XP_050143309.1（歐洲野蘋果Malus sylvestris）、XP_048431322.1（白梨Pyrus xbretschneideri）、XP_008244800.1（梅Prunus mume）、XP_034218478.1（扁桃Prunus dulcis）、XP_021826437.1（歐洲甜櫻桃Prunus avium）、XP_007205027.1（桃Prunus persica）、XP_024187793.1（月季Rosa chinensis）、XP_004302557.1（野草莓Fragaria vesca subsp.vesca）、XP_021290063.1（長蒴黃麻Herrania umbratica）、XP_015897665.2（棗樹Ziziphus jujuba var.spinosa）、XP_017977471.1（可可樹Theobroma cacao）、XP_023923894.1（西班牙栓皮櫟Quercus suber）、XP_010093567.2（川桑Morus notabilis）、XP_021638156.1（橡膠樹Hevea brasiliensis）。序列比對(duì)結(jié)果（圖3）顯示：MsWRKY33蛋白與NP_001281064.1（栽培蘋果Malus domestica）、XP_050120190.1（歐洲野蘋果Malus sylvestris）蛋白長度相同，序列相似性高達(dá)98%，與薔薇科序列相似度均在50%以上。蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化分析并構(gòu)建進(jìn)化樹（圖4），結(jié)果顯示W(wǎng)RKY33被大致分為3組，新疆野蘋果MsWRKY33與NP_001281056.1（栽培蘋果Malus domestica）、XP_050143309.1（歐洲野蘋果Malus sylvestris）親緣關(guān)系最近。

2.4 MsWRKY33蛋白亞細(xì)胞定位分析

Plant-mPLoc Server在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：MsWRKY33定位于細(xì)胞核。為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果，構(gòu)建了pART-CAM-MsWRKY33-EGFP載體。將pART-CAM-MsWRKY33-EGFP和pART-CAM-EGFP空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101注射到煙草葉片中。鏡檢亞細(xì)胞定位結(jié)果如圖5所示。pART-CAM-MsWRKY33-EGFP只在煙草葉肉細(xì)胞的細(xì)胞核觀察到綠色熒光，表明MsWRKY33蛋白亞細(xì)胞定位在植物的細(xì)胞核中，與在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.5 MsWRKY33基因的表達(dá)分析

通過對(duì)不同低溫層積時(shí)期與未層積的新疆野蘋果 "MsWRKY33熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)錄因子隨著低溫層積時(shí)間增加表達(dá)量呈先降低后增高再降低趨勢(shì)。第60天達(dá)到最高，約為未層積表達(dá)量的兩倍（圖6），而未層積種子的表達(dá)量隨時(shí)間增加無明顯變化。綜上，從基因表達(dá)層面上說明 "MsWRKY33可能參與低溫層積過程中新疆野蘋果種子解除休眠的調(diào)控。

3 討" 論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過與調(diào)控基因表達(dá)的 W-box（TTGAC（C/T））精確結(jié)合，作為關(guān)鍵的調(diào)控蛋白發(fā)揮作用^[22] ，但低溫層積下種子解除休眠的調(diào)控機(jī)制尚未明確。本研究以新疆野蘋果種子為試驗(yàn)材料，克隆得到 "MsWRKY33基因序列，其生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示該基因完整開放閱讀框（ORF）大小為1 560 bp，編碼520個(gè)氨基酸，含有2個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域?qū)儆贕roupⅠ，多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與歐洲野蘋果、栽培蘋果、白梨等物種中WRKY保守結(jié)構(gòu)域一致。對(duì)MsWRKY33進(jìn)行序列分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示MsWRKY33蛋白與栽培蘋果與歐洲野蘋果親緣關(guān)系最近。

各WRKY基因的編碼序列，同源WRKY基因相似性最高，可能在不同的非生物脅迫和物種中具有不同的作用。 WRKY33在WRKY結(jié)構(gòu)域的C端與Sigma因子互作蛋白1 （ Sigma Factor-Interacting Protein1，SIB1 ）和SIB2等多個(gè)VQ蛋白互作時(shí)，擬南芥表現(xiàn)出對(duì)多種非生物脅迫的耐受性。這種相互作用可以誘導(dǎo) "AtWRKY33的DNA結(jié)合活性^[23] 。在棉花中， "GhWRKY33定位于細(xì)胞核，作為負(fù)調(diào)控因子介導(dǎo)干旱脅迫響應(yīng)，并參與ABA信號(hào)通路。過表達(dá) GhWRKY33的擬南芥在干旱脅迫下較野生型，失水快、更易枯萎，在ABA處理下表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性 ^[24-25]；在小麥葉肉原生質(zhì)體中， "TaWRKY33（Ⅱ組）定位于細(xì)胞核中。 "TaWRKY33基因的啟動(dòng)子區(qū)域，檢測(cè)到多個(gè)非生物順式作用元件。 "TaWRKY33基因?qū)BA、茉莉酸甲酯、高溫和低溫均表現(xiàn)出較高的響應(yīng)。在擬南芥轉(zhuǎn)基因株系中，過表達(dá)的 TaWRKY33基因與激活下游多種脅迫相關(guān)基因有關(guān)，在各種脅迫條件下的萌發(fā)率更高^[26] 。此外，MAPK級(jí)聯(lián)路徑可以將外界信號(hào)傳遞到細(xì)胞核中，而WRKY轉(zhuǎn)錄因子存在于細(xì)胞核中，可以與相應(yīng)的基因結(jié)合并調(diào)控其表達(dá)。MPK3/MPK6在不同的生物學(xué)過程中磷酸化不同的WRKY同源蛋白。在擬南芥中MPK3/MPK6通過磷酸化 "AtWRKY33來增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄激活活性，誘導(dǎo)camalexin的生物合成，而異源基因表達(dá)加快了擬南芥種子的萌發(fā) ^[27-28]。本研究中MsWRKY33定位于細(xì)胞核，與前人研究結(jié)果一致，表明其亞細(xì)胞定位相對(duì)保守。 "MsWRKY33在低溫層積60 d時(shí)表達(dá)水平最高，顯著高于未層積時(shí)表達(dá)量，與課題組前期研究解除休眠萌發(fā)時(shí)間相似^[29] ，明確了 "MsWRKY33在解除種子休眠的過程中具有一定的調(diào)控功能。由此推測(cè) "MsWRKY33可能參與同一細(xì)胞中不同生物學(xué)過程的2種底物，它們的上游MAPK級(jí)聯(lián)在響應(yīng)其中一種刺激時(shí)被激活，2種不同底物的磷酸化導(dǎo)致了2種反應(yīng)的激活。其次，由于復(fù)合物的形成或亞細(xì)胞定位，只有一種底物被激活，從而產(chǎn)生特定的反應(yīng)。為明確其功能表達(dá)的差異性，需要進(jìn)一步分析及深入研究。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ 閻國榮，許 正.中國新疆野生果樹研究[M].北京：中國林業(yè)出版社，2010：108-109.

YAN G R，XU ZH.Study on Wild Fruit" Trees in Xinjiang，China[M].Beijing：China Forestry Publishing House，2010：108-109.

[2]羊海軍，崔大方，許 正，等.中國天山野果林種子植物組成及資源狀況分析[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2003，12（2）：39-45.

YANG H J，CUI D F，XU ZH.Analysis on the components and resource situation of seed plants in the wild fruit forest in Tianshan Mountain in China.[J]Journal of Plant Resources and Environmen，2003，12（2）：39-45.

[3]VOLK G M，HENK A D，RICHARDS C M，et al.Malus sieversii：A diverse central asian apple species in the USDA-ARS" national" plant germplasm system[J].Horticulture" Science，2013，48（12）：1440-1444.

[4]李飛飛，崔大方，廖文波，等.中國新疆野蘋果[Malus sieversii （Ldb.）Roem.]種群地理分布格局及其遺傳關(guān)系研究[J].干旱區(qū)地理，2011，34（6）：926-932.

LI F F，CUI D F，LIAO W B，et al.Geographic distribution pattern and genetic relationship of Malus sieversii（Ldb.） Roem. in China[J]Arid Land Geography，2011，34（6）：926-932.

[5]劉 華，臧潤國，丁 易，等.天山西部新疆野蘋果種群特征[J].林業(yè)科學(xué)，2010，46（11）：1-7.

LIU H，ZANG R G，DING Y，et al.Population characteristics of" Malus sieversii in the west" part of Tianshan Mountains，Xinjiang[J].Scientia Silvae Sinicae，2010， 46（11）：1-7.

[6]傅立國.中國植物紅皮書[M].北京：科學(xué)出版社，1992：36-40.

FU L G.China Plant Red Data Book[M].Beijing：Science Press，1992：36-40.

[7]劉 彬.新疆野蘋果（Malus sieversii）生態(tài)調(diào)查及生長發(fā)育的生物學(xué)基礎(chǔ)研究[D].天津：天津農(nóng)學(xué)院，2016.

LIU B.Ecological survey and growth biologicalbasis in" Malus sieversii[D].Tianjin：Tianjin Agricultural University，2016.

[8]陳開秀，周君英，肖東玉，等.野蘋果種子休眠原因的研究[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1988，23（1）：18-24.

CHEN K X，ZHOU J Y，XIAO D Y，et al.Study on dormacy casues in seed of wild apple[J].Journal of Xinjiang Agricultural University， 1988，23（1）：18-24.

[9]CHEN S Y，CHOU S H，TSAI C C，et al.Effects of moist cold stratification on germination，plant growth regulators，metabolites and embryo ultrastructure in seeds of Acer morrisonense （Sapindaceae）[J].Plant Physiology and Biochemistry， 2015，94：165-173.

[10] BAKSHI M，OELMLLER R.WRKY transcription factors：Jack of many trades in plants[J].Plant Signaling amp; Behavior，2014，9（2）：e27700.

[11]ZHU L，LI S，OUYANG M，et al.Overexpression of watermelon ClWRKY20 in transgenic Arabidopsis improves salt and low-temperature tolerance[J].Scientia Horticulturae，2022，295：110848.

[12]ROSCOE T J，VAISSAYRE V，PASZKIEWICZ G，et al.Regulation of FUSCA3" expression during seed development in Arabidopsis[J].Plant amp; Cell Physiology，2019，60（2）：476-487.

[13]DING Z J，YAN J Y，LI G X，et al. "WRKY41 controls Arabidopsis seed dormancy via direct regulation of ABI3 transcript levels not downstream of ABA[J].The Plant Journal：For Cell and Molecular Biology，2014，79（5）：810-823.

[14]ZHOU C，LIN Q，LAN J，et al.WRKY" transcription" factor"" "OsWRKY29" represses seed dormancy in rice by" weakening" abscisic" acid" response[J].Frontiers in Plant Science，2020，11：691.

[15]ZHOU H，LI Y，ZHANG Q，et al.Genome-wide analysis of the expression of WRKY" family" genes in different" developmental" stages of" wild" strawberry（Fragaria vesca）" fruit[J].PloS One，2016，11（5）：e0154312.

[16]WANI S H，ANAND S，SINGH B，et al.WRKY transcription factors and plant defense responses：latest discoveries and future prospects[J].Plant Cell Reports，2021，40（7）：1071-1085.

[17]BARANWAL V K，NEGI N，KHURANA P.Genome-wide" identification and structural，functional and evolutionary analysis of WRKY components of" mulberry[J].Scientific Reports，2016，6（1）：30794.

[18]谷彥冰，冀志蕊，遲福梅，等.蘋果WRKY基因家族生物信息學(xué)及表達(dá)分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（16）：3221-3238.

GU Y B，JI ZH R，CHI F M，et al，Bioinformatics and expression" analysis of the WRKY" gene" family in" apple[J] Scientia Agricultura Sinica，2015，48（16）：3221-3238.

[19]何晨晨，劉俐君，魯曉燕.基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析NaCl脅迫下新疆野蘋果葉和根糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)[J].果樹學(xué)報(bào)，2020，37（7）：951-961.

HE CH CH，LIU L J，LU X Y.Analysis of genes related to glycolysis in the leaves and roots of" Malus sieversii under NaCl stress based on transcriptome sequencing[J] Journal of Fruit Science， 2020，37（7）：951-961.

[20]馬紅喜，劉俐君，蘇永峰，等.基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選新疆野蘋果組培苗應(yīng)答凍害光合特性相關(guān)基因[J].果樹學(xué)報(bào)，2022，39（9）：1529-1539.

MA H X，LIU L J，SU Y F.Screening of freezing stress-responsive genes related to photosynthesis in" in vitro" seedlings of Malus sieversii via RNA-seq.[J] Journal of Fruit Science，2022，39（9）：1529-1539.

[21]JIA S，LIU X，WEN X，et al.Genome-wide" identification of bHLH transcription factor" family in Malus sieversii and functional exploration of" "MsbHLH155.1" gene under Valsa" canker" infection[J].Plants （Basel，Switzerland），2023，12（3）：620.

[22]CHI Y，YANG Y，ZHOU Y，et al.Protein-protein" interactions in the regulation of WRKY transcription factors[J].Molecular Plant，2013，6（2）：287-300.

[23]LAI Z B，LI Y，WANG F，et al.Arabidopsis sigma factor binding proteins are activators of the "WRKY33 transcription factor in plant defense[J].The Plant Cell，2011， 23（10）：3824-3841.

[24]WANG N N，XU S W，SUN Y L，et al.The cotton WRKY transcription factor （GhWRKY33） reduces transgenic Arabidopsis resistance to drought stress[J].Scientific Reports，2019，9（1）：724.

[25]KHUMAN A ，ARORA S ，MAKKAR H ，et al.Extensive intragenic divergences amongst ancient WRKY transcription factor gene family is largely associated with their functional diversity in plants[J].Plant Gene，2020，22：100222.

[26]HE G H，XU J Y，WANG Y X，et al.Drought-responsive WRKY transcription factor genes TaWRKY1 and TaWRKY33 from wheat confer drought and/or heat resistance in Arabidopsis[J].BMC Plant Biology，2016， 16（1）：116.

[27]LI S，F(xiàn)U Q，CHEN L，et al.Arabidopsis thaliana" WRKY25，WRKY26，and WRKY33" coordinate induction of plant thermotolerance[J].Planta，2011，233（6）：1237-1252.

[28]ZHOU J，WANG X，HE Y，et al.Differential" phosphorylation of the transcription factor WRKY33"" by the" protein" kinases CPK5/CPK6 and MPK3/MPK6" cooperatively" regulates camalexin" biosynthesis in Arabidopsis[J].The Plant Cell，2020，32（8）：2621-2638.

[29]馬 娟，楊巧玲，徐昕潔，等.新疆野蘋果種子低溫層積過程中生理生化指標(biāo)變化趨勢(shì)[J/OL].分子植物育種，2023：1-17.[2023-09-12].https：//kns-cnki-net.webvpn.xjau.edu.cn/kcms/detail/46.1068.S.20230529.1534.034.html

MA J，YANG Q L，XU X J，et al.Variation" trends of" physiological and" biochemical" indices" during" low" temperature" stratification of" seeds of Malus sieversii（Ledeb.）M.Roem[J/OL].Molecular Plant Breeding，2023：1-17.[2023-09-12].https：//kns-cnki-net.webvpn.xjau.edu.cn/kcms/detail/46.1068.S.20230529.1534.034.html

Cloning，Subcellular Localization and Expression Analysis of" "MsWRKY33 Gene in Malus sieversii Seeds

LI Jing，F(xiàn)ANG Zhen and" YE Chunxiu

（College of Forestry and Landscape Architecture，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830000，China）

Abstract WRKY transcription factors mediate the initiation of life cycle by regulating seed dormancy and germination.In order to explore the mechanism of "WRKY33 transcription factor in low temperature stratification of Malus sieversii （Ledeb.） M.Roem seeds，the function of "MsWRKY33 gene in low temperature stratification of Malus sieversii" seeds was preliminarily revealed by cloning "MsWRKY33 of Malus sieversii seeds，bioinformatics analysis，subcellular localization，and detection of gene expression in seeds at different low temperature stratification stages.In this study，the sand storage method was used for low temperature （4" ℃） stratification treatment，and the conventional preservation （room temperature） seeds were used as control.The seed embryos of Malus sieversii seeds treated for 0 day，30 days，60 days and 90 days were used as materials to extract RNA. MsWRKY33 was cloned by homologous recombination and sequenced for bioinformatics analysis.The expression vector was constructed，and subcellular localization was analyzed.The expression vector was constructed and subcellular localization was analyzed.Finally，the expression level of "MsWRKY33 in Malus sieversii seeds at different low temperature stratification periods was analyzed by real-time fluorescence quantification （qRT-PCR）.The results showed that the full-length CDS sequence of "MsWRKY33 was 1 560 bp，encoding 520 amino acids.The conserved domain indicated that ""MsWRKY33 was a member of Group Ⅰ family WRKY transcription factor.The sequence similarity between MsWRKY33 and NP_001281056.1（Malus domestica） and XP_050143309.1（Malus sylvestris） was very high，and the genetic relationship was closest.Subcellular localization analysis showed that" "MsWRKY33" was located in the nucleus.qRT-PCR expression analysis during different low-temperature stratification periods found that the expression level of" "MsWRKY33 was the highest at 60 days of low-temperature stratification，which was significantly higher than that without stratification.The seed gene ""MsWRKY33 of Malus sieversii has a regulatory function in the release of seed dormancy during low temperature stratification.

Key words Malus sieversii; Seeds; "MsWRKY33; Subcellular localization; Expression analysis

Received" 2023-09-14""" Returned 2023-12-26

Foundation item Talent"" Introduction Project of Xinjiang Agricultural University （No.2521GCCRC）.

First author LI" Jing，female，master"" student.Research area：seed dormancy.E-mail：lj190113@163.com

Corresponding"" author YE Chunxiu，female，associate professor，master supervisor.Research area：forest germplasm resources and molecular breeding.E-mail：yecx2008@163.com

（責(zé)任編輯：潘學(xué)燕 Responsible editor：PAN Xueyan）

基金項(xiàng)目：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才引進(jìn)項(xiàng)目（2521GCCRC）。

第一作者：李 靜，女，在讀碩士，從事種子休眠研究。E-mail：lj190113@163.com

通信作者：葉春秀，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事林木種質(zhì)資源與分子育種研究。E-mail：yecx2008@163.com