陸地棉環(huán)核苷酸離子通道蛋白基因 GhCNGC8克隆及初步表達(dá)分析

摘 要 為明確環(huán)核苷酸門控離子通道蛋白基因GhCNCG8對棉花抗逆方面的作用。利用棉花葉片克隆獲得該基因，生物信息學(xué)方法分析其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系，利用qRT-PCR（實(shí)時熒光定量）方法分析基因在黃萎病菌、干旱、鹽脅迫以及激素誘導(dǎo)下GhCNCG8表達(dá)模式和組織表達(dá)特異性；構(gòu)建該基因VIGS沉默載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化該基因到棉花葉片中，熒光定量PCR方法檢測沉默效率。以棉花葉片cDNA為模板成功克隆GhCNGC8基因，該基因開放閱讀框?yàn)? 247 bp，編碼748 個氨基酸。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，陸地棉GhCNGC8基因與擬南芥AtCNGC8基因關(guān)系較近，多序列結(jié)果比對顯示，GhCNGC8蛋白結(jié)構(gòu)符合CNGCs家族蛋白結(jié)構(gòu)特征。qRT-PCR結(jié)果表明，該基因?qū)S萎病、干旱、鹽處理等脅迫及茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）和雙氧水（H₂O₂）處理均有一定程度的響應(yīng)，qRT-PCR分析結(jié)果表明，GhCNGC8基因在根、莖、葉、花、萼片和苞片中均有表達(dá)，葉中表達(dá)量最高。構(gòu)建該基因的VIGS沉默載體轉(zhuǎn)化棉花，qRT-PCR結(jié)果表明，該基因在棉花中已經(jīng)沉默，表達(dá)量相比對照植株降低70%左右，表明GhCNGC8沉默載體構(gòu)建成功并在棉花體內(nèi)正常運(yùn)行，GhCNGC8可能在棉花抗逆方面發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞 棉花；GhCNGC8；基因克??；表達(dá)分析；載體構(gòu)建

環(huán)核苷酸門控離子通道（CNGCs）蛋白廣泛存在于動植物體內(nèi)，是鈣離子傳播途徑之一。鈣離子（Ca²⁺）是一種重要的第二信使，在植物中調(diào)節(jié)多種信號途徑，如激素、病原菌、鹽脅迫、光信號和晝夜節(jié)律。CNGCs是非選擇性陽離子通道蛋白，由2 個或3 個不同類型的亞基形成異四聚體復(fù)合體，由環(huán)核苷酸（cAMP和cGMP）直接結(jié)合打開，并依賴Ca²⁺被鈣調(diào)素和磷酸化所調(diào)節(jié)^[1]。在植物中，CNGC由6 個跨膜（TM）結(jié)構(gòu)域、位于第5和第6跨膜結(jié)構(gòu)域之間的P環(huán)和鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域（CaMBD）以及環(huán)核苷酸結(jié)構(gòu)域（CNBD）構(gòu)成。環(huán)核苷酸（cNMP）是植物體內(nèi)一種重要的第二信使，可以與CNBD相結(jié)合，從而激活CNGCs，促胞外Ca²⁺內(nèi)流；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺過多時，CaM會結(jié)合到CaMBD處，從而鈍化CNGC蛋白活性，抑制胞外Ca²⁺內(nèi)流^[2]。

作為一種陽離子通道蛋白，CNGC蛋白介導(dǎo)鈣離子在細(xì)胞溶質(zhì)中的積累以及將外部光學(xué)和氣味信號轉(zhuǎn)化為生物電信號^[3-4]。在擬南芥中，AtCNGCs 參與了各種生物過程，調(diào)節(jié)生長和發(fā)育的不同方面，以及生物和非生物應(yīng)激反應(yīng)，如根毛尖生長、葉片生長和衰老、花的轉(zhuǎn)變、花粉的極化生長、離子攝取和穩(wěn)態(tài)，以及應(yīng)對病原體和食草動物的攻擊^[5-6]。對低結(jié)實(shí)率的水稻突變體（sss1-D）研究表明， OsCNGC13可以通過促進(jìn)花粉管在花柱組織中的生長來促進(jìn)結(jié)實(shí)率。GhCNGCs基因家族廣泛參與植物抗逆脅迫適應(yīng)過程，在調(diào)節(jié)生物生長發(fā)育和環(huán)境響應(yīng)方面發(fā)揮重要作用^[7]。在水稻中，對一個天然突變體cds1的分離和鑒定表明， OsCNGC9介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)鈣離子升高，正向調(diào)控對稻瘟病的抗性^[8]。在棉花中， GhCNGC1沉默增強(qiáng)了抗黃萎病和耐鹽性， GhCNGC12沉默的植株則降低了對黃萎病和耐鹽性的抗性^[9]。目前對 GhCNGC8在棉花中的抗逆研究較少。病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（Virus-induced gene silencing， VIGS）是近年來發(fā)展迅速且應(yīng)用廣泛的一項(xiàng)RNA沉默技術(shù)^[10]。VIGS技術(shù)不同于傳統(tǒng)的植物基因功能研究方法，因其無需遺傳轉(zhuǎn)化及突變體獲取，又具有操作簡單、成本低、速度快、高通量等優(yōu)勢，已經(jīng)成為開展基因功能研究最常用的技術(shù)手段之一。

棉花在全世界廣泛種植，是天然纖維的主要來源，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。棉花在其生長周期中會遭遇各種生物脅迫和非生物脅迫，對其產(chǎn)量和品質(zhì)造成巨大影響。發(fā)掘棉花抗逆相關(guān)基因并利用轉(zhuǎn)基因手段創(chuàng)制抗性新種質(zhì)對于棉花抗性育種具有重要意義。本研究從棉花葉片中克隆得到GhCNGC8基因，通過熒光定量PCR法分析該基因在棉花受到不同逆境脅迫和激素處理時的表達(dá)模式。同時構(gòu)建該基因的 VIGS 沉默載體并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染棉花獲得沉默植株，為進(jìn)一步驗(yàn)證棉花 GhCNGC8基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為TM-1，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所農(nóng)作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。大腸桿菌菌種DH5α、農(nóng)桿菌菌種GV3101、BP反應(yīng)入門載體、VIGS干涉技術(shù)載體pTRV1和pTRV2等均屬于商品化菌株或載體。質(zhì)粒提取試劑盒、oligo（dT）18、RNAase抑制劑、dNTP、pMD18-T Vector、T4-DNA連接酶、內(nèi)切酶EcoRI和KpnI、ExTaq酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒等均為TaKaRa公司產(chǎn)品，熒光定量PCR試劑盒為TOYOBO公司產(chǎn)品；卡那霉素、慶大霉素、MES、乙酰丁香酮、MgCl₂ 及培養(yǎng)基配制等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 棉花種植及脅迫和激素處理

將TM-1棉花種子水中浸泡24 h后播種于營養(yǎng)土中，12 h光照/12 h黑暗，溫度為26" ℃～28" ℃光照培養(yǎng)。濕度保持在60%及以上，7 d澆1次水，在幼苗兩葉一心時選取長勢及大小一致的棉苗，黃萎病菌脅迫處理參照邵武奎等^[11] 的方法，鹽處理參照李月等^[12]的方法，干旱處理參照王娜等^[13]的方法，激素處理分別用200" μmol/L茉莉酸、2 mmol/L水楊酸、1 mmol/L H₂O₂處理10 min、清水（MOCK）浸泡棉苗根系之后將棉苗繼續(xù)種植于營養(yǎng)缽中。各組處理均在0.5 h、1 h、 3 h等時間點(diǎn)取棉花根系，提取RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行表達(dá)模式分析。

1.2.2 棉花總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成

將液氮內(nèi)收集的各組織在研缽中研磨成粉末，使用北京天根公司的RNAperp Pure Plant Kit提取試劑盒提取RNA，提取步驟參照說明書。RNA 的質(zhì)量和完整性使用 Thermo Scientific（NanoDrop 1000）核酸分析儀和1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。選擇高質(zhì)量的 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用全式金公司Removal and cDNA Synthesis Super Mix試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，具體步驟參照說明書。

1.2.3 陸地棉" GhCNGC8基因的克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)筆者前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用Primer 5軟件設(shè)計特異性引物，以上述棉花葉片cDNA作為模板，使用高保真聚合酶TransStart FastPfu DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：高保真聚合酶1 μL、正向引物1 μL、反向引物 1 μL、Buffer 10 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、cDNA 1 μL 和 dd H₂O 補(bǔ)齊至 50 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95" ℃ 2 min；98" ℃ 20 s，57" ℃ 30 s，72" ℃ 120 s，循環(huán) 35 次；72" ℃ 5 min；4" ℃ 保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1 %凝膠電泳檢測后，回收目的條帶，連接 pEASY-Blunt-Zero 克隆載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將正確陽性質(zhì)粒送至上海生工公司進(jìn)行測序。

GhCNGC8蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測利用網(wǎng)站（http：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行在線程序計算 。蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測分析使用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）在線程序?？缒そY(jié)構(gòu)利用在線軟件TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）進(jìn)行預(yù)測。選取擬南芥AtCNGC8（NP_001323012.1）、陸地棉GhCNGC8（Gh_A05G1012.1）、黃褐棉GmCNGC8（XP_040874262.1）、玉米ZmCNGC8（NP_001152538.2）、小麥TaCNGC8（XP_044377681.1）、水稻OsCNGC8（XP_015612168.1）、海島棉GbCNGC8（KAB2081333.1）、雷蒙德氏棉GrCNGC8（XP_012448061.1）、樹棉GaCNGC8（XP_017605331.1），利用MEGA11和GENE DOC軟件進(jìn)行序列多重比對，利用MAGA11軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并利用Bootstrap對各分支可靠性進(jìn)行檢測。

1.2.4 熒光定量PCR

通過Primer 5軟件設(shè)計 GhCNGC8特異性檢測引物。以cDNA為模板，" UBQ7基因^[14]為內(nèi)參基因，使用ABI Step one 系統(tǒng)，采用北京全式金公司TransScript Green One-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，依據(jù)目的基因和內(nèi)參基因Ct值，利用2^-ΔΔCt 法計算基因的相對表達(dá)量^[15]。目的基因和內(nèi)參基因熒光定量引物見表1。

1.2.5 陸地棉GhCNGC8基因片段克隆和VIGS載體構(gòu)建

載體構(gòu)建參照李名江等^[16]和胡子曜等^[17]進(jìn)行。根據(jù)棉花 GhCNGC8序列，目的基因靶標(biāo)序列利用SGN-VIGS 在線軟件（https：//vigs.solgenomics.net）設(shè)計完成。在其上下游片段5′端分別引入EcoRI 和 KpnI酶切位點(diǎn)，以棉花cDNA片段為模板，擴(kuò)增得到目的片段。將目的片段連接到‘B-Zero’克隆載體上，構(gòu)建重組載體 B-Zero- GhCNGC8，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂板后挑單克隆進(jìn)行菌液PCR，然后進(jìn)行雙酶切鑒定。挑選正確質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測序。提取測序正確的質(zhì)粒和煙草脆裂病毒 pTRV2 空載體質(zhì)粒，雙酶切后回收目的片段和線性化pTRV2質(zhì)粒， 目的片段與線性質(zhì)粒使用T4連接酶進(jìn)行4 ℃過夜連接，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans-T1 感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行酶切驗(yàn)證，提取質(zhì)粒并采用凍融法轉(zhuǎn)入‘GV3101’農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的農(nóng)桿菌擴(kuò)繁并加入70%的甘油，保存于-80 ℃，備用。

1.2.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的VIGS侵染棉花及沉默效率檢測

參照李秀青等^[18]的方法將重組質(zhì)粒TVR2- GhCNGC8、陽性對照TVR2-CLA1和陰性對照（TRV2）與TVR1 按照同濃度按體積1∶1混合侵染棉花葉片，侵染棉花葉片15 d左右，陽性對照TVR2-CLA1出現(xiàn)葉綠素缺失導(dǎo)致的白化表型，拍照記錄。取陰性對照和試驗(yàn)組第二片真葉，每個樣本取3個技術(shù)重復(fù)。提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用熒光定量方法檢測沉默效率，檢測引物見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhCNGC8基因克隆和生物信息學(xué)分析

以陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1的葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小符合預(yù)期（圖1）。經(jīng)測序，結(jié)果與目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄組拼接數(shù)據(jù)一致，表明該目的片段為目標(biāo)基因GhCNGC8（Gh_A05G1012）。表2為棉花" GhCNGC8的生物信息學(xué)分析，從表中可以看出，該基因開放閱讀框?yàn)? 247 bp，編碼748個氨基酸，相對分子質(zhì)量85.93 ku，理論等電點(diǎn)8.95，平均疏水性為負(fù)值，表明該蛋白為堿性親水性蛋白，擁有信號肽的概率為0.002 5，亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白定位在細(xì)胞膜上。由圖2可知， 多重序列比對顯示該蛋白含有6個跨膜（TM）結(jié)構(gòu)域、1個p環(huán)，該蛋白質(zhì)C端含有鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域（CaMBD）、環(huán)核苷酸結(jié)構(gòu)域（CNBD）和CaM結(jié)合位點(diǎn)異亮氨酸-谷氨酸胺IQ，符合CNGCs結(jié)構(gòu)特征。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明（圖3），GhCNGC8蛋白與其他棉花種關(guān)系同源性最高，其次與擬南芥AtCNGC8同源性較高。

[2.2 GhCNGC8基因的表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR技術(shù)檢測 GhCNGC8在不同處理下的表達(dá)模式，結(jié)果表明，GhCNGC8基因?qū)Σ煌{迫處理及激素處理均有應(yīng)答反應(yīng)。從圖4-A可以看出，在黃萎病菌處理下， GhCNGC8表達(dá)量先增加后降低，在2 h處理下最高，極顯著高于對照。在鹽脅迫處理下， GhCNGC8表達(dá)量呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，0.5 h處理最高，顯著高于對照，與0 h相比，0.5 h表達(dá)量增高1.5 倍（圖4-B）。在干旱處理下，GhCNGC8表達(dá)量呈先增高后降低，0.5 h表達(dá)量最高，0 h和24 h表達(dá)量基本一致，低于其他時間（圖4-C）。水楊酸處理下，隨著處理時間延長， GhCNGC8的表達(dá)量顯著增加，與0 h相比，3 h表達(dá)量增加2.5倍（圖4-D）。在茉莉酸處理下，GhCNGC8表達(dá)量有一定程度下降，與0 h相比，GhCNGC8表達(dá)量在3 h下降0.6倍（圖4-E），與對照相比，0.5 h和3 h有顯著性差異。與黃萎病處理相同，H2O2處理下 GhCNGC8表達(dá)量先增加后降低，與0 h相比，1 h表達(dá)量上升4.3倍（圖4-F）。 GhCNGC8在不同組織中的表達(dá)變化表明， GhCNGC8基因在葉、花和苞片中表達(dá)量較高，葉中表達(dá)量最高，根、莖和萼片中處于低水平表達(dá)（圖4-G），表明該基因存在組織表達(dá)特異性。

2.3 GhCNGC8沉默載體構(gòu)建和技術(shù)驗(yàn)證

利用增加酶切位點(diǎn)引物將 GhCNGC8靶序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后表明大小符合預(yù)期（圖5-A），將目標(biāo)序列克隆并測序，結(jié)果與目標(biāo)片段一致。經(jīng)EcoRI和KpnI酶切陽性質(zhì)粒后將目標(biāo)片段連接到VIGS沉默載體中，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，出現(xiàn)兩條目標(biāo)條帶（圖5-B），一條遠(yuǎn)超2 000 bp，另一條約在250左右，結(jié)果符合預(yù)期，說明VIGS載體構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的VIGS載體轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌中。

待棉花第一片真葉未出現(xiàn)之前，將TRV：GhCNGC8、TRV：CLA1、TRV：RNA2與TRV：RNA1相同濃度等體積混合，用注射器注射到棉花子葉中，兩周后觀察棉花表型，發(fā)現(xiàn)新長出的棉花真葉已經(jīng)白化（圖6-A），此時利用qRT-PCR技術(shù)檢測"GhCNGC8在棉花體內(nèi)的表達(dá)量，結(jié)果表明，GhCNGC8的表達(dá)量已經(jīng)遠(yuǎn)低于對照水平（圖6-B）。證明構(gòu)建好的VIGS載體已經(jīng)在棉花體內(nèi)正常運(yùn)行，成功獲得了GhCNGC8沉默植株。

3 討" 論

植物CNGC家族在發(fā)育和應(yīng)對外界非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用，包括冷、熱、干旱、激素、光周期和共生現(xiàn)象^[19]。有關(guān)研究證明CNGC家族是控制細(xì)胞內(nèi)鈣庫進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)外的主要途徑，和多種植物抗逆活動相關(guān)聯(lián)^[20]。前人研究表明，擬南芥CNGC6通過促進(jìn)高溫脅迫下Ca²⁺流入細(xì)胞質(zhì)，中度高溫會提高細(xì)胞質(zhì)中cAMP（cyclic adenosine monophosphate）水平^[21]。沉默棉花 GhCNGC82和 GhCNGC31的表達(dá)減弱了棉花對黃萎病抗性和耐鹽性^[9]。 OsCNGC9能介導(dǎo)胞質(zhì)鈣升高，正向調(diào)控水稻稻瘟病抗性， OsCNGC9過表達(dá)增強(qiáng)了水稻PTI（病原體相關(guān)分子模式（PAMP）觸發(fā)免疫）和稻瘟病抗性^[22]。前人研究表明^[23]，CNGC家族基因在調(diào)控棉花抗逆方面具

有差異表達(dá)和功能多樣性。有關(guān)棉花GhCNGC8相關(guān)的抗逆研究較少。本研究從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得一個棉花抗逆基因 GhCNGC8。利用同源克隆技術(shù)得到該基因，其開放閱讀框?yàn)? 247 bp，編碼748個氨基酸，通過分析其理化性質(zhì)得到該基因分子質(zhì)量85.93 ku，理論等電點(diǎn)位8.95，平均疏水性為負(fù)值，表明該蛋白為堿性親水性蛋白，利用在線軟件分析得到該蛋白擁有信號肽的概率為0.002 5，推測該蛋白不含信號肽，不屬于分泌蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白定位在細(xì)胞膜上。植物CNGC結(jié)構(gòu)包括6個跨膜結(jié)構(gòu)域 （S1～S6），其中S4區(qū)域發(fā)揮電壓傳感器作用^[24]。環(huán)核苷酸結(jié)構(gòu)域（CNBD）位于C末端，由3個α螺旋和2個β折疊構(gòu)成。植物鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域（CaMBD）同樣位于C端，且序列分析證明和CNBD存在一定程度重疊，不同CNGC基因CaMBD數(shù)量有所不同，如AtCNGC12發(fā)現(xiàn)3個CaMBDs，這可能和CNGC功能有關(guān)^[25]。多序列比對顯示該蛋白含有6個跨膜（TM）結(jié)構(gòu)域、一個p環(huán)，該蛋白質(zhì)C端含有CaMBD、（CNBD）和CaM結(jié)合位點(diǎn)異亮氨酸-谷氨酸胺IQ，符合CNGCs基本結(jié)構(gòu)特征。進(jìn)化樹分析表明該基因與擬南芥 AtCNGC8關(guān)系較近。

前人研究證明，植物誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)通常和耐受性相關(guān)，基因表達(dá)模式通常是功能的指標(biāo)^[26]。本研究通過qRT-PCR技術(shù)探究了 GhCNGC8基因在不同組織以及黃萎病、鹽脅迫和干旱等3種脅迫下的表達(dá)模式。GhCNGC8在不同組織特異性表達(dá)，在一定程度上可以反應(yīng)該基因在棉花生長發(fā)育中的作用，該基因在棉花根、莖、葉片、花、萼片和苞片中均有表達(dá)，推測該基因可能在棉花生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。前人研究表明擬南芥 AtCNGC2和AtCNGC4在調(diào)節(jié)花轉(zhuǎn)變、花粉生長和花粉管伸長發(fā)揮重要作用^[27]。該基因在葉和花中表達(dá)量顯著高于其他組織，花中表達(dá)量較高暗示該基因可能與棉花生殖生長有關(guān)。本研究表明 GhCGNC8棉花轉(zhuǎn)錄本受黃萎病菌、鹽脅迫和干旱等脅迫處理影響，且在不同處理下存在一定差異， CNGC家族作為一種鈣離子通道蛋白，可能在植物調(diào)控抗逆信號網(wǎng)絡(luò)中存在重要作用，該基因在黃萎病菌處理下反應(yīng)最為強(qiáng)烈，建議后續(xù)研究主要關(guān)注該基因與黃萎病的關(guān)系。

植物在應(yīng)對外界脅迫過程中激素起到了重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，JA、SA作為核心成員是目前研究最多的兩條防衛(wèi)途徑。前人研究表明，茉莉酸信號通路中LOX、AOS、 MYC2等基因與黃萎病呈正相關(guān)，棉花植株在感染黃萎病后體內(nèi)也聚集了大量的茉莉酸^[28]。水楊酸通過調(diào)節(jié)NPR3和NPR4介導(dǎo)的NPR1的降解，將其保持在適當(dāng)水平調(diào)控植物免疫應(yīng)答反應(yīng)^[29]。低濃度過氧化氫作為一種信號分子，可以觸發(fā)植物對各種外界脅迫的抗性^[30]。本研究分析了3種激素誘導(dǎo)下該基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明，在H2O2處理下，GhCNGC8表達(dá)量顯著性增加，與0 h相比，1 h表達(dá)量增加5倍。在水楊酸處理下， GhCNGC8表達(dá)量同樣顯著性增加。Chen等^[31]發(fā)現(xiàn)，陸地棉GhCNGC4表達(dá)量受到水楊酸處理時顯著性增加，茉莉酸處理對 GhCNGC4表達(dá)量沒有顯著性影響。GhCNGC40受到茉莉酸和水楊酸處理后表達(dá)量呈顯著性下降^[9]，上述結(jié)果與本研究有所不同，可能與CNGC家族基因功能復(fù)雜性有關(guān)。CNGC家族不同成員的抗逆分子模式相同，但在抗逆作用中存在冗余現(xiàn)象^[32]。該基因與水楊酸和雙氧水關(guān)系較為密切，推測該基因可能通過調(diào)節(jié)水楊酸和雙氧水激素信號通路途徑調(diào)節(jié)GhCNGC8抗逆功能。

4 結(jié)" 論

本研究克隆得到棉花環(huán)核苷酸門控離子通道蛋白基因GhCNGC8，生物信息學(xué)分析得到該基因開放閱讀框?yàn)? 247 bp，編碼748個氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明該基因與擬南芥AtCNGC8關(guān)系較近，多重序列比對顯示該蛋白含有6個跨膜（TM）結(jié)構(gòu)域、一個p環(huán)，該蛋白質(zhì)C端含有鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域（CaMBD）、環(huán)核苷酸結(jié)構(gòu)域（CNBD）和CaM結(jié)合位點(diǎn)異亮氨酸-谷氨酸胺IQ，符合CNGCs結(jié)構(gòu)特征。GhCNGC8[QX）]在棉花根、莖、葉、花、萼片和苞片中均有表達(dá)，且在葉中表達(dá)量最高。該基因響應(yīng)黃萎病菌、鹽和干旱等逆境脅迫，同時對茉莉酸、水楊酸和H2O2等信號分子也有不同程度反應(yīng)。

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Molecular Cloning and Preliminary Expression Analysis of [QX（Y15] GhCNGC8[QX）] Gene in Gossypium hirsutum

ZHAO Zhun¹，HU Wenran¹，SHAO Wukui^1，2" and" HUANG Quansheng¹

（1.Institute of Nuclear Technology and Biotechnology， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Key Laboratory" of Crop Biotechnology of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830091，China; 2.College of" Life Sciences，Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052，China）

Abstract To investigate the role of the [QX（Y15] GhCNGC8[QX）] gene in cotton stress resistance， we cloned it from cotton leaves using PCR and utilized bioinformatics methods to analyze its physicochemical properties， structure， and evolutionary relationships. We used qRT-PCR to analyze the expression patterns of [QX（Y15] GhCNGC8[QX）]"" under various various stress conditions， including infection by Fusarium wilt pathogen， drought， salt stress， and hormone induction， as well as its tissue-specific expression.We constructed a VIGS vector targeting this gene and transformed it into cotton leaves using Agrobacterium-mediated methods. The gene silencing efficiency was assessed using quantitative fluorescence PCR. The [QX（Y15] GhCNGC8[QX）] gene was successfully cloned from cotton leaf cDNA， possessing an open reading frame of 2 247 bp that encodes 748 amino acids. Phylogenetic analysis indicated a close relationship between the upland cotton [QX（Y15] GhCNGC8[QX）] gene and the Arabidopsis [QX（Y15] AtCNGC8[QX）] gene. Multiple sequence alignment revealed that the [QX（Y15] GhCNGC8[QX）] protein conforms to the structural characteristics of CNGC family proteins. qRT-PCR results showed that the gene responded to Fusarium wilt， drought， salt stress， as well as jasmonic acid， salicylic acid， and hydrogen peroxide treatments to varying degrees. The [QX（Y15] GhCNGC8[QX）] gene expression was detected in roots， stems， leaves， flowers， sepals， and bracts， with the highest expression in leaves. Transformation of the [QX（Y15] GhCNGC8[QX）] gene VIGS silencing vector into cotton resulted in successful silencing， with expression levels reduced by approximately 70% compared to control， confirming the successful construction and normal operation in cotton. GhCNGC8 may play a significant role in cotton stress resistance.

Key words Cotton；GhCNGC8；Gene cloning；Expression analysis；Vector construction

Received" 2023-11-01""" Returned 2024-02-29

Foundation item Open Project for Key Laboratories of Xinjiang Uygur Autonomous Region （No.2022D04008）;Construction Project for the State Key Laboratory for Stress Resistance Genetic Improvement and Germplasm Innovation of Crops in Arid Desert Region （No.ZYYD2022B07）.

First author ZHAO Zhun， male， assistant research fellow. Research area： cotton molecular biology breeding. E-mail： 1790998478@qq.com

Corresponding"" author HUANG" Quansheng， male， research fellow.Research area： crop stress tolerance mechanisms. E-mail： hquansheng@126.com

（責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）

基金項(xiàng)目：新疆重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目（2022D04008）；省部共建干旱荒漠區(qū)作物抗逆遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育建設(shè)項(xiàng)目（ZYYD2022B07）。

第一作者：趙 準(zhǔn)，男，助理研究員，主要從事棉花分子生物育種。E-mail：1790998478@qq.com

通信作者：黃全生，男，研究員，主要從事作物耐逆機(jī)制研究。E-mail：hquansheng@126.com