全株玉米青貯過程中品質(zhì)及真菌群落組成特征

摘要：為探究全株玉米（Zea mays L.）青貯過程中真菌群落組成對青貯品質(zhì)的影響，本試驗測定分析全株青貯玉米青貯1 d，3 d，6 d，10 d，15 d，20 d，25 d，30 d和35 d的青貯品質(zhì)和真菌群落組成。結(jié)果表明，青貯35 d的可溶性糖、粗蛋白、干物質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量較1 d分別降低了19.51%，6.50%，7.38%，12.56%，11.33%。青貯35 d的pH值降低至3.77。乳酸、乙酸、丙酸的含量和氨態(tài)氮/總氮的比值分別在青貯發(fā)酵第6 d，15 d，35 d，35 d最高，為2.17 mg·kg-1，0.52 mg·kg-1，1.0 mg·kg-1，3.68%；未檢測出丁酸。玉米青貯過程中真菌群落多樣性先升高后降低，10 d后趨于穩(wěn)定。優(yōu)勢菌門為子囊菌門和擔子菌門，子囊菌門的相對豐度與青貯營養(yǎng)品質(zhì)和pH值呈正相關(guān)性（Plt;0.05），與乙酸，丙酸，氨態(tài)氮/總氮呈負相關(guān)性（Plt;0.05），且擔子菌門和子囊菌門的相對豐度變化趨勢相反。青貯過程中的優(yōu)勢真菌屬為囊壺菌屬。綜上所述，青貯過程中真菌對于青貯品質(zhì)有影響。

關(guān)鍵詞：青貯玉米品質(zhì);真菌多樣性;厭氧發(fā)酵

中圖分類號：S816.53""" 文獻標識碼：A""""" 文章編號：1007-0435（2024）12-3722-11

收稿日期：2024-01-04；修回日期：2024-04-03

基金項目：甘肅省技術(shù)創(chuàng)新引導計劃全株青貯玉米“種+貯+喂”一體化技術(shù)集成及推廣應(yīng)用；2022年甘肅省高等學校產(chǎn)業(yè)支撐計劃項目（2022CYCZ-50）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-34）資助

作者簡介：

梁文斌（1998-），男，漢族，甘肅定西人，碩士研究生，主要從事草產(chǎn)品加工研究，E-mail：3422068863@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：ygl@gsau.edu.cn

Characteristics of Quality and Fungal Community Composition

during Whole-Plant Corn Silage

LIANG Wen-bin， YIN Guo-li*， CHEN San-dong， ZHAO Yong-qi， LEI Qin

（Pratacultural College， Gansu Agricultural University/ Key Laboratory of Grassland Ecosystem， Ministry of Education，

Lanzhou， Gansu Province 730070， China）

Abstract：In order to explore the effect of fungal community composition on silage quality during Whole-plant corn （Zea mays L.） silage，in this study，the silage quality and fungal community composition of Whole-plant silage maize silage were determined and analyzed at 1 d，3 d，6 d，10 d，15 d，20 d，25 d，30 d and 35 d. The results showed that the contents of water soluble carbohydrate，crude protein，dry matter，neutral detergent fiber and acid detergent fiber after silage decreased by 19.51%，6.50%，7.38%，12.56% and 11.33%. respectively，compared with 1 day. pH value reduced to 3.77;The contents of lactic acid，acetic acid，propionic acid and ammoniacal nitrogen/total nitrogen were the highest on the 6th，15th，35th and 35th days of silage fermentation，which were 2.17 mg·kg-1，0.52 mg·kg-1，1.0 mg·kg-1，3.68 %，respectively. Butyric acid was not detected. During the process of maize silage，the diversity of fungal communities increased first and then decreased，and tended to stabilize after 10 days，and the dominant phyla were Ascomycota and Basidiomycota，and the relative abundance trend was opposite. The relative abundance of Ascomycota was positively correlated with the nutritional quality and pH of silage（Plt;0.05），negatively correlated with acetic acid，propionic acid and ammoniacal nitrogen/total nitrogen（Plt;0.05），but had no correlation with lactic acid（Plt;0.05）. The dominant genus is the Phlyctochytrium. In conclusion，fungi have impact on silage quality during silage.

Key words：Silage corn quality;Fungal diversity;Anaerobic fermentation

在我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村現(xiàn)代化的發(fā)展過程中，飼草飼料在畜牧業(yè)的發(fā)展中有著至關(guān)重要的作用，對我國養(yǎng)殖業(yè)和種植業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整有重要作用，同時全株青貯也滿足了發(fā)展現(xiàn)代化高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高效農(nóng)業(yè)的戰(zhàn)略要求［1］。目前我國仍面臨著飼草不足和冬春季飼草供求不平衡的問題，在立足于我國當前的實際情況開發(fā)利用青貯飼料是畜牧業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的必然要求［2］。玉米（Zea mays L.）是我國種植面積最大的農(nóng)作物之一，逐漸受到了廣大養(yǎng)殖戶的青睞。作為一種優(yōu)質(zhì)飼草，青貯后可緩解冬、春季節(jié)飼草嚴重不足的問題，對保障畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義［3］。同時青貯玉米具有氣味芳香、柔軟多汁、適口性好［4］、淀粉含量高、蛋白含量高、纖維少等優(yōu)點，素有“飼料之王”的美譽。

青貯過程是在厭氧條件下微生物不斷分解有機物的過程，具有復雜的微生物活動和群落結(jié)構(gòu)演替，多種微生物共同參與青貯過程，優(yōu)勢菌群在微生物活動中起主導作用，發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌群群落結(jié)構(gòu)演替對青貯飼料品質(zhì)影響較大［5］。青貯開始時飼草表面附著的微生物（乳酸菌）通過分解原料中的可溶性糖，產(chǎn)生乳酸和其他有機酸所形成的酸性環(huán)境抑制其他有害微生物的生長［6］。青貯過程中不同種類微生物對青貯飼料品質(zhì)的影響有所不同［7］，其中乳酸菌是決定青貯飼料能否成功發(fā)酵的主要微生物。乳酸菌通過產(chǎn)生大量的乳酸，快速降低青貯飼料中的pH值，抑制其他有害微生物的生長，抑制青貯飼料內(nèi)部硝態(tài)氮和丁酸等物質(zhì)的產(chǎn)生，提高了青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)［8］。飼草表面附著乳酸菌等有益微生物的同時也附著了部分有害微生物，例如霉菌和酵母菌。酵母菌能夠降低青貯飼料中干物質(zhì)和糖分含量［9］，消耗產(chǎn)生的乳酸，使得pH值上升，使其他雜菌生長，降低飼料發(fā)酵品質(zhì)；霉菌不僅能夠分解原料中的糖和產(chǎn)生的乳酸，子囊菌門（Ascomycota）中的嗜熱子囊菌可產(chǎn)生的真菌纖維素酶還能夠分解纖維素和細胞壁［10］，降低青貯飼料中的纖維含量［11］。鐮刀菌屬（Fusarium）中的幾種鐮刀菌是世界各地所有谷物種植區(qū)廣泛意義上的小穗谷物病原體，它們可引起根、莖和穗腐爛，導致作物產(chǎn)量嚴重下降，通常會下降10%～40%，青貯可抑制鐮刀菌屬生長繁殖［12］。此外，由禾谷鐮刀菌、串珠鐮刀菌、黃色鐮刀菌、谷類鐮刀菌、木賊鐮刀菌和擬輪枝鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生的玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA），ZEA也被認為是一種非甾體類雌激素化合物，在動物體內(nèi)會被轉(zhuǎn)化為雌激素活性極強的α-玉米赤霉烯醇，因此對雌性和雄性生殖系統(tǒng)都有重大影響。

青貯發(fā)酵的初始階段又稱為好氣性菌活動階段，這個階段一般會維持幾個小時到一天［13-14］，此階段營養(yǎng)成分流失嚴重。因為此階段乳酸菌會快速增長繁殖，消耗大量的水溶性碳水化合物。所以在植物干物質(zhì)積累量達到最大的生長時期進行青貯飼料的制作有利于乳酸菌的快速增長。大量的乳酸菌在青貯發(fā)酵前期不斷產(chǎn)生乳酸使青貯飼料的pH值迅速降低，較低的pH值可抑制引起腐敗的厭氧細菌和產(chǎn)生毒素的真菌生長［15］，從而減少厭氧微生物對蛋白質(zhì)的水解，減少由植物酶和厭氧微生物引起的青貯飼料營養(yǎng)損失，有效避免因厭氧微生物的生長活動所造成營養(yǎng)物質(zhì)的損失、適口性的降低和動物生產(chǎn)性能的損失［16］。

青貯發(fā)酵的穩(wěn)定階段，各種細菌、真菌等微生物之間相互競爭，形成了一個相對穩(wěn)定的微生物環(huán)境。其群落結(jié)構(gòu)的演替控制著青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。因此了解各種微生物生命活動規(guī)律和其最適生存環(huán)境，有利于創(chuàng)造微生物的最適生存環(huán)境增加青貯成功率。有研究表明青貯玉米水分活性較低，會限制有機酸的積累和微生物活性［17］。且外源乳酸菌在高水分的青貯飼料中接種效果會減弱，不能有效地抑制不良微生物的生長和繁殖［18］。為了生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)青貯飼料適當降低玉米水分可提高玉米青貯品質(zhì)。

本試驗通過測定全株玉米青貯過程中不同青貯時段的營養(yǎng)品質(zhì)、發(fā)酵品質(zhì)及真菌多樣性，旨在明確玉米青貯過程中的品質(zhì)變化和真菌微生物群落組成的動態(tài)變化，為調(diào)控青貯發(fā)酵品質(zhì)提供科學參考。

1" 材料與方法

1.1" 試驗地概況

試驗田位于甘肅省蘭州市西固區(qū)達家臺，地處北緯36°15′，東經(jīng)103°36′，屬于溫帶大陸性氣候，海拔1869 m。年總降雨量822 mm，年均高溫19℃，年均低溫5℃，極端高溫38℃，極端低溫—15℃，年平均日照達2780 h，年積溫（≥10℃）2700～3300℃。

1.2" 試驗設(shè)計

供試玉米品種：糧飼兼用型，‘和盛5288’玉米（Zea mays L. ‘Hesheng 5288’）。青干草營養(yǎng)品質(zhì)如表1所示。

試驗小區(qū)面積為180 m2，采用精量播種機進行播種，行距65 cm，種植密度600 000株·hm-2。蠟熟期刈割，留茬高度為15 cm。晾曬至水分含量65%左右，用揉絲機切碎，混合均勻后裝入鋁箔真空袋中，每袋裝500 g，制作27袋，使用真空機抽真空并封口，放當?shù)刈匀话l(fā)酵。全株青貯玉米發(fā)酵1 d，3 d，6 d，10 d，15 d，20 d，25 d，30 d和35 d，分別記為Q1 d，Q3 d，Q6 d，Q10 d，Q15 d，Q20 d，Q 25 d，Q30 d和Q35 d，共9個時間處理，每個時間處理隨機選取3袋，測定青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)、發(fā)酵品質(zhì)和真菌微生物群落結(jié)構(gòu)。

1.3" 測定指標和方法

1.3.1" 營養(yǎng)指標測定" 取220 g玉米青貯樣品，在65℃烘箱內(nèi)烘干48 h，稱取風干重后粉碎，制成烘干樣，用于常規(guī)營養(yǎng)成分測定。

干物質(zhì)（Dry matter，DM）含量采用105℃烘干法測定；粗蛋白（Crude protein，CP）采用凱氏定氮法進行測定；粗灰分（Ash）采用茂福爐500℃直接灰化法測定；中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）采用范式（Van Soest）洗滌纖維測定方法［19］測定；采用蒽酮比色法來測定可溶性糖（Water soluble carbohydrate，WSC）含量［20］。

1.3.2" 發(fā)酵指標測定" 取20 g玉米青貯樣品和180 mL去離子水放入具塞三角瓶，于4℃搖床中浸提12 h，取出后用4層紗布過濾后得到浸提液，進行發(fā)酵品質(zhì)的測定。

使用pH計測定其pH值；采用液相色譜法測定乳酸（Lactic acid，LA）、乙酸（Acetic acid，AA）、丙酸（Propionic acid，PA）、丁酸（Butyric acid，BA）的含量［21］；采用苯酚-次氯酸鹽比色法測定氨態(tài)氮/總氮（Ammoniacal nitrogen/Total nitrogen，NH3-N/TN）。

1.3.3" 總DNA提取" 在超凈工作臺中每袋稱取20 g青貯飼料，放入無菌水中震蕩30 min，震蕩后取上清液過0.22 μm濾膜，將濾膜保存在-80℃冰箱中，用于總DNA提取。

青貯玉米總DNA提取及真菌ITS rDNA：基因擴增使用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒完成核酸的提取，使用酶標儀（基因有限公司Gene Company Limited，型號synergy HTX）檢測提取核酸的濃度，以該檢測濃度下DNA濃度為模板，對真菌ITS rDNA ITS1區(qū)引物ITS1F和ITS2進行PCR擴增，使用濃度1.80%的瓊脂糖對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測（北京博美富鑫科技有限公司）后建立檢測文庫。通過Qsep-400方法對文庫進行質(zhì)檢合格后使用Illumina Novaseq6000進行上機測序。下機后使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效序列（Effective Reads）。

1.4" 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理；用SPSS 20.00軟件對數(shù)據(jù)進行差異性分析；R軟件（2.15.3）繪制稀釋曲線，QIIME2軟件對樣品Alpha多樣性指數(shù)進行分析；Origin繪制相關(guān)性熱圖。

2nbsp; 結(jié)果與分析

2.1" 全株玉米青貯過程中營養(yǎng)品質(zhì)與發(fā)酵品質(zhì)的變化

2.1.1" 全株玉米青貯過程中營養(yǎng)品質(zhì)的變化" 由表2可知，青貯過程中，粗蛋白（CP）含量總體呈現(xiàn)下降趨勢，從8.92%降低至8.34%。Q1 d粗蛋白含量最高，顯著高于其他處理（Plt;0.05），相較于Q1 d，Q3 d時粗蛋白含量下降2.24%，35 d時粗蛋白含量降低6.50%。中性洗滌纖維（NDF）的含量隨青貯發(fā)酵時間的增加逐漸降低，青貯完成后Q1 d，Q3 d，Q6 d的NDF含量顯著高于Q35 d及其他處理（P＜0.05），Q35 d時NDF含量較Q1 d降低12.56%，且Q15 d—Q35 d時下降速度較快。青貯過程中酸性洗滌纖維（ADF）含量逐漸降低，Q1 d，Q3 d和Q6 d時ADF含量顯著高于Q35 d及其他處理（P＜0.05），Q35 d時ADF含量較Q1 d時下降17.02%，Q20 d—Q35 d時間內(nèi)下降速度較快。可溶性碳水化合物（WSC）隨厭氧發(fā)酵時間的延長呈下降趨勢，Q35 d顯著低于Q1 d及其他處理（P＜0.05），Q35 d較Q1 d下降19.32%，且Q1 d—Q30 d下降速度較慢，Q30 d—Q35 d顯著下降，降低了8.89%。厭氧發(fā)酵過程中干物質(zhì)（DM）含量呈下降趨勢，Q30 d和Q35 d顯著小于Q1 d及其他處理（P＜0.05），Q35 d較Q1 d下降7.38%，在Q15 d—Q30 d顯著下降（P＜0.05）。粗灰分含量總體呈下降趨勢，且Q35 d的灰分含量顯著低于其他處理（P＜0.05）。

2.1.2" 全株玉米青貯過程中發(fā)酵品質(zhì)的變化" 由表3可知在青貯過程中，乳酸（LA）含量呈先增加后降低的趨勢，Q6 d時顯著高于Q1 d及其他處理（P＜0.05）；乙酸（AA）含量隨青貯發(fā)酵時間的延長先上升后降低，Q15 d時顯著高于Q1 d及其他處理（P＜0.05）；丙酸（PA）含量隨青貯發(fā)酵時間的延長而增加，在Q1 d時未檢測到，Q35 d時含量顯著高于Q3 d及其他處理（P＜0.05），Q1 d—Q15 d時間段內(nèi)快速增加，Q15 d—Q35 d增加速度減慢；在整個青貯發(fā)酵過程中，未檢測到丁酸（BA）；隨青貯發(fā)酵時間的延長，pH值呈上升趨勢，Q1 d時顯著高于其他處理（P＜0.05），Q10 d時顯著降低（P＜0.05），Q10 d后緩慢降低至Q35 d，降到最低3.77；NH3-N/TN的比值隨青貯發(fā)酵時間的延長呈增長趨勢，Q35 d顯著高于Q1 d及其他處理（P＜0.05）。

2.2" 全株玉米青貯過程中真菌Alpha多樣性分析

高通量測序的結(jié)果如表4所示，從青貯發(fā)酵1 d到35 d時間段內(nèi)真菌的有效序列在69 992和77 280之間波動，分類操作單元（Operational taxonomic unit，OTU）的數(shù)目分別是260，299，264，673，667，667，668，670和665。圖1和圖2為各樣本稀釋曲線和等級聚類曲線。如圖所示，各樣本稀釋曲線逐漸趨于平穩(wěn)，表明測序數(shù)據(jù)量漸進合理，由等級聚類曲線在水平方向上跨度趨于增寬，在垂直方向上趨于平緩，表明物種的豐富度高且分布均勻。所有樣品的覆蓋度如表4所示均大于99%，表明測序深度足以保證多樣性分析。

如表4所示，Chao1指數(shù)和ACE代表物種豐富度，Chao1指數(shù)在Q6 d下顯著低于Q1 d及其他處理（P＜0.05），Chao1指數(shù)在Q10 d之前各處理間差異性顯著，Q10 d后各處理間差異性不顯著，說明在Q10 d前，真菌豐富度發(fā)生了巨大變化，在Q10 d之后真菌豐富度逐漸趨于穩(wěn)定。ACE指數(shù)呈先升高后降低的趨勢，玉米青貯組中真菌群落的豐富度先升高后下降［22］，在Q3 d時顯著高于Q1 d及其他處理（P＜0.05）。Shannon-wiener指數(shù)能同時反映豐富度和均勻度，Shannon-wiener指數(shù)越大，表示群落多樣性越高。在整個青貯發(fā)酵過程中Shannon-wiener指數(shù)呈先上升后穩(wěn)定的趨勢，說明微生物多樣性同樣呈先上升后穩(wěn)定的趨勢，Q1 d時真菌多樣性最低。Q1 d—Q3 d時間段內(nèi)下Shannon-wiener指數(shù)差降幅最大，說明在青貯Q1 d—Q3 d時間段內(nèi)真菌的多樣性大幅度下降，Q10 d之前各處理間差異性顯著（P＜0.05），Q10 d后各處理間差異性不顯著，說明在Q10 d前，微生物多樣性發(fā)生了巨大變化，在Q10 d之后微生物多樣性逐漸趨于穩(wěn)定。

2.3" 全株玉米青貯過程中真菌物種Venn圖分析

利用Venn圖在OTU分類水平上分析了青貯發(fā)酵過程中各時間點的微生物組成相似情況，如圖3所示青貯各階段真菌共有的OTU種類數(shù)為197個，其中Q1 d，Q3 d，Q6 d，Q10 d，Q15 d，Q20 d，Q 25 d，Q30 d和Q35 d所特有的OUTs種類數(shù)分別是10，11，4，6，8，4，6，4，5種。

2.4" 全株玉米青貯過程中真菌Beta多樣性分析

由圖4可知，在OTU水平上，Q1 d，Q3 d和Q6 d樣本與青貯Q10 d，Q15 d，Q20 d，Q25 d，Q30 d和Q35 d的樣本距離較遠，表示物種組成結(jié)構(gòu)差異較大，群落結(jié)構(gòu)相似度很低。且Q10 d，Q15 d，Q20 d，Q25 d，Q30 d和Q35 d的樣本距離相近，表明其真菌群落結(jié)構(gòu)差異很小。

2.5" 全株玉米青貯過程中真菌群落組成

2.5.1" 門水平的真菌群落變化" 全株玉米青貯過程中真菌群落組成如圖5所示，相對豐度前十的真菌門分別為：子囊菌門（Ascomycota） （31.47%～69.55%），擔子菌門（Basidiomycota）（28.12%～46.80%），壺菌門（Chytridiomycota）（0.21%～10.28%），未分類（Unclassified）（0.31%～6.08%），被孢霉門（Mortierellomycota）（0.60%～5.02%），球囊菌門（Glomeromycota）（0.03%～0.58%），油壺菌門（Olpidiomycota）（0.03%～1.65%），羅茲菌門（Rozellomycota）（0.02%～0.45%），毛霉菌門（Mucoromycota）（0.018%～0.16%），梳霉門（Kickxellomycota）（0.004%～0.20%），占真菌總數(shù)的99.99%。子囊菌門相對豐度隨青貯發(fā)酵時間呈下降趨勢，在Q1 d和Q6 d時子囊菌門相對豐度高于其他處理（P＜0.05），在Q10 d時相對豐度下降，后維持在穩(wěn)定狀態(tài)。子囊菌門和擔子菌門相對豐度在相對應(yīng)的時間點變化趨勢相反，兩者之間存在競爭關(guān)系。壺菌門相對豐度在整個青貯發(fā)酵過程中呈上升趨勢，Q6 d之前，壺菌門相對豐度變化小，Q10 d時相對豐度迅速升高，壺菌門相對豐度在Q1 d，Q3 d和Q6 d時低于其他處理（P＜0.05）。被孢霉門相對豐度隨青貯發(fā)酵時間呈上升趨勢，在Q10 d時相對豐度增高，后趨于穩(wěn)定，在Q1 d，Q3 d和Q6 d被孢霉門相對豐度低于其他處理（P＜0.05）。油壺菌門相對豐度與被孢霉門相對豐度變化趨勢相似，同樣在Q1 d，Q3 d和Q6 d時油壺菌門相對豐度低于其他處理（P＜0.05）。球囊菌門、羅茲菌門、梳霉門相對豐度隨青貯發(fā)酵時間的延長呈上升趨勢，同樣在Q1 d，Q3 d和Q6 d時3個菌門的相對豐度低于其他處理（P＜0.05），Q6 d之后3個菌門相對豐度升高（P＜0.05），并且在Q10d升高后維持在穩(wěn)定狀態(tài)。毛霉菌門相對豐度隨青貯發(fā)酵時間呈下降趨勢，在Q3d時毛霉菌門相對豐度高于Q1d及其他處理（P＜0.05）。

2.5.2" 屬水平的真菌群落變化" 由圖6可知，全株玉米青貯過程中真菌群落相對豐度前十的真菌屬分別為：囊壺菌屬（Phlyctochytrium）、毛葡孢屬（Botryotrichum）、被孢霉屬（Mortierella）、木霉屬（Trichoderma）、庫茲曼酵母屬（Kurtzmaniella），白環(huán)蘑屬（Leucoagaricus），線黑粉菌屬（Filobasidium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、帚枝霉屬（Sarocladium）和乳頭狀瘤菌（Papiliotrema），占真菌總數(shù)的64.42%～72.47%。帚枝霉屬相對豐度隨厭氧發(fā)酵時間的延長呈下降趨勢，Q1 d時帚枝霉屬相對豐度高于其他處理（P＜0.05），在Q3 d，Q6 d時其相對豐度迅速降低，Q10 d后維持在穩(wěn)定狀態(tài)。囊壺菌屬、毛葡孢屬、被孢霉屬和木霉屬相對豐度隨青貯發(fā)酵時間的延長呈上升趨勢，在Q1 d，Q3 d和Q6 d時囊壺菌屬、毛葡孢屬、被孢霉屬和木霉屬相對豐度低于其他處理（P＜0.05），在Q10 d時相對豐度增高，后維持在穩(wěn)定狀態(tài)。庫茲曼酵母屬、線黑粉菌屬、乳頭狀瘤菌相對豐度隨厭氧發(fā)酵時間的延長呈下降趨勢，在Q1 d，Q3 d和Q6 d時庫茲曼酵母屬、線黑粉菌屬、乳頭狀瘤菌相對豐度高于其他處理（P＜0.05），在Q10 d相對豐度增高，后3個屬的相對豐度維持在一個穩(wěn)定狀態(tài)。鐮刀菌屬相對豐度隨厭氧發(fā)酵時間呈下降趨勢，Q1 d時鐮刀菌屬相對豐度高于其他處理（P＜0.05）。

2.6" 全株玉米青貯過程中真菌相關(guān)性分析

由圖7可知，全株玉米青貯過程中真菌群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖中相對豐度在前十的真菌屬分別是線黑粉菌屬（Filobasidium），被孢霉屬（Mortierella），乳頭狀瘤菌（Papiliotrema），庫茲曼酵母屬（Kurtzmaniella），白環(huán)蘑屬（Leucoagaricus），木霉屬（Trichoderma），毛葡孢屬（Botryotrichum），囊壺菌屬（Phlyctochytrium），鐮刀菌屬（Fusarium），帚枝霉屬（Sarocladium）。其相對豐度毛葡孢屬與被孢霉屬、木霉屬、囊壺菌屬相對豐度呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），與庫茲曼酵母屬、線黑粉菌屬、乳頭狀瘤菌相對豐度呈負相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；線黑粉菌屬與乳頭狀瘤菌、庫茲曼酵母屬相對豐度呈正相關(guān)（P＜0.05），與被孢霉屬、木霉屬相對豐度呈負相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；被孢霉屬與毛葡孢屬相對豐度呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），與庫茲曼酵母屬、線黑粉菌屬、乳頭狀瘤菌相對豐度呈負相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；庫茲曼酵母屬與線黑粉菌屬、乳頭狀瘤菌相對豐度呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），與白環(huán)蘑屬、木霉屬相對豐度呈負相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；白環(huán)蘑屬與囊壺菌屬相對豐度呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），與乳頭狀瘤菌呈負相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。

2.7" 全株玉米青貯過程中真菌群落組成與青貯品質(zhì)的相關(guān)性

2.7.1" 全株玉米青貯過程中真菌群落組成與營養(yǎng)品質(zhì)的相關(guān)性" 由圖8可知，子囊菌門相對豐度與DM，WSC，CP，NDF和ADF含量具有極其顯著的正相關(guān)性，與Ca含量呈極顯著正相關(guān)，與P含量顯著正相關(guān)；擔子菌門相對豐度與DM，WSC，CP，NDF和ADF含量極顯著負相關(guān)，與Ca和P顯著負相關(guān)；羅茲菌門與Ca，WSC，CP，NDF和ADF含量具有極其顯著的負相關(guān)性；被孢霉門和油壺菌門相對豐度與DM，WSC，CP，NDF和ADF含量極顯著負相關(guān)，與Ca含量具有極其顯著的負相關(guān)性；壺菌門、芽枝霉門和球囊菌門與Ca，WSC，CP，NDF和ADF具有極其顯著的負相關(guān)性；梳霉門相對豐度與WSC，CP，NDF和ADF極其顯著負相關(guān)，與Ca呈極顯著負相關(guān)。

2.7.2" 全株玉米青貯過程中真菌群落組成與發(fā)酵品質(zhì)的相關(guān)性" 由圖9可知，子囊菌門相對豐度與pH值具有極其顯著的正相關(guān)性，與PA和NH3-N/TN極其顯著負相關(guān)；被孢霉門、油壺菌門的相對豐度與AA，PA和NH3-N/TN呈極顯著正相關(guān)，與pH值極顯著負相關(guān)；壺菌門、球囊菌門、梳霉門和芽枝霉門相對豐度與PA和NH3-N/TN極顯著正相關(guān)，與pH值極顯著負相關(guān)；擔子菌門與PA和NH3-N/TN極顯著正相關(guān)，與pH值極顯著負相關(guān)；擔子菌門和芽枝霉門相對豐度與AA含量顯著正相關(guān)。

3" 討論

3.1" 全株玉米青貯過程中青貯時間對青貯品質(zhì)的影響

3.1.1" 全株玉米青貯過程中青貯時間對營養(yǎng)品質(zhì)的影響" 本試驗中，隨青貯發(fā)酵時間的延長，CP，WSC，DM，NDF和ADF含量下降。在厭氧發(fā)酵初期，部分好氧微生物和有害微生物未被抑制，導致營養(yǎng)成分含量在Q3 d明顯降低。青貯開始后，乳酸菌以WSC底物，產(chǎn)生LA等物質(zhì)［23］，是青貯發(fā)酵過程中WSC含量降低的主要原因之一。但隨著青貯發(fā)酵的進程青貯飼料中的pH值不斷降低從而抑制了有害微生物的生長，減少了WSC的損耗。有研究發(fā)現(xiàn)，在整個青貯過程中青貯飼料中的酵母菌進行酒精發(fā)酵［24-25］導致DM的含量降低，隨著CP和WSC被各種微生物不斷消耗，其中CP在青貯15 d內(nèi)大量流失，也導致了DM含量的降低。有研究發(fā)現(xiàn)，子囊菌門中的嗜熱子囊菌產(chǎn)生的真菌能夠降解纖維素［26］，導致NDF和ADF含量顯著下降，提高了青貯飼料的適口性，為了提高青貯飼料的營養(yǎng)品質(zhì)，可通過添加添加劑或壓實青貯飼料等方法防止CP的過度流失［27-28］。

3.1.2" 全株玉米青貯過程中青貯時間對發(fā)酵品質(zhì)的影響" pH值是衡量青貯飼料發(fā)酵質(zhì)量的重要指標之一，能夠有效地判斷青貯飼料保存地完好程度和是否發(fā)生變質(zhì)［29］。在合理范圍之內(nèi)，pH值越低，說明青貯效果越好。本試驗中，pH值在青貯10 d降低至4.1以下，隨后穩(wěn)定在3.8左右，說明青貯玉米保存和發(fā)酵的效果良好［30］。青貯發(fā)酵前期乳酸菌快速生長繁殖，產(chǎn)生了大量的LA，降低了青貯玉米飼料的pH值，較低的pH值會抑制乳酸菌的生長，使乳酸菌產(chǎn)酸速度下降。青貯過程中pH值的降低需要大量的水溶性碳水化合物來生產(chǎn)乳酸［31］。青貯發(fā)酵前期pH值的降低和乳酸的快速積累可以抑制引起腐敗的厭氧細菌和霉菌的生長，這也有助于減少由植物酶和厭氧微生物引起的青貯營養(yǎng)損失，減少蛋白質(zhì)水解的發(fā)生［32］。同時厭氧微生物能夠?qū)A分解為AA，PA等有機酸，導致LA含量在Q35 d時下降。LA可抑制有害微生物對營養(yǎng)成分的分解［33］，并提高青貯飼料的品質(zhì)，LA在青貯飼料有機酸中占比最大，其含量越高，說明青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)越好［34］。本試驗中LA含量在Q25 d之前逐漸升高，其中LA含量在Q3 d時顯著增加，原因是玉米中含有大量的WSC作為乳酸菌的發(fā)酵底物，使乳酸菌迅速增長繁殖，并生成大量LA。試驗中AA的含量在整個青貯過程中先升高后下降，PA的含量隨青貯時間的增加而不斷升高，因為PA的解離程度低，所以在整個青貯過程中PA不斷積累，并能夠有效地抑制開窖后各類有害微生物的生長［35］，可提高青貯玉米飼料的有氧穩(wěn)定性［36］。在整個青貯過程中未檢測到BA，說明青貯加工過程規(guī)范，同時LA，PA也抑制了丁酸梭菌分泌BA［37］。氨態(tài)氮/總氮比值可反映青貯發(fā)酵過程中粗蛋白降解程度，其比值直接影響青貯飼料的適口性和營養(yǎng)價值，氨態(tài)氮/總氮比值越低則說明蛋白氮降解越少，青貯發(fā)酵品質(zhì)越好［38］。本試驗中，隨青貯發(fā)酵時間的延長NH3-N/TN比值在逐漸增加，在Q3 d時，NH3-N/TN比值顯著升高，因為各種微生物經(jīng)過3 d的迅速繁殖，CP等含氮物質(zhì)被大量降解，造成了NH3-N/TN比值的迅速升高。

3.2" 全株玉米青貯過程中真菌群落多樣性分析

全株玉米青貯過程中真菌多樣性先升高，Q10 d后趨于穩(wěn)定，真菌群落變化在Q10 d時都具有顯著增高或降低的趨勢，表明青貯發(fā)酵過程中10 d是青貯飼料發(fā)酵的關(guān)鍵時間點［39］。優(yōu)勢菌門為子囊菌門和擔子菌門［40］。子囊菌門相對豐富隨青貯時間的增加而逐漸降低，由青貯發(fā)酵的初始階段到青貯發(fā)酵的穩(wěn)定階段，其相對豐度從69.55%下降到31.90%。子囊菌門是腐生菌［41］，其產(chǎn)生纖維素酶能分解纖維素、木質(zhì)素和有機物［42］。且子囊菌門中的酵母菌、霉菌屬于異養(yǎng)型微生物，其具有胞內(nèi)和胞外酶系統(tǒng)，用于將大分子物質(zhì)分解成細胞新陳代謝可利用的小分子物質(zhì)［43］，使乳酸菌在發(fā)酵前期迅速增長繁殖產(chǎn)生大量乳酸使pH值從Q1 d-Q10 d迅速降低，從而提高青貯飼料的品質(zhì)。擔子菌門相對豐度隨青貯時間的增加而升高從28.12%升高到45.49%。壺菌門，Unclassified，被孢霉門等相對豐度在Q10 d顯著升高，是青貯過程中真菌多樣性升高的原因。Q1 d時帚枝霉屬相對豐度為31.55%，到Q6 d時相對豐度下降到0.04%。研究發(fā)現(xiàn)，帚枝霉屬是禾本科的內(nèi)生真菌，在制作青貯飼料的過程中玉米各組織被切碎，且在短時間內(nèi)青貯飼料的pH值下降，帚枝霉屬原來的生存環(huán)境被破壞，導致其相對豐度快速下降［44］。鐮刀菌屬相對豐度隨厭氧發(fā)酵的進行呈下降趨勢，Q1 d時鐮刀菌屬相對豐度高于其他處理，且Q3 d，Q6 d其相對豐度逐漸下降。說明青貯過程可以減少鐮刀菌屬的數(shù)量，這與ECKARD等人的研究成果一致［45］。

4" 結(jié)論

本試驗對全株玉米青貯過程中的品質(zhì)和真菌群落在青貯過程中的不同時間段的相對豐度進行動態(tài)分析以及對真菌群落組成與青貯品質(zhì)的相關(guān)性進行了分析。結(jié)果表明真菌群落組成會顯著影響青貯營養(yǎng)品質(zhì)和發(fā)酵品質(zhì)。后期試驗可加入擔子菌門的真菌，以驗證其與青貯品質(zhì)的相關(guān)性，從而提高全株玉米的青貯品質(zhì)。例如加入抑制鐮刀菌屬（這類真菌產(chǎn)生玉米赤霉烯酮毒素）生長的物質(zhì)，可以減少玉米赤霉烯酮的產(chǎn)生及其對牲畜生殖系統(tǒng)的影響。此結(jié)果對提高青貯飼料品質(zhì)的研究具有參考價值。

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（責任編輯" 閔芝智）