黑果腺肋花楸發(fā)酵果渣多酚的純化及抗氧化性研究

摘要：該研究對(duì)前期提取的黑果腺肋花楸發(fā)酵果渣中的粗多酚進(jìn)行分離純化。通過比較吸附和解吸效果，選擇NKA-9作為試驗(yàn)樹脂；采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的多酚最佳純化工藝為樣液pH值3.0、樣液濃度2.0 mg/mL、上樣流速2.0 mL/min、乙醇濃度70%和洗脫流速1.0 mL/min，在此條件下，多酚純度由（11.71±0.20）%提高到（62.61±0.78）%，提高了5.34倍；HPLC分析發(fā)現(xiàn)，多酚純化物中含有綠原酸、金絲桃苷、蘆丁、新綠原酸、原兒茶酸、阿魏酸、表兒茶素沒食子酸酯、咖啡酸和槲皮素等多酚成分，其中綠原酸含量最高；多酚濃度為55 μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·、·OH和ABTS+·的清除率分別為（96.06±0.45）%、（89.95±0.19）%和（99.33±0.02）%；清除自由基能力及對(duì)Fe3+的還原能力顯著高于VC對(duì)照組。

關(guān)鍵詞：黑果腺肋花楸；發(fā)酵果渣;多酚；純化；抗氧化性

中圖分類號(hào)：TS201.2""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""""" 文章編號(hào)：1000-9973（2024）08-0186-07

Study on Purification and Antioxidant Activity of Polyphenols

from Aronia melanocarpa Fermented Fruit Residue

YANG Liu1， MA Ning1， ZHANG Zhen-yuan1， CHEN Sheng1， JIANG Zhi-peng1，

XU Sheng-yu2， SUN Mao-cheng1*

（1.College of Food Science and Engineering， Changchun University， Changchun 130022， China;

2.Baishan Linyuanchun Ecological Technology Co.， Ltd.， Baishan 134300， China）

Abstract： In this study， the previously extracted crude polyphenols from" Aronia melanocarpa fermented fruit residue are isolated and purified. NKA-9 is selected as the test resin by comparing the adsorption and desorption effects. The optimum purification process of polyphenols obtained by response surface method is as follows： the pH value of sample solution is 3.0， the concentration of sample solution is 2.0 mg/mL， the loading velocity is 2.0 mL/min， the ethanol concentration is 70% and the elution velocity is 1.0 mL/min. Under these conditions， the purity of polyphenols increases from （11.71±0.20）% to （62.61±0.78）%， increasing by 5.34 times. Through HPLC analysis， it is found that the purified polyphenols contain chlorogenic acid， hyperin， rutin， neochlorogenic acid， protocatechic acid， ferulic acid， epicatechin gallate， caffeic acid and quercetin. The chlorogenic acid has the highest content. When the concentration of polyphenols is 55 μg/mL， the scavenging rates on DPPH·， ·OH and ABTS+· are （96.06±0.45）%，（89.95±0.19）%，（99.33±0.02）% respectively. The free radical scavenging capacity and the reducing power of Fe3+ are significantly higher than those of VC control group.

Key words： Aronia melanocarpa; fermented fruit residue; polyphenols; purification; antioxidant activity

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.08.031

引文格式：楊柳，馬寧，張振源，等.黑果腺肋花楸發(fā)酵果渣多酚的純化及抗氧化性研究.中國調(diào)味品，2024，49（8）：186-192.

YANG L， MA N， ZHANG Z Y， et al. Study on purification and antioxidant activity of polyphenols from Aronia melanocarpa fermented fruit residue.China Condiment，2024，49（8）：186-192.

收稿日期：2024-02-26

基金項(xiàng)目：吉林省科技廳項(xiàng)目（20220202082NC）；吉林省教育廳項(xiàng)目（JJKH20230682KJ）

作者簡介：楊柳（1981—），女，副教授，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

*通信作者：孫茂成（1984—），男，講師，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

黑果腺肋花楸也稱野櫻莓、不老莓，以下簡稱“黑果”，是集食用、藥用等價(jià)值于一身的珍貴樹種。黑果發(fā)酵果渣是黑果果酒的加工副產(chǎn)物，其中含有膳食纖維、多酚、糖類等營養(yǎng)物質(zhì)，被認(rèn)為是食品補(bǔ)充劑和功能性食品的重要成分來源。黑果發(fā)酵果渣中總酚含量高于果實(shí)3～5倍，具有較好的抗氧化性和抑菌效果。研究發(fā)現(xiàn)黑果發(fā)酵果渣多聚原花青素的含量達(dá)95.86 mg/g，比漿果高45%～60%，本研究前期已對(duì)黑果發(fā)酵果渣中多酚物質(zhì)的提取進(jìn)行了優(yōu)化，但提取的多酚中含有較多雜質(zhì)，因此本研究將對(duì)提取的粗多酚進(jìn)行純化，以期獲得純度更高的多酚類物質(zhì)，為發(fā)酵果渣多酚的進(jìn)一步研究及其在功能性產(chǎn)品中的應(yīng)用提供了理論研究和數(shù)據(jù)支撐。

多酚純化方法有溶劑萃取法、層析分離純化法、金屬離子沉淀法、膜分離法、大孔樹脂吸附法等，其中大孔樹脂吸附法被主要用于活性物質(zhì)的分離純化。大孔吸附樹脂具有穩(wěn)定性好、吸附容量大、再生處理方便、使用周期長、節(jié)省費(fèi)用等優(yōu)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)XAD-7大孔樹脂對(duì)多酚的純化效果較好，但成本偏高。研究多酚粗提物的吸附和解吸效果，優(yōu)選出最佳試驗(yàn)樹脂，并優(yōu)化多酚的純化工藝，最后分析純化后的多酚組分及抗氧化活性，以期為黑果發(fā)酵果渣多酚的研究利用提供方法和理論參考。

1" 材料與方法

1.1" 主要材料與試劑

黑果發(fā)酵果渣：吉林省白山市林源春有限公司；HPD-600、NKA-9、D-101、AB-8大孔樹脂：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（均為分析純）：福州飛凈生物科技有限公司；福林酚、三氯乙酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；過氧化氫、無水乙醇、抗壞血酸、無水碳酸鈉（均為分析純）：北京化工廠；硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、水楊酸、三氯化鐵（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2" 主要儀器與設(shè)備

UV2700紫外可見分光光度計(jì)" 日本島津儀器有限公司；CBS-B自動(dòng)部分收集器、HL-2S恒流泵" 上海嘉鵬科技有限公司；H2500R高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)" 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Φ2.6 cm×30 cm玻璃層析柱" 上海聯(lián)塔儀器有限公司；Christ Alpha 1-2 LD Plus冷凍干燥機(jī)" 德國Marin Christ公司；WQF-530傅里葉變換紅外光譜儀" 北京信立方科技發(fā)展股份有限公司；Waters e2695高效液相色譜儀" 美國Waters公司。

1.3" 試驗(yàn)方法

1.3.1" 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用福林酚法測(cè)定多酚含量，參考文獻(xiàn)的方法并稍作修改。精確稱量10 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，加水定容至10 mL，配成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋至0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06 mg/mL 6個(gè)濃度。分別取1.0 mL于試管中，加入濃度為10%的福林酚溶液5.0 mL，5 min后再加入濃度為7.5%的Na2CO3溶液1.5 mL，混合均勻，置于35 ℃水浴條件下避光顯色1 h，然后測(cè)吸光度（波長765 nm）。平行試驗(yàn)3次，以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1?；貧w方程為y=0.011 5x-0.001 0，R2=0.999 8。

1.3.2" 多酚提取及含量測(cè)定

將一定量黑果發(fā)酵果渣置于真空冷凍干燥機(jī)中，凍干后粉碎過40目篩得到黑果果粉。準(zhǔn)確稱取0.5 g黑果粉末于50 mL錐形瓶中，按酶解底物的質(zhì)量百分比加入果膠酶和pH為3.0的70％乙醇溶液，按照料液比1∶50（g/mL）在200 W條件下超聲提取60 min，超聲溫度為47 ℃。粗提液以4 000 r/min離心20 min，然后取上清液保存。將樣液稀釋一定倍數(shù)，取1.0 mL置于比色管中，定容，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定提取液的吸光值，并計(jì)算多酚的含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。黑果發(fā)酵果渣多酚提取量（X）的計(jì)算公式見公式（1）：

多酚提取量X（mg/g）=c×v×nm×10-3。（1）

式中：c為多酚濃度，μg/mL；v為提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3" 樹脂的篩選

精確稱取經(jīng)95%乙醇浸泡24 h處理后的AB-8、D-101、HPD-600和NKA-9型大孔樹脂各2.0 g于錐形瓶中，分別加入黑果發(fā)酵果渣多酚粗提液40 mL，避光振蕩24 h（30 ℃，120 r/min），然后測(cè)上清液中多酚的濃度，按照公式（2）和公式（3）計(jì)算吸附量和吸附率。用蒸餾水沖去未被吸附的多酚，吸除表面殘余水分，加入40 mL乙醇溶液（70%），密封后避光振蕩24 h（30 ℃，120 r/min），測(cè)上清液中多酚的濃度，按照公式（4）計(jì)算解吸率。

吸附量（mg/g）=（C0-C1）×Vm。（2）

吸附率（%）=C0-C1C0×100%。（3）

解吸率（%）=C2C0-C1×100%。（4）

式中：C0為初始樣液濃度，mg/mL；C1為吸附平衡后樣液濃度，mg/mL；C2為解吸液濃度，mg/mL；V為樣液體積，mL；m為樹脂質(zhì)量，g。

1.3.4" 靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)

按照1.3.3中的靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)條件，每隔0.5 h取上清液測(cè)定溶液中多酚的含量，繪制靜態(tài)吸附和解吸動(dòng)力學(xué)曲線，然后考察進(jìn)樣液pH（2.0，3.0，4.0，5.0，6.0）和進(jìn)樣液的質(zhì)量濃度（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL）對(duì)NKA-9大孔樹脂靜態(tài)吸附效果的影響；考察乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）對(duì)NKA-9大孔樹脂靜態(tài)解吸效果的影響。

1.3.5" 動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)

精確稱取一定量（濕重）NKA-9大孔樹脂，采用濕法裝柱，填充高度20 cm，通過恒流泵控制流速，對(duì)黑果發(fā)酵果渣多酚粗提液進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，吸附平衡后按照1.0 mL/min的流速進(jìn)蒸餾水，沖去樹脂表面未被吸附的多酚和殘留的雜質(zhì)，然后用pH為3.0的70%乙醇溶液對(duì)吸附平衡后的樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)解吸?？疾焐蠘恿魉伲?.0，2.0，3.0 mL/min）對(duì)NKA-9大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附效果的影響；考察洗脫流速（1.0，1.5，2.0 mL/min）對(duì)NKA-9大孔樹脂動(dòng)態(tài)解吸效果的影響。

1.3.6" 黑果發(fā)酵果渣多酚純度的計(jì)算

按照公式（5）計(jì)算黑果發(fā)酵果渣多酚的純度。

純度（%）=C2×V2M×100%。（5）

式中：C2為解吸液中多酚濃度，mg/mL；V2為解吸液體積，mL；M為純化物凍干質(zhì)量，g。

1.3.7" 黑果發(fā)酵果渣多酚組分分析

紫外全波長掃描：參考王春燕的方法。紅外光譜掃描：參考杜碧琪的方法。

HPLC分析：采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法分析多酚純化物中的多酚成分。參考張譯文和劉小草的多酚組分鑒定方法，選取9種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC分析。ZORBAX SB-C18色譜柱；流動(dòng)相A為1.36 g磷酸二氫鉀+0.5%磷酸，流動(dòng)相B為乙腈；檢測(cè)波長280 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL。梯度洗脫方式：0～8 min（A：95%，B：5%）、8～15 min（A：60%，B：40%）、15～30 min（A：55%，B：45%）、30～40 min（A：95%，B：5%）。

1.3.8" 抗氧化活性研究

將提取液分別配制成不同濃度梯度的樣品溶液，以VC作為陽性對(duì)照。參照奎晶等的方法測(cè)定多酚的還原力；參照Sentkowska等的方法測(cè)定多酚對(duì)DPPH·的清除能力；參照段紅梅等的方法測(cè)定多酚對(duì)·OH的清除能力；根據(jù)GB/T 39100—2020的方法測(cè)定多酚對(duì)ABTS+·的清除能力。

1.3.9" 數(shù)據(jù)分析

取3次試驗(yàn)結(jié)果的平均值，利用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 2018軟件作圖，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并比較樣品平均值之間的顯著性差異。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 樹脂的確定

由圖2可知，在所選用的4種大孔樹脂中，NKA-9大孔樹脂對(duì)黑果發(fā)酵果渣多酚的吸附量為（17.70±0.02） mg/g，解吸率為（86.72±0.47）%，其吸附和解吸的效果均顯著優(yōu)于AB-8、D-101和HPD-600型大孔樹脂（Plt;0.05）。綜合試驗(yàn)情況，優(yōu)選出NKA-9作為最優(yōu)的試驗(yàn)大孔樹脂，并進(jìn)行后續(xù)的研究。

2.2" 靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1" 大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸動(dòng)力學(xué)曲線

由圖3可知，NKA-9大孔樹脂在吸附黑果發(fā)酵果渣多酚的過程中，隨著時(shí)間的增加，大孔樹脂的吸附量呈先逐漸上升后趨于平緩的趨勢(shì)，在5 h后達(dá)到平衡狀態(tài)，大孔樹脂的吸附量無明顯增加，所以選擇5 h作為黑果發(fā)酵果渣多酚的靜態(tài)吸附時(shí)間。由圖4可知，在解吸試驗(yàn)過程中，黑果發(fā)酵果渣多酚能與NKA-9大孔樹脂分離，在3 h后，解吸率達(dá)到平衡狀態(tài)。試驗(yàn)結(jié)果表明NKA-9大孔樹脂對(duì)黑果發(fā)酵果渣多酚具有良好的吸附和解吸效果。

2.2.2" 樣液pH對(duì)大孔樹脂吸附效果的影響

由圖5可知，大孔樹脂的吸附效果受樣液pH的影響。對(duì)于大孔樹脂NKA-9，樣液的pH達(dá)3.0時(shí)黑果發(fā)酵果渣多酚的吸附量達(dá)到峰值。當(dāng)pH值大于3.0時(shí)，大孔樹脂NKA-9對(duì)黑果發(fā)酵果渣多酚的吸附量、吸附率陡然下降。其原因在于黑果發(fā)酵果渣多酚化合物中含有大量酚羥基，呈酸性，因此在酸性條件下利于大孔樹脂對(duì)多酚的吸附。此外，在不同pH值條件下，溶液和NKA-9大孔樹脂的極性會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致黑果發(fā)酵果渣多酚與NKA-9大孔樹脂間的相互作用力產(chǎn)生變化。

2.2.3" 樣液濃度對(duì)大孔樹脂吸附效果的影響

樣液濃度對(duì)大孔樹脂吸附效果的影響見圖6。

由圖6可知，隨著黑果發(fā)酵果渣多酚濃度的增加，NKA-9大孔樹脂對(duì)黑果發(fā)酵果渣多酚的吸附量呈顯著上升的趨勢(shì)（Plt;0.05）。從吸附率的角度看，NKA-9大孔樹脂對(duì)黑果發(fā)酵果渣多酚的吸附率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，吸附率在樣液濃度為2.0 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值，相較于其他幾個(gè)濃度具有顯著差異（Plt;0.05）。試驗(yàn)表明高濃度的樣液會(huì)增加NKA-9大孔樹脂對(duì)黑果發(fā)酵果渣多酚的吸附量，但利用率會(huì)下降。因此從節(jié)約的角度考慮，樣液濃度選擇2.0 mg/mL。

2.2.4" 乙醇濃度對(duì)大孔樹脂解吸效果的影響

乙醇濃度對(duì)大孔樹脂解吸效果的影響見圖7。

由圖7可知，隨著乙醇濃度的升高，NKA-9大孔樹脂的解吸率呈現(xiàn)先快速升高后逐漸趨于平緩的趨勢(shì)。由于乙醇濃度的增加，導(dǎo)致溶液的極性增強(qiáng)，符合相似相溶的原理，更加有利于NKA-9大孔樹脂中多酚物質(zhì)的析出。當(dāng)乙醇濃度大于70%時(shí)，大孔樹脂解吸率的變化不明顯（Pgt;0.05），因此，解吸時(shí)乙醇的最適濃度為70%。

2.3" 動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1" 上樣流速對(duì)大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附效果的影響

固定樣液的濃度和pH值，不同流速下NKA-9大孔樹脂對(duì)黑果發(fā)酵果渣多酚的動(dòng)態(tài)吸附效果見圖8。

通常認(rèn)為，當(dāng)流出液中多酚濃度達(dá)到進(jìn)樣液中多酚濃度的10%時(shí)，即為泄漏點(diǎn)。不同流速條件下，隨著上樣體積的增加，流出液中多酚的濃度均呈現(xiàn)顯著升高的趨勢(shì)，由圖8可知，最早出現(xiàn)泄漏點(diǎn)的上樣流速為3.0 mL/min，最晚出現(xiàn)泄漏點(diǎn)的上樣流速為1.0 mL/min。原因在于過快的流速導(dǎo)致黑果發(fā)酵果渣多酚、大孔樹脂間接觸時(shí)間縮短，吸附不完全，由此說明低流速利于黑果發(fā)酵果渣多酚的吸附。然而降低流速，相應(yīng)的試驗(yàn)時(shí)間就會(huì)增加。綜合考慮，上樣流速選擇2.0 mL/min。

2.3.2" 洗脫流速對(duì)大孔樹脂動(dòng)態(tài)解吸效果的影響

不同洗脫流速對(duì)NKA-9大孔樹脂動(dòng)態(tài)解吸洗脫效果的影響見圖9。

由圖9可知，洗脫溶劑中多酚含量隨著洗脫流速的增大而降低，洗脫流速過快會(huì)使洗脫體積增加。這是因?yàn)榱魉龠^快時(shí)，洗脫溶劑與大孔樹脂的接觸時(shí)間縮短，已吸附的多酚不能及時(shí)置換出來，導(dǎo)致洗脫溶劑中多酚含量降低。當(dāng)洗脫流速為1.0 mL/min時(shí)，洗脫溶劑中多酚的含量隨著上樣體積的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)，洗脫峰比較集中，拖尾現(xiàn)象不嚴(yán)重。因此，最佳的洗脫流速為1.0 mL/min。

2.4" 純化效果及組分分析

2.4.1" 純度的測(cè)定

在pH值 3.0、樣液濃度2.0 mg/mL、上樣流速2.0 mL/min、乙醇濃度70％、洗脫流速1.0 mL/min的條件下，黑果發(fā)酵果渣多酚純度由（11.71±0.20）%提高到（62.61±0.78）%，提高了5.34倍。

2.4.2" 紫外全波長掃描結(jié)果

黑果發(fā)酵果渣多酚粗提液和純化液的紫外全波長掃描結(jié)果見圖10。

由圖10可知，黑果發(fā)酵果渣多酚的粗提液和純化液的吸收曲線極為相似，特征峰值出現(xiàn)的位置也基本一致。但是純化液的吸光值明顯高于粗提液的吸光值，說明NKA-9大孔樹脂具有很好的分離純化效果，使黑果發(fā)酵果渣多酚的純度得到明顯提高。

2.4.3" 紅外光譜掃描結(jié)果

黑果發(fā)酵果渣多酚純化物的紅外吸收光譜圖見圖11。

由圖11是可知，在3 310.47 cm-1處有吸收峰，屬于酚羥基（ArOH）的吸收峰，這是由于分子間氫鍵的相互作用使峰呈寬波浪狀，2 940.32 cm-1處的吸收峰屬于亞甲基（-CH2-）；1 710.86 cm-1處的伸縮振動(dòng)峰屬于羰基（CO），有可能是黃酮類物質(zhì)；1 450.26～1 613.01 cm-1處為芳香環(huán)的特征峰；1 180.7 cm-1處為苯并吡喃結(jié)構(gòu)（CO）的伸縮振動(dòng)峰；740.04～871.44 cm-1處的多個(gè)吸收峰屬于芳烴（CH），圖譜中這些特征吸收峰表明純化物是黑果中的多酚類化合物，說明純化效果較好。

2.4.4" HPLC分析結(jié)果

9種多酚標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖見圖12。

由圖12可知，1為原兒茶酸，2為新綠原酸，3為綠原酸，4為咖啡酸，5為蘆丁，6為金絲桃苷，7為表兒茶素沒食子酸酯，8為咖啡酸，9為槲皮素。黑果發(fā)酵果渣多酚純化物的高效液相色譜圖見圖13。

黑果多酚化合物含有較多組成成分，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖對(duì)比，可以確定黑果發(fā)酵果渣多酚純化物中含有綠原酸、金絲桃苷、蘆丁、新綠原酸、原兒茶酸、阿魏酸、表兒茶素沒食子酸酯、咖啡酸和槲皮素等成分。

2.5" 抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.5.1" 還原力的測(cè)定

由圖14可知，純化前后不同質(zhì)量濃度的黑果發(fā)酵果渣多酚樣品和VC對(duì)照樣品均對(duì)Fe3+具有一定的還原能力。質(zhì)量濃度在5～55 μg/mL之間時(shí)，F(xiàn)e3+的還原能力隨著質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)顯著增強(qiáng)的趨勢(shì)（Plt;0.05），純化后的黑果發(fā)酵果渣多酚對(duì)Fe3+的還原能力顯著高于對(duì)照組VC和純化前的黑果發(fā)酵果渣多酚（Plt;0.05）。

2.5.2" DPPH·清除率的測(cè)定

由圖15可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，DPPH·的清除能力呈顯著上升的趨勢(shì)（Plt;0.05）。質(zhì)量濃度從5 μg/mL增加到55 μg/mL時(shí)，純化前的黑果發(fā)酵果渣多酚對(duì)DPPH·的清除率從（23.79±0.11）%增至（94.89±0.43）%，純化后的黑果發(fā)酵果渣多酚對(duì)DPPH·的清除率從（41.27±0.30）%增至（96.06±0.45）%，而對(duì)照組VC對(duì)DPPH·的清除率從（34.17±0.34）%增至（96.73±0.21）%。質(zhì)量濃度小于45 μg/mL時(shí)，純化后的黑果發(fā)酵果渣多酚對(duì)DPPH·的清除率顯著高于純化前的黑果發(fā)酵果渣多酚;質(zhì)量濃度大于45 μg/mL時(shí)，試驗(yàn)組與對(duì)照組VC對(duì)DPPH·的清除能力相當(dāng)。可以看出，當(dāng)黑果發(fā)酵果渣多酚達(dá)到一定質(zhì)量濃度時(shí)，對(duì)DPPH·同樣具有很強(qiáng)的清除能力。

2.5.3" ·OH清除率的測(cè)定

由圖16可知，隨著黑果發(fā)酵果渣多酚質(zhì)量濃度的增加，·OH的清除能力呈顯著增強(qiáng)的趨勢(shì)（Plt;0.05），質(zhì)量濃度在5～55 μg/mL之間時(shí)，·OH的清除率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，純化前的黑果發(fā)酵果渣多酚對(duì)·OH的清除能力顯著高于純化后的黑果發(fā)酵果渣多酚及VC（Plt;0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度為55 μg/mL時(shí)，純化前的黑果發(fā)酵果渣多酚對(duì)·OH的清除率為（34.55±0.25）%，純化后的黑果發(fā)酵果渣多酚對(duì)·OH的清除率為（89.95±0.22）%，而VC對(duì)·OH的清除率為（34.10±0.42）%。與VC相比，黑果發(fā)酵果渣多酚具有更高的·OH清除能力。

2.5.4" ABTS+·清除率的測(cè)定

由圖17可知，隨著黑果發(fā)酵果渣多酚質(zhì)量濃度的增大，ABTS+·的清除能力增強(qiáng)；當(dāng)質(zhì)量濃度在5～55 μg/mL之間時(shí)，ABTS+·的清除能力呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)（Plt;0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度小于25 μg/mL時(shí)，純化后的黑果發(fā)酵果渣多酚對(duì)ABTS+·的清除率顯著高于純化前的黑果發(fā)酵果渣多酚及對(duì)照組VC；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到55 μg/mL時(shí)，純化前后黑果發(fā)酵果渣多酚試驗(yàn)組對(duì)ABTS+·的清除率分別為（99.01±0.03）%、（99.33±0.02）%，VC對(duì)照組對(duì)ABTS+·的清除率為（98.67±0.01）%。與VC相比，黑果發(fā)酵果渣多酚具有極好的清除ABTS+·的能力。

3" 結(jié)論

通過多酚的吸附和解吸效果，優(yōu)選出NKA-9大孔樹脂作為最佳試驗(yàn)樹脂；多酚純化的最佳工藝為樣液pH值3.0、樣液濃度2.0 mg/mL、上樣流速2.0 mL/min、乙醇濃度70%、洗脫流速1.0 mL/min，在此工藝下，多酚純度由（11.71±0.20）%提高到（62.61±0.78）%，提高了5.34倍。

黑果發(fā)酵果渣多酚純化物中含有綠原酸、金絲桃苷、蘆丁、新綠原酸、原兒茶酸、阿魏酸、兒茶素沒食子酸酯、咖啡酸和槲皮素等，其中綠原酸的含量相對(duì)較高。

當(dāng)黑果發(fā)酵果渣多酚純化物濃度為55 μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·、·OH和ABTS+·的清除率分別為（96.06±0.45）%、（89.95±0.19）%和（99.33±0.02）%，且清除自由基的能力顯著高于對(duì)照組VC；同時(shí)對(duì)Fe3+的還原能力也顯著高于對(duì)照組VC，表明黑果發(fā)酵果渣多酚具有很好的抗氧化能力。

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