化妝品中α-熊果苷等4種原料的含量測定及方法確認(rèn)

摘 要：目的：采用高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLD）同時測定美白類化妝品中α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚等4種原料的含量，分析檢測方法的準(zhǔn)確性。方法：樣品用甲醇提取，SHIMADZU Shim-pack GIST C18 柱（250 mm×4.6mm×5 μm）分離，甲醇-水流動相梯度洗脫，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。結(jié)果：α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚4種原料濃度分別為0.25～20、0.25～20、0.025～2和0.05～4 mg/L范圍內(nèi)線性良好（相關(guān)系數(shù)r＞0.999）；檢出限S/N＞3，定量限S/N＞10；在液態(tài)水基、膏霜乳液、凝膠、面膜和粉類化妝品均無4種原料檢出情況下，進(jìn)行空白基質(zhì)加標(biāo)，方法回收率范圍為95.4%～103.8%；日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD范圍為0.2%～1.8%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD范圍為0.6%～2.7%（n =6）；30批美白類化妝品中，5批檢出α-熊果苷，含量范圍在80～380 μg/g；7批檢出β-熊果苷，含量范圍在90～546 μg/g。結(jié)論：《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）第四章8.2化妝品中α-熊果苷等4種原料檢驗方法簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏，可用于美白類化妝品中α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚等4種原料的同時定量測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-熒光檢測法，化妝品，熊果苷，氫醌，苯酚

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.23.036

0 引 言

α-熊果苷又名4-羥基苯-α-D-熊果苷，β-熊果苷又名4-羥基苯-β-D-熊果苷。β-熊果苷是α-熊果苷的差向異構(gòu)體，兩者均能抑制氨酸酶活性[1-3]，用于化妝品中具有較好的美白效果[4-5]，α-熊果苷較β-熊果苷具有更好的美白效果和安全性[6-7]。但在多數(shù)化妝品標(biāo)簽上，僅標(biāo)注為熊果苷，未區(qū)分是α還是β，缺乏規(guī)范性，還因二者價格差異較大，市售化妝品標(biāo)簽甚至虛假標(biāo)注，存在實際添加熊果苷的種類與標(biāo)簽標(biāo)識不一致的現(xiàn)象，極大地?fù)p害了消費(fèi)者利益[8]。目前，我國現(xiàn)行有效的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）未明確α、β2種熊果苷的使用限度[9]。氫醌和苯酚都有良好的美白作用，但因毒性大、刺激性強(qiáng)，長期接觸有致癌風(fēng)險，所以禁用于化妝品中[10]。α、β-熊果苷是氫醌糖苷類化合物，二者在一定條件下均可降解產(chǎn)生氫醌[11-14]。歐盟消費(fèi)者安全科學(xué)委員會（SCCS）建議，化妝品中由熊果苷降解產(chǎn)生氫醌的含量應(yīng)＜1 μg/g[15-16]。因此，2種熊果苷及氫醌、苯酚的安全性及其在化妝品中的應(yīng)用現(xiàn)狀值得監(jiān)管部門的關(guān)注。為基本掌握美白類化妝品中實際添加熊果苷的種類以及毒性物質(zhì)氫醌和苯酚的含量水平，按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）第四章8.2化妝品中α-熊果苷等4種原料的檢驗方法，采用高效液相色譜-熒光檢測法對化妝品中α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚4種原料進(jìn)行同時定量測定。該檢測方法能有效區(qū)分α、β-熊果苷，且對4種原料的檢測靈敏度較高，可滿足檢測需求，也為化妝品科學(xué)監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 儀器、試劑與材料

電子天平Sartorius BT125D；電子天平SartoriusBSA224S-CW；高效液相色譜儀配熒光檢測器島津LC-20A；高速振蕩機(jī)EYELA CM-1000；離心機(jī)Thermo fisher Multifuge X1R；昆山超聲波清洗器KQ500DE。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息：α-熊果苷（上海安譜，批號236 0141，純度96.9%）；β-熊果苷（上海安譜，批號2354 678，純度9 9.70%）；氫醌（Dr.E，批號G1229980，純度99.49%）；苯酚（上海安譜，批號23556 6 4，純度99.9%）。甲醇（色譜純，Merck公司）。樣品均為市售化妝品。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液

分別稱取α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚4種原料標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg，經(jīng)甲醇溶解定容至10 mL，配制濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液

分別量取一定體積的4種原料，置于同一個10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚濃度分別為100、100、10、20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液

分別移取0.025、0.050、0.10、0.20、0.80、2.0mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得α和β-熊果苷濃度分別為0.25、0.5、1、2、8、20 μg/mL、氫醌濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.8、2 μg/mL和苯酚濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4、1.6、4 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。配制過程見表1。

2.1.4 樣品前處理

稱取樣品1.0 g（精確至0.0001 g）于15 mL離心管中，用甲醇定容至10 mL，渦旋30 s，800 W，40 kHz超聲30 min，10，000 r/min離心5 min，經(jīng)Nylon0.45μm濾膜過濾，取濾液作待測溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18（250mm×4.6 mm×5 μm）；流動相：A水-B甲醇，洗脫程序見表2。流速：0.5 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：5 μL；檢測波長：α-熊果苷、β-熊果苷激發(fā)波長及發(fā)射波長分別為292、337 nm，氫醌激發(fā)波長及發(fā)射波長分別為298、345 nm，苯酚激發(fā)波長及發(fā)射波長分別為280、318 nm。

2.3 測定及計算

分別取混合標(biāo)準(zhǔn)系列以及待測溶液進(jìn)行進(jìn)樣和色譜分析，橫坐標(biāo)為混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度，縱坐標(biāo)為峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)待測溶液，通過保留時間定性，測得峰面積后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測溶液中4種原料的濃度，按公式（1）計算樣品中4種原料的含量。

3 方法學(xué)評價及結(jié)果

3.1 線性關(guān)系

α-熊果苷和β-熊果苷的線性范圍為0.25～20mg/L，氫醌的線性范圍為0.025～2 mg/L，苯酚的線性范圍為0.1～4 mg/L，線性范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系，待測4種原料線性相關(guān)系數(shù)R 2均＞0.999。線性方程分別為Y=414267X+4067.24、Y = 4 618 2 3X +10 2 91. 6、Y = 4 0 7 757X -1214 0 . 2、Y=1.48669e+006X-706.711。

3.2 定量限

方法最低定量濃度溶液配制過程見表3。稱取基質(zhì)空白，分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液0.050、0.050、0.060、0.030 mL，置于15 mL離心管中，按樣品前處理方法得到待測溶液進(jìn)行測定。此時溶液中各組分濃度與最低定量濃度相當(dāng)，實際定量限S/N＞10，α-熊果苷、β-熊果苷的最低定量限均為5.0 μg/g，氫醌的最低定量限為0.60 μg/g，苯酚的最低定量限為0.62μg/g，滿足方法定量限要求，結(jié)果見表4。

3.3 檢出限

稱取基質(zhì)空白，加入方法最低定量濃度溶液4.00 mL，置于10 mL離心管中，按樣品前處理方法得到濾液進(jìn)行測定。此時溶液中各組分濃度與方法檢出濃度相當(dāng)，實際檢出限S/N＞3，2種熊果苷檢出限均為2.0 μg/g，氫醌檢出限為0.24 μg/g，苯酚檢出限為0.60 μg/g，滿足方法檢出限的要求，結(jié)果見表4。

3.4 精密度

分別采用4種基質(zhì)的空白加標(biāo)樣品考察方法的精密度，其中α-熊果苷和β-熊果苷的加標(biāo)濃度為20 mg/L，氫醌的加標(biāo)濃度為2 mg/L，苯酚的加標(biāo)濃度為4 mg/L。在相同條件下平行處理6份樣品，按樣品前處理方法得到濾液進(jìn)行測定，根據(jù)測定結(jié)果的RSD計算方法的峰面積和保留時間的日內(nèi)RSD。同條件下連續(xù)測6 d，得方法峰面積和保留時間的日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，用該方法處理不同類型化妝品時，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD范圍為0.2%～1.8%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD范圍為0.6%～2.7%（n = 6），此外，保留時間的日內(nèi)和日間RSD均小于0.1%，說明該方法精密度良好，見表5。

3.5 回收率

在液態(tài)水基、膏霜乳液、凝膠、面膜、粉類5種空白樣品中進(jìn)行4種化合物在3個濃度水平的加標(biāo)回收率實驗，其中α-熊果苷和β-熊果苷低、中、高3個水平的加標(biāo)濃度分別為0.25、1、20 mg/L；氫醌低、中、高3個水平的加標(biāo)濃度分為0.025、0.1、2 mg/L；苯酚低、中、高3個水平的加標(biāo)濃度分為0.05、0.2、4 mg/L，不同濃度水平樣品平行6份，按樣品前處理方法得到待測溶液進(jìn)行測定，計算平均回收率RSD。4種原料在5種基質(zhì)中的回收率范圍為95.4%～103.8%，RSD范圍為0.4%～2.6%。結(jié)果顯示，回收率及精密度（RSD）均較好，說明該方法準(zhǔn)確、靈敏，能用于多類型化妝品中4種原料的同時測定，見表6。

3.6 實際樣品分析

所測30批美白類化妝品（其中10批標(biāo)識成分中含有熊果苷，20批未標(biāo)識含4種原料），在10批標(biāo)識成分含有熊果苷的樣品中，4批檢出α-熊果苷，含量在80～380 μg/g，6批檢出β-熊果苷，含量在90～546 μg/g。20批未標(biāo)識含4種原料的樣品中，1批檢出了α-熊果苷，含量為186 μg/g ，1批檢出了β-熊果苷，含量為328 μg/g。說明美白類化妝品存在標(biāo)簽與實際配方不一致的情況。

4 結(jié) 論

通過線性關(guān)系、定量限、檢出限、精密度和回收率等多個方面，驗證了《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）第四章8.2化妝品中α-熊果苷等4種原料檢驗方法（液相色譜-熒光檢測器法），即同時測定液態(tài)水基、膏霜乳液、凝膠、面膜、粉類化妝品中的α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚的方法簡便、靈敏、快速、準(zhǔn)確，滿足化妝品日常檢測需求，可為美白類化妝品標(biāo)簽標(biāo)識的規(guī)范化管理、質(zhì)量控制和日常監(jiān)管提供技術(shù)支持。

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作者簡介

嚴(yán)倩云，碩士研究生，理化檢驗技術(shù)師，研究方向為食品及化妝品檢測。

韓曉萍，通信作者，碩士研究生，主任藥師，研究方向為藥品及化妝品檢測。

（責(zé)任編輯：袁文靜）