高溫脅迫對(duì)三倍體虹鱒血清生化指標(biāo)的影響

摘"要：為研究不同溫度（18、21、24、27 ℃）對(duì)三倍體虹鱒（Oncorhynchus mykiss）血清生化指標(biāo)的影響，選取300尾三倍體虹鱒，隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25尾，飼養(yǎng)72 h。結(jié)果表明，三倍體虹鱒在23 ℃出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，呼吸頻率升高；血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性24、27 ℃組在72 h 顯著高于18、21、24 ℃組（P＜0.05）；堿性磷酸酶（AKP）活性隨著溫度提升和時(shí)間持續(xù)而降低，18 ℃組在48、72 h 顯著高于21、24、27 ℃組（P＜0.05）；總膽紅素（T-BIL）含量隨著溫度增高而增加，在24、48、72 h 各組之間呈現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）；總蛋白（TP）、球蛋白（GLO）含量隨著溫度的增高先上升后降低；白蛋白（ALB）含量24 ℃組呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，27 ℃組呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，組內(nèi)不同時(shí)間呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。研究表明，三倍體虹鱒在23 ℃水溫刺激下表現(xiàn)出應(yīng)激性反應(yīng)，溫度高于24 ℃的階段性短期熱應(yīng)激對(duì)三倍體虹鱒肝功能具有明顯損傷，影響其生長(zhǎng)生存。

關(guān)鍵詞：虹鱒（Oncorhynchus mykiss）；高溫脅迫；血清；生化指標(biāo)

環(huán)境因子對(duì)魚類的生存狀態(tài)產(chǎn)生的壓力稱為環(huán)境脅迫^[1]。魚類是典型的變溫動(dòng)物，體溫隨環(huán)境溫度的變化而變化，承受高溫和溫度驟變的能力較差。甘肅省白銀市景泰縣采用灌溉回歸水發(fā)展虹鱒（Oncorhynchus mykiss）養(yǎng)殖，因地表徑流較長(zhǎng)，養(yǎng)殖水體早晚溫差大，8月上旬水體溫度最高達(dá)到27 ℃，使虹鱒處于高溫脅迫的狀態(tài)，影響正常生理機(jī)能發(fā)揮，甚至導(dǎo)致死亡。血液生化指標(biāo)對(duì)環(huán)境脅迫的敏感性較高，能夠指示機(jī)體在環(huán)境脅迫狀態(tài)下的生理變化特征，檢測(cè)血液生化指標(biāo)動(dòng)態(tài)是判斷魚類生理機(jī)能是否正常的重要途徑。以往的高溫脅迫對(duì)虹鱒等魚類的應(yīng)激研究，主要用急性熱應(yīng)激和持續(xù)熱應(yīng)激的方法^[2-6]。本試驗(yàn)?zāi)M景泰縣鹽堿水流水養(yǎng)殖水體溫度在高溫季的自然變化規(guī)律，對(duì)三倍體虹鱒進(jìn)行階段性高溫應(yīng)激性刺激，研究不同溫度脅迫對(duì)虹鱒機(jī)體的生化指標(biāo)的影響，為景泰縣虹鱒養(yǎng)殖提供參考。

1"材料與方法

1.1"試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)魚的飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選取個(gè)體均勻、健康無(wú)外傷的三倍體虹鱒300尾，平均體長(zhǎng)為（25.4±1.1）cm，平均體質(zhì)量為（236±9.8）g，隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25尾。分別飼養(yǎng)于12個(gè)1 200 L 的圓形玻璃鋼養(yǎng)殖池，暫養(yǎng)7 d，水溫保持在18 ℃。養(yǎng)殖設(shè)施采用上下雙層設(shè)計(jì)，上層養(yǎng)殖，下層調(diào)控溫度和補(bǔ)充新鮮水體。試驗(yàn)依據(jù)虹鱒生長(zhǎng)的適宜和脅迫溫度范圍，設(shè)置18、21、24、27 ℃ 4組，18 ℃組為對(duì)照組，21、24、27 ℃組為試驗(yàn)組。試驗(yàn)從08：00開始，持續(xù)72 h。對(duì)照組（18 ℃）保持暫養(yǎng)條件，試驗(yàn)組10：00-16：00溫度逐步升高至脅迫溫度（21、24、27 ℃）維持3 h，19：00-00：00溫度逐步降至18 ℃。試驗(yàn)期溶解氧（DO）≥6 mg/L，pH值 7.6±0.2，鹽度6.25‰，自然光照，循環(huán)水流水養(yǎng)殖。每天投喂商品飼料兩次（09：00、20：30），日投喂量為魚體重的1.5%。記錄24、48、72 h 死亡率，8、32、56 h 呼吸頻率。呼吸頻率利用攝像記錄鰓蓋一張一合狀態(tài)，用軟件剪輯出10次所用時(shí)間，換算出呼吸頻率。

1.2"樣品采集

試驗(yàn)分別于0、24、48、72 h 取樣，每個(gè)處理隨機(jī)取9尾/次。為方便取樣，取樣前用麻醉劑MS-222（40～45 mg/L）進(jìn)行麻醉。尾靜脈采血2.0 mL放入無(wú)菌離心管，于4 ℃冰箱靜置3 h 后，離心（4 ℃、3 000 r/min）10 min，取上清液放于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于之后測(cè)定血清中與肝臟生理功能相關(guān)生化指標(biāo)的含量。

1.3"血清生化指標(biāo)的測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）測(cè)試盒（C010-1-1）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT/GPT）測(cè)試盒（C009-1-1）、總蛋白（TP）測(cè)定試劑盒（A045-1-1）、白蛋白（ALB）測(cè)定試劑盒（A028-1-1）、總膽紅素（T-BIL）測(cè)定試劑盒（C019-1-1）、堿性磷酸酶（AKP）測(cè)試盒（A059-1-1）分別測(cè)量血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBIL）、堿性磷酸酶（AKP）的含量。球蛋白（GLO）通過(guò)計(jì)算所得。

1.4"數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel及SPSS 27.0進(jìn)行分析處理，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），Duncan's 法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，以P＜0.05表示差異顯著。

2"結(jié)果與分析

2.1"高溫脅迫對(duì)三倍體虹鱒存活的影響

高溫脅迫下三倍體虹鱒死亡率和呼吸頻率見(jiàn)表1。試驗(yàn)過(guò)程中，18、21 ℃組的三倍體虹鱒集群，對(duì)聲、光敏感，具有強(qiáng)搶食性。24、27 ℃組，水溫升溫至23 ℃時(shí)魚體出現(xiàn)游動(dòng)加快等異?，F(xiàn)象。24 ℃組，水溫24 ℃持續(xù)2 h 左右，魚體表現(xiàn)出激烈游動(dòng)，焦躁不安，聚于上層的行為。27 ℃組，水溫升至25 ℃以上時(shí)，魚體游動(dòng)變緩，呼吸頻率先升高后降低，死亡率增加，27 ℃組在48、72 h死亡率分別為2.7%、8.0%。21、24、27 ℃組比18 ℃組呼吸頻率分別升高1.6%、9.2%、1.9%。

2.2"高溫脅迫對(duì)三倍體虹鱒血清生化指標(biāo)的影響

由圖1可知，血清中ALT和AST活性27 ℃組顯著高于21、24 ℃組（P＜0.05），ALT活性27 ℃組在72 h 顯著高于24 ℃組（P＜0.05），AST活性27 ℃組在48 h 和72 h 顯著高于24 ℃組（P＜0.05），AST活性24 ℃組在72 h 顯著高于21 ℃組（P＜0.05）。ALT活性和AST活性21 ℃組與對(duì)照組（18 ℃）的差異性不顯著（P＞0.05）。AKP活性隨著溫度提升和時(shí)間持續(xù)而降低，對(duì)照組（18 ℃）在48、72 h 顯著高于試驗(yàn)組（21、24、27 ℃）（P＜0.05），21 ℃組在24、48、72 h顯著高于24、27 ℃組（P＜0.05）；24、27 ℃組在24、48、72 h 差異性不顯著（P＞0.05）。

由圖2可知，血清中T-BIL含量隨著溫度增高而增加， 在0 h 不會(huì)表現(xiàn)出顯著性差異（P＞0.05），而24、48、72 h 的T-BIL含量在21、24、27 ℃組比18 ℃組分別提高了1.7倍、2.1倍、5.7倍，1.4倍、2.2倍、5.3倍，2.4倍、3.7倍、7.3倍，呈現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）。TP、GLO含量隨著溫度的增高先上升后降低，溫度越高上升速度越快、上升幅度越大；TP含量在0 h 不會(huì)表現(xiàn)出顯著性差異（P＞0.05），在24、48、72 h 呈現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）;GLO含量在0、72 h 差異性不顯著（P＞0.05），在24、48 h 呈現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）。ALB含量21 ℃組與對(duì)照組（18 ℃）差異性不顯著（P＞0.05）；24 ℃組呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，在24、48、72 h 與其他組呈現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）；27 ℃組呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，在24、48、72 h 與其他組呈現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）。

3"討論

虹鱒作為甘肅省重要的水產(chǎn)品養(yǎng)殖和消費(fèi)品種，高溫環(huán)境會(huì)對(duì)其生存造成嚴(yán)重影響^[7]。當(dāng)溫度高于20 ℃時(shí)食欲減退，生長(zhǎng)減緩，一旦溫度超過(guò)24 ℃，將會(huì)逐漸失去生命體征直至死亡^[8-9]。當(dāng)溫度超過(guò)26 ℃時(shí)，虹鱒出現(xiàn)浮頭，呼吸頻率降低的現(xiàn)象^[3]。姜旭陽(yáng)等^[10]研究顯示，虹鱒的最高臨界溫度與體重的對(duì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，體重2 g 的魚體耐受最高臨界溫度29.1 ℃，120 g 的魚體耐受最高臨界溫度25.5 ℃。本試驗(yàn)?zāi)M不同溫度的養(yǎng)殖生產(chǎn)環(huán)境，采用階段性高溫對(duì)三倍體虹鱒進(jìn)行應(yīng)激性刺激，結(jié)果顯示試驗(yàn)三倍體虹鱒在23 ℃時(shí)呈現(xiàn)應(yīng)激性反應(yīng)，通過(guò)加快游動(dòng)速度尋找適宜于生長(zhǎng)生存的環(huán)境以降低高溫對(duì)魚體的刺激；隨著應(yīng)激的持續(xù)及加深，魚體通過(guò)加快呼吸頻率、上浮等行為抵抗應(yīng)激源刺激；部分魚體隨著應(yīng)激時(shí)間的累加和應(yīng)激溫度的升高，超出魚體的應(yīng)激承受范圍，造成魚體機(jī)能受損，出現(xiàn)病理狀態(tài)和死亡現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，24 ℃的短時(shí)間應(yīng)激性刺激對(duì)三倍體虹鱒魚體造成的不適生理狀態(tài)具有可恢復(fù)性。

血液成份的變化被廣泛地用來(lái)評(píng)價(jià)魚類的健康狀況、營(yíng)養(yǎng)狀況及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)狀況，是重要的生理、病理和毒理學(xué)指標(biāo)^[11]。血液ALT和AST活性的測(cè)定，已成為評(píng)價(jià)肝功能的一種重要指標(biāo)。正常情況下ALT和AST多存在于肝細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，胞漿內(nèi)的酶被大量釋放到血液中，從而引起血液中轉(zhuǎn)氨酶活性明顯升高^[12-13]。管標(biāo)等^[4]研究顯示，虹鱒在急性高溫脅迫后血清中的ALT和AST活性在恢復(fù)6 h時(shí)有顯著升高。王曉雯等^[12]有關(guān)急性熱應(yīng)激對(duì)西伯利亞鱘（Acipenser baeri）肝臟的影響研究表明，在熱應(yīng)激后，ALT和AST的活性都會(huì)有明顯的升高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，三倍體虹鱒血清中ALT和AST活性在27 ℃高溫脅迫后均顯著升高，在24 ℃高溫脅迫下隨著應(yīng)激的持續(xù)也呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)。由此推斷，高溫脅迫對(duì)三倍體虹鱒的肝臟組織造成了一定程度的損傷，對(duì)其生理功能不利。

AKP存在于魚體多種組織中，是魚體內(nèi)一種重要的調(diào)節(jié)酶，參與磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、鈣磷調(diào)節(jié)等，其含量受環(huán)境變化的影響，反映了魚類應(yīng)激狀態(tài)^[14]。管標(biāo)等^[4]研究結(jié)果表明，虹鱒在高溫脅迫以后，血清中AKP的含量明顯減少，并且在很長(zhǎng)一段時(shí)間里處在較低水平。銀鯧（Pampus argenteus）的熱應(yīng)激研究結(jié)果表明，血清AKP活性隨溫度升高呈下降趨勢(shì)^[13]。邵彥翔^[15]對(duì)石斑魚（Epinephelus spp.）的研究發(fā)現(xiàn)，ALP的含量在高溫脅迫持續(xù)進(jìn)行時(shí)顯著升高，這個(gè)結(jié)果與本試驗(yàn)對(duì)AKP測(cè)定結(jié)果不同，這可能是虹鱒和石斑魚機(jī)體之間存在差異。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，三倍體虹鱒血清中AKP的含量在高溫脅迫后顯著降低，隨著應(yīng)激時(shí)間持續(xù)而趨于穩(wěn)定，這可能是由于ALP活性偏低有助于組織細(xì)胞生理活動(dòng)處于較低水平，以適應(yīng)應(yīng)激環(huán)境。

T-BIL是直接膽紅素和間接膽紅素的總和。肝臟對(duì)膽紅素的代謝起著重要作用，間接膽紅素進(jìn)入肝細(xì)胞后與葡糖醛酸結(jié)合形成直接膽紅素，隨膽汁排入消化道。當(dāng)肝臟功能受損時(shí)，膽紅素會(huì)積聚在血液中，導(dǎo)致血清中總膽紅素升高。馮廣朋等^[16]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水溫超過(guò)中華鱘（Acipenser sinensis）幼魚的最適水溫時(shí)，總膽紅素濃度顯著升高。夏斌鵬等^[15]研究顯示，當(dāng)水溫超過(guò)24 ℃時(shí)，虹鱒總膽紅素開始急劇上升，肝臟組織出現(xiàn)代謝障礙。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，三倍體虹鱒血清中T-BIL的含量在21 ℃時(shí)就呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，水溫越高上升幅度越大，這可能是虹鱒肝臟受到損傷，出現(xiàn)膽紅素代謝障礙，導(dǎo)致血液中的膽紅素不能及時(shí)排出。

血清中含有白蛋白（ALB）和球蛋白（GLO），合稱總蛋白（TP）^[5]。TP具有維持魚體正常pH值和滲透壓，代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及免疫等功能。何福林等^[6]研究中發(fā)現(xiàn)，虹鱒血液中總蛋白的含量在14 ℃至23 ℃隨溫度升高而升高，而鳙（Hypophthalmichthys nobilis）的總蛋白在23 ℃時(shí)大幅度減少。王國(guó)成^[17]研究表明，白梭吻鱸（Sander lucioperca）血清中TP含量隨溫度的升高呈下降趨勢(shì)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，三倍體虹鱒血清中TP和GLO含量隨溫度升高呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)；ALB含量隨著應(yīng)激持續(xù)，在21 ℃時(shí)變化不大，在24 ℃呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)，在27 ℃呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。

4"結(jié)論

綜上所述，本研究表明三倍體虹鱒在23 ℃水溫的刺激下表現(xiàn)出應(yīng)激性反應(yīng)。熱應(yīng)激下，三倍體虹鱒通過(guò)加快呼吸頻率等非特異性免疫調(diào)節(jié)，提高魚體對(duì)環(huán)境壓力的抵抗能力。魚體在24 ℃以上水溫刺激下，肝功能有明顯的損害，說(shuō)明每日階段性短期熱應(yīng)激對(duì)三倍體虹鱒生長(zhǎng)生存存在影響。這些研究結(jié)果為景泰縣利用灌溉回歸水發(fā)展冷水魚養(yǎng)殖提供一定的參考，有助于養(yǎng)殖生產(chǎn)者評(píng)估熱應(yīng)激的不利影響，制定相應(yīng)的預(yù)防方案。

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Effect of high temperature stress on serum biochemical indices of triploid rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）

FU Tingbin^1，2， LAI Qifang²， ZHOU Kai²， SUN Zhen²

（1. Baiyin Animal Husbandry and Veterinary Station， Baiyin 730900， China; 2. East China Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Shanghai 200090， China）

Abstract：To study the effects of different temperatures （18， 21， 24， 27 ℃） on serum biochemical indices of triploid rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）， 300 triploid rainbow trout were randomly divided into four groups with three replicates in each group and 25 triploid rainbow trout in each replicate for 72 h. The results indicated that the triploid rainbow trout exhibited a stress response at 23 ℃， accompanied by an increase in respiratory rate. The activities of alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST） in serum of 24 and 27 ℃ groups were significantly higher than those of 18， 21 and 24 ℃ groups at 72 h （Plt;0.05）. The activity of alkaline phosphatase （AKP） decreased with the temperature increased and time continued，was significantly higher in 18 ℃ group than in 21， 24 and 27 ℃ groups at 48 h and 72 h （Plt;0.05）. The total bilirubin （T-BIL） content increased with the increase of temperature， and there was a significant difference among all groups at 24， 48 and 72 h （Plt;0.05）. The contents of total protein （TP） and globulin （GLO） initially increased and subsequently decreased with rising temperature， the albumin （ALB） content in the 24 ℃ group exhibited an upward trend， while the 27 ℃ group demonstrated a downward trend， with significant differences observed at various time points （Plt;0.05）. Research indicated that the triploid rainbow trout exhibit a stress response when exposed to water temperatures of 23 ℃， and short-term heat stress at temperatures exceeding 24 ℃ significantly impaired liver function in triploid rainbow trout， thereby affecting their growth and survival.

Key words：Oncorhynchus mykiss; high temperature stress; serum; biochemical indices

（收稿日期：2024-10-22）