硒代蛋氨酸對大口黑鱸幼魚血清、肝臟糖代謝的影響

摘"要：為探討飼料中添加硒代蛋氨酸對大口黑鱸（Micropterus salmoides）血清和肝臟糖代謝的影響，在基礎(chǔ)日糧中添加1.6 mg/kg亞硒酸鈉（C組），0.4 mg/kg（T1組）、0.8 mg/kg（T2組）、1.6 mg/kg（T3組）、3.2 mg/kg（T4組）硒代蛋氨酸（SeMet），形成5種等氮等能飼料。經(jīng)過56 d養(yǎng)殖試驗，結(jié)果顯示，膳食中添加SeMet組的糖代謝優(yōu)于亞硒酸鈉組。與對照（C組）相比，添加0.8 mg/kg SeMet能顯著降低大口黑鱸血清和肝臟葡萄糖濃度（P＜0.05），同時，糖原合成基因（gys、g3k3β）的表達和肝糖原含量也顯著下降（P＜0.05）。由此推測，SeMet可通過激活葡萄糖轉(zhuǎn)運（GLUT2）、糖酵解（GK、HK、PFK）抑制糖異生（PEPCK）來促進葡萄糖分解代謝和利用。綜上所述，添加0.8 mg/kg的SeMet可以提高大口黑鱸幼魚血清和肝臟糖代謝能力，促進大口黑鱸對碳水化合物的利用。

關(guān)鍵詞：大口黑鱸（Micropterus salmoides）；硒代蛋氨酸；肝臟；血清；糖代謝

硒（Se）是一種水產(chǎn)動物必需的微量元素，不僅能有效地清除氧化應激所產(chǎn)生的有害自由基，阻止脂質(zhì)過氧化^[1]，還是脫碘酶的活性中心，可調(diào)節(jié)代謝平衡^[2]。在自然界中，硒有兩種存在形式，有機硒和無機硒，常見的有機形式硒如：硒代蛋氨酸（SeMet）和硒代半胱氨酸；常見的無機形式硒如：亞硒酸鈉和硒酸鈉等。硒替代蛋氨酸的硫形成硒代蛋氨酸，硒代蛋氨酸已被證明是魚類極好的硒源。目前，硒作為飼料添加劑在魚類的生長性能、抗氧化能力、免疫功能中的作用已受到廣泛關(guān)注^[3]，但硒對糖代謝的影響在水生生物中研究得較少。在哺乳動物中，Pinto等^[4]證實了硒具有促進大鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運的作用；研究發(fā)現(xiàn)，硒還能調(diào)控糖原合成、糖酵解、糖異生等糖代謝關(guān)鍵酶的活性^[5]。

大口黑鱸（Micropterus salmoides），俗稱加州鱸，隸屬鱸形目（Perciformes），太陽魚科（Certrarchidae），黑鱸屬，是一種廣溫、肉食性魚類。因其適應性強、生長快、養(yǎng)殖周期短、營養(yǎng)成分豐富、肉質(zhì)鮮美，抗病力強等特點現(xiàn)已成為我國重要的淡水經(jīng)濟魚類，深受消費者喜愛^[6]。目前關(guān)于大口黑鱸飼料中添加硒的研究較少。因此，本研究旨在探究飼料中不同水平硒代蛋氨酸對大口黑鱸幼魚血清、肝臟糖代謝的影響，進行為期56 d的養(yǎng)殖試驗。本研究結(jié)果對開發(fā)更優(yōu)質(zhì)高效的大口黑鱸幼魚配合飼料有指導意義，為水產(chǎn)動物的高效健康養(yǎng)殖提供參考。

1"材料與方法

1.1"試驗設計與飼料制作

試驗飼料以魚粉、豆粕和血粉為蛋白源，魚油、豆油作為脂肪源，配制粗蛋白含量為48%、粗脂肪含量為12%的基礎(chǔ)飼料，基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)成分見表1。另外對照組在基礎(chǔ)飼料中添加1.6 mg/kg亞硒酸鈉，試驗組在基礎(chǔ)飼料中添加梯度為0.4、0.8、1.6、3.2 mg/kg的SeMet。

所有原料通過粉碎機研磨成細粉，經(jīng)80目篩過濾，逐級混勻后放入攪拌機充分混合均勻，再用膨化機擠壓膨化為直徑2.5 mm的飼料顆粒。在通風處干燥約8 h，將干燥的飼料留樣用于測定飼料營養(yǎng)成分，其余飼料儲存在-20 ℃?zhèn)溆茫缓髮Υ罂诤邝|幼魚進行8周養(yǎng)殖。分析添加無機硒（亞硒酸鈉）和不同水平的有機硒（SeMet）對大口黑鱸幼魚血清、肝臟糖代謝的影響。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2"試驗用魚與飼養(yǎng)管理試驗

大口黑鱸幼魚購于河北省唐山市灤南趙嘉莊水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司。在試驗開始前，將大口黑鱸幼魚暫養(yǎng)2周，投喂基礎(chǔ)飼料。暫養(yǎng)結(jié)束后禁食24 h，從中選取魚體健壯、規(guī)格均一（12.04 g±0.01 g）的大口黑鱸300尾，隨機分到15個養(yǎng)殖缸中，每缸20尾，并將15個養(yǎng)殖缸隨機分成5組。養(yǎng)殖試驗為期56 d，每天定時投喂2次（8：00和17：00），每次投喂體重的2%～3%，并于投喂1 h后吸底以便清除殘餌，24 h供氧。每天檢測水中氨氮、溶氧、pH值、溫度等。養(yǎng)殖期間，水中氨氮＜0.50 mg/L，溶解氧（5.90±0.61）mg/L，pH值為7.5±0.5，水溫為（25.50±1.3）℃。每天定時排污及換水，換水量為1/2。養(yǎng)殖期間記錄大口黑鱸的死亡狀況。

1.3"樣品采集

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，饑餓24 h，然后從每個缸中隨機選取9尾魚用丁香酚麻醉，將魚解剖以獲得血液和肝臟樣本，采集血液后，于4 ℃靜置12 h后4 000 r/min離心，分離血清置于-80 ℃冰箱，以備進行生化指標測定。取2 g肝臟樣品，按照1∶9加入組織勻漿液[0.02 mol/L Tris-HCl、0.25 mol/L蔗糖、2 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）、0.1 mol/L氟化鈉、0.5 mmol/L苯甲磺酰氟和0.01 mol/L β-巰基乙醇，pH 7.4]于組織研磨儀中60 Hz勻漿2 min，離心（3 000 r/min，10 min，4 ℃）得到上清，置于-80 ℃冰箱，以備進行生化指標測定。使用TRIzol試劑提取肝臟總RNA，使用Hifair"II QRT SuperMix進行qPCR去除gDNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后置于-80 ℃冰箱，以備進行肝臟基因表達檢測。

1.4"測定指標與方法

1.4.1"酶活測定"血清、肝臟葡萄糖（Glu）、己糖激酶（HK）、磷酸果糖激酶（PFK）、磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（PEPCK）活性及肝糖原含量均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.4.2"相關(guān)基因表達量測定"使用在線Primer3Plus軟件設計基因特異性引物，下載GenBank中的cDNA序列，并使用NCBI BLAST軟件對所有序列進行確認。由于沒有大口黑鱸的內(nèi)參基因序列，因此選定8個常見內(nèi)參基因（β-actin、gapdh、ef1α、18S rRNA、hprt1、b2m、tuba和tbp）來測試其轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性，以選出2個最優(yōu)內(nèi)參基因。并根據(jù)基因序列設計引物，定量RT-PCR（qPCR）的引物序列見表3。通過geNorm選擇在大口黑鱸肝臟組織中穩(wěn)定表達的β-actin和GAPDH作為內(nèi)參基因，根據(jù)2^-ΔΔCt法計算目的基因的mRNA相對表達水平。

1.5"數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并采用Duncan氏進行多重比較。結(jié)果表示為平均值±標準差（mean±SD），P＜0.05表示差異顯著。

2"結(jié)果

2.1"添加硒代蛋氨酸對大口黑鱸幼魚血清、肝臟葡萄糖含量的影響

由表3可知，添加亞硒酸鈉組（C組）的血清葡萄糖含量顯著高于其他各試驗組（P＜0.05），而添加硒代蛋氨酸的試驗組血清葡萄糖含量均無顯著差異（P＞0.05）。隨著硒代蛋氨酸濃度的提高，肝臟葡萄糖含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢；C組、T2組和T3組肝臟葡萄糖含量最低，無顯著性差異，T4組的肝臟葡萄糖含量最高。

由圖1可知，己糖激酶（HK）和磷酸果糖激酶（PFK）活性的變化趨勢相似。C組HK和PFK活性最低，T1和T2組顯著升高（P＜0.05），隨著高濃度硒代蛋氨酸的添加而出現(xiàn)下降的趨勢。相比之下，隨著添加硒代蛋氨酸濃度的增加，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，T2組PEPCK活性明顯低于其他組（P＜0.05）。T1和T2組肝糖原含量也顯著低于C組（P＜0.05），之后隨著高濃度硒代蛋氨酸的添加，肝糖原含量呈上升趨勢（P＜0.05）。

2.2"添加硒代蛋氨酸對大口黑鱸幼魚肝臟糖代謝相關(guān)基因的影響

由圖2可知，T1、T2、T3組肝臟葡萄糖激酶（GK）己糖激酶（HK）和磷酸果糖激酶（PFK）的mRNA水平顯著高于對照組（P＜0.05），硒代蛋氨酸的添加量為0.8時均為最高值（P＜0.05），T4組與C組無顯著差異（P＞0.05）。此外T2組和T4組果糖-1，6-二磷酸酶（FBPase）顯著低于其他組，葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）和PEPCK mRNA水平隨硒代蛋氨酸濃度的上升而提高，T4組為最高（P＜0.05）。添加硒代蛋氨酸還影響了葡萄糖轉(zhuǎn)運體基因（GLUT2）的mRNA表達。添加硒代蛋氨酸各組均顯著高于C組（P＜0.05）。

3"討論

相同水產(chǎn)養(yǎng)殖動物對不同硒源的硒需求量存在差異。Zhu等^[7]發(fā)現(xiàn)，以亞硒酸鈉（無機硒）為硒源時，大口黑鱸的適宜添加水平為1.60～1.85 mg/kg。因此，本研究以1.6 mg/kg無機硒（亞硒酸鈉）作為對照組硒源添加濃度。研究發(fā)現(xiàn)，有機硒相較于無機硒具有更高的生物效價和更好的效果，在飼料中的有效添加量也更低^[8]，這一結(jié)論在鯽和尼羅羅非魚中得到驗證^[9-10]。然而，虹鱒增重和生長速率在投喂添加3 mg/kg有機硒飼糧組中最高^[11]，表明3 mg/kg有機硒添加量可能對魚類生長有促進作用?；诖耍狙芯客ㄟ^設置0.4、0.8、1.6、3.2 mg/kg硒代蛋氨酸遞增的濃度，評估SeMet的劑量-效應關(guān)系，確定其對大口黑鱸幼魚的最優(yōu)添加量。

GLUT2是一種將葡萄糖從血液轉(zhuǎn)運到組織的重要蛋白質(zhì)，是葡萄糖代謝重要的一步^[12]。在本研究中，與添加亞硒酸鈉的對照組相比，添加硒代蛋氨酸顯著提高了大口黑鱸幼魚肝臟中GLUT2的相對表達，尤其是在0.4～0.8 mg/kg的添加水平下。表明添加適量的硒代蛋氨酸可以通過激活GLUT2葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白將葡萄糖轉(zhuǎn)運到肝細胞進行糖酵解。與添加硒代蛋氨酸相比，添加亞硒酸鈉未能顯著提高GLUT2表達，這可能是由于其較低的生物利用率和生物活性。糖酵解作為導致包括魚類在內(nèi)的所有生物體中葡萄糖分解代謝的唯一代謝途徑，其重要限速酶包括GK、PFK和HK^[13]。本研究表明，與添加亞硒酸鈉的對照組相比，添加硒代蛋氨酸水平為0.8 mg/kg時肝臟HK和PFK的活性顯著升高，進一步支持了硒代蛋氨酸在促進葡萄糖代謝方面的積極作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，膳食0.8 mg/kg硒代蛋氨酸對肝臟糖酵解相關(guān)基因表達的影響一致，GK、PFK和HK的相對基因表達量也顯著增加。GK可以催化葡萄糖磷酸化為葡萄糖6-磷酸，肝臟中HK和GK的缺乏可能是魚類利用碳水化合物能力低的一個原因。同樣，血中葡萄糖濃度是反映糖代謝的最直接的指標，添加硒代蛋氨酸水平為0.8 mg/kg時血清中的葡萄糖含量顯著降低，表明與添加亞硒酸鈉相比，添加適量濃度的硒代蛋氨酸可以通過提高糖酵解中關(guān)鍵限速酶的活性和基因的表達促進葡萄糖的代謝，從而更有效地利用血糖；促進水生動物對碳水化合物的利用，更好地為生物提供能量。硒代蛋氨酸還可以通過激活糖酵解途徑并逐漸減少中間產(chǎn)物，如丙酮酸（糖酵解產(chǎn)物和糖異生途徑的底物）來抑制糖異生途徑。糖異生是指非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖或糖原，G6Pase、Fbpase和PEPCK是糖異生過程中重要的限速酶。磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（PEPCK）是催化糖異生反應過程的第一步，也是最重要的關(guān)鍵限速酶^[14]。本研究結(jié)果表明，與添加亞硒酸鈉的對照組相比，添加0.4～0.8 mg/kg硒代蛋氨酸的試驗組PEPCK酶的活性顯著降低，與Tan等^[15]的研究一致，上調(diào)了肝臟糖酵解途徑中基因的表達，同時抑制糖異生途徑，有效促進雜交石斑魚利用日糧中碳水化合物的能力。但添加0.4～0.8 mg/kg的硒代蛋氨酸并未顯著降低G6Pase和PEPCK基因的相對表達，與糖異生相關(guān)酶活的趨勢并不完全一致。這是因為基因表達受mRNA和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，并且還具有時間過程依賴性，導致有些基因表達具有滯后性。此外，肝糖原含量的變化與糖異生有關(guān)，先前對水生動物的研究表明，多余的葡萄糖可以有效地轉(zhuǎn)化為糖原并儲存在肝臟中^[16]，肝臟是調(diào)節(jié)生物體葡萄糖代謝的重要組織，糖原沉積過高，會導致肝臟代謝功能異常^[17]。gys和gsk-3β是糖原合成的重要基因^[18]。在本研究中，添加0.8 mg/kg硒代蛋氨酸時肝臟gys和gsk-3β表達水平顯著低于添加亞硒酸鈉的對照組也證實了這一點，表明膳食硒代蛋氨酸促進了糖原向葡萄糖的能量供應的轉(zhuǎn)化，從而減少了糖原在大口黑鱸肝臟中的積累，而且對照組血糖的升高也會促進葡萄糖向肝糖原的轉(zhuǎn)化和沉積，在尼羅羅非魚、拉氏鱥中也出現(xiàn)類似的結(jié)果^[19-20]。

4"結(jié)論

綜上所述，飼喂適量濃度的硒代蛋氨酸可以促進大口黑鱸幼魚肝糖原含量下降，與糖代謝相關(guān)酶活性、基因表達和血清葡萄糖濃度的變化相對應。較高的硒水平通常不會對大口黑鱸的糖代謝帶來增量益處，建議大口黑鱸飼料中硒代蛋氨酸的添加量為0.8 mg/kg。

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Effects of selenomethionine on glucose metabolism in serum and liver of juvenile largemouth bass （Micropterus salmoides）

SHUAI Meiqi¹，XU Yihuan^1，2，LI Jiangtao¹，XIA Hui^1，2，GUO Ran^1，2，ZHANG Lihan^1，2

（1.Ocean College，Hebei Agricaltural University，Qinghuangdao 066003， China; 2.Hebei Key Laboratory of Aquaculture Nutritional Regulation and Disease Control，Qinhuangdao 066003， China）

Abstract：The present study was conducted to investigate the effects of dietary supplementation with selenomethionine （SeMet） on serum biochemical indices and hepatic glucose metabolism in juvenile largemouth bass （Micropterus salmoides）.The base diet was supplemented with 1.6 mg/kg sodium selenite （SodSe），0.4，0.8，1.6 and 3.2 mg/kg SeMet to form five isonitrogenous and isoenergetic diets for juvenile largemouth bass for 56 days.The results showed that the glucose metabolism with dietary SeMet supplementation was superior to that of SodSe.Adequate SeMet significantly reduced serum and liver glucose levels compared with the control group （P＜0.05）.Moreover， dietary 0.8 mg/kg SeMet could promote glucose catabolism and utilization through activation of glucose transport （GLUT2）、glycolysis （GK，HK，PFK） and inhibition of gluconeogenesis （PEPCK） compared to the control group （P＜0.05）.In contrast，the expression of glycogen synthesis genes （gys，g3k3β） and hepatic glycogen content decreased （P＜0.05）.In conclusion，these results suggested that the addition of 0.8 mg/kg SeMet can improve the glucose metabolism of largemouth bass and promote the utilisation of carbohydrates.

Key words：Micropterus salmoides; selenomethionine （SeMet）;liver; serum; glucose metabolism

（收稿日期：2024-08-30）