油莎豆水通道蛋白基因CeTIP2;1的克隆與分析

摘""要：油莎豆起源于非洲和地中海沿岸，是一種在塊莖中高水平積累油脂的新型草本油料作物。水分平衡對(duì)于塊莖的發(fā)育與代謝至關(guān)重要。液泡膜內(nèi)在蛋白（TIP）是一類液泡膜定位并具有高效水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性的水通道蛋白，包含TIP1～5等5個(gè)亞類。本研究基于油莎豆的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用RT-PCR技術(shù)對(duì)1個(gè)塊莖高水平表達(dá)的TIP基因CeTIP2;1進(jìn)行克隆。序列分析表明：CeTIP2;1的基因全長(zhǎng)3323"bp，含有2個(gè)內(nèi)含子，編碼區(qū)長(zhǎng)747"bp，編碼248個(gè)氨基酸，理論分子量為24.73"kDa，等電點(diǎn)為5.09，總平均疏水指數(shù)為0.948，脂肪族指數(shù)為114.60，不穩(wěn)定系數(shù)為21.76，屬于穩(wěn)定的酸性疏水型蛋白，與其液泡膜定位一致；該蛋白含有保守的MIP結(jié)構(gòu)域，其中包括6個(gè)跨膜螺旋、2個(gè)半螺旋以及2個(gè)典型的NPA基序。CeTIP2;1與AtTIP2;1的序列相似性高達(dá)87.20%，遠(yuǎn)高于與SoPIP2;1的46.23%。進(jìn)化分析進(jìn)一步證實(shí)，CeTIP2;1隸屬于TIP2亞類，是AtTIP2;1的直系同源基因。進(jìn)化分析同時(shí)顯示TIP2亞類早在單、雙子葉植物分化之前就已經(jīng)進(jìn)化出2個(gè)小組。表達(dá)分析顯示：CeTIP2;1在葉片、葉鞘、根、芽尖、匍匐莖、塊莖等主要組織中均有較高水平的表達(dá)，豐度最高的是塊莖和匍匐莖，最低的為芽尖；在塊莖的發(fā)育過(guò)程中，呈現(xiàn)先升后降的鐘形趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在膨大中期，最低的為成熟期。此外，CeTIP2;1還在塊莖的蛋白組中被檢測(cè)到，表明其功能的重要性。這些結(jié)果為進(jìn)一步揭示油莎豆的塊莖水分平衡機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：油料作物；塊莖；液泡膜內(nèi)在蛋白；進(jìn)化分析；表達(dá)模式

中圖分類號(hào)：S565.9""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Molecular"Cloning"and"Characterization"of"CeTIP2;1，"an"Aquaporin"Gene"from"Tigernut"（Cyperus"esculentus"L.）

ZOU"Zhi，"ZHENG"Yujiao

National"Key"Laboratory"for"Tropical"Crop"Breeding"/"Institute"of"Tropical"Biosciences"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Sanya"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China

Abstract："Tigernut"（Cyperus"esculentus"L.），"most"likely"originated"from"Africa"and"Mediterranean，"represents"a"novel"herbaceous"oil"crop"accumulating"high"levels"of"oil"in"its"underground"tubers."Water"balance"is"essential"for"tuber"development"and"metabolism"in"tigernut."Tonoplast"intrinsic"proteins"（TIPs），"which"include"five"phylogenetic"groups"（i.e."TIP1–5），"constitute"a"subfamily"of"aquaporin"facilitating"the"fast"and"passive"transport"of"water"across"vacuolar"membranes."Based"on"available"genome"and"transcriptome"data，"one"TIP"gene"named"CeTIP2;1"was"isolated"from"tigernut"tubers"by"using"the"RT-PCR"technique."Sequence"analysis"showed"that"the"full"gene"length"of"CeTIP2;1"is"3323"bp，"including"two"introns"with"a"coding"sequence"of"747"bp;"the"gene"was"predicted"to"encode"248"amino"acids"with"the"theoretical"molecular"weight"of"24.73"kDa，"the"isoelectric"point"of"5.09，"the"grand"average"of"hydropathicitynbsp;of"0.948，"the"aliphatic"index"of"114.60，"and"the"instability"index"of"21.76，"implying"its"stable，"acidic，"and"hydrophobic"features，"which"is"consistent"with"its"tonoplast-localization;"presencenbsp;of"one"conservative"MIP"domain"was"observed，"which"possesses"six"transmembrane"helices，"two"half"helices，"and"two"typical"NPA"motifs."CeTIP2;1"was"shown"to"exhibit"the"sequence"similarity"of"87.20%"with"AtTIP2;1，"which"was"considerably"higher"than"46.23%"with"SoPIP2;1."Further"phylogenetic"analysis"revealed"that"CeTIP2;1"belongs"to"the"TIP2"group"and"is"a"true"ortholog"of"AtTIP2;1."Interestingly，"the"phylogenetic"analysis"also"supported"that"TIP2"has"diverged"into"two"subgroups"sometime"before"monocot-eudicot"divergence."Tissue-specific"expression"analysis"showed"that"CeTIP2;1"was"highly"expressed"in"all"tissues"examined"in"this"study，"i.e.，"leaf，"sheath，"root，"shoot"apex，"rhizome，"and"tuber，"with"most"in"tuber/rhizome"and"lowest"in"shoot"apex."A"bell-like"expression"pattern"was"observed"during"tuber"development，"peaking"at"the"medium"stage"of"swelling"and"lowest"in"maturation."Moreover，"CeTIP2;1"was"also"detected"in"the"tuber"proteomes，"implying"its"high"abundance"and"key"roles."These"findings"would"lay"a"solid"foundation"for"further"uncovering"the"mechanism"of"water"balance"in"tigernut"tubers.

Keywords："oil"crop;"tuber;"tonoplast"intrinsic"protein;"phylogenetic"analysis;"expression"profile

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.08.004

水通道蛋白（aquaporin，"AQP）是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的膜內(nèi)在蛋白，因其高效的水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性而得名[1-2]。與動(dòng)物和微生物相比，植物AQP家族出現(xiàn)了明顯的擴(kuò)張，主要包含液泡膜內(nèi)在蛋白（tonoplast"intrinsic"protein，"TIP）、質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（plasma"membrane"intrinsic"protein，"PIP）、類根瘤26膜內(nèi)在蛋白（NOD26-like"intrinsic"protein，"NIP）、小分子堿性膜內(nèi)在蛋白（small"basic"intrinsic"protein，"SIP）和未鑒定膜內(nèi)在蛋白（X"intrinsic"protein，"XIP）等5大類[2-7]。其中，TIP定位在液泡膜，是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)水分平衡的關(guān)鍵AQP類型[8-12]。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系，TIP可進(jìn)一步分為TIP1～5等5個(gè)亞類[3-7]。

油莎豆（Cyperus"esculentus"L.），又名油莎草或虎堅(jiān)果，是一種起源于非洲和地中海沿岸的新型草本油料作物[13]。系統(tǒng)分析顯示，油莎豆隸屬于禾本目莎草科，其單套染色體的基因組大小約為225.6"Mb[14-18]。相比于傳統(tǒng)油料作物在種子中積累油脂，油莎豆是迄今唯一已知在塊莖中高水平積累油脂（24%～35%）的作物，這使其成為研究營(yíng)養(yǎng)組織油脂代謝與調(diào)控的理想模型[14，"19-21]。油莎豆具有適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高、適合機(jī)械化等特點(diǎn)，這有助于在不擠占現(xiàn)有耕地的情況下充分利用沙化邊際土地額外增加我國(guó)食用油供給，減少對(duì)國(guó)外大豆的剛性需求，進(jìn)而服務(wù)國(guó)家的戰(zhàn)略需求[22]。作為主要的經(jīng)濟(jì)器官，積極開(kāi)展塊莖的發(fā)育生物學(xué)研究具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)價(jià)值。本研究報(bào)道1個(gè)在塊莖中高水平表達(dá)的TIP基因CeTIP2;1，其中包括基因結(jié)構(gòu)、序列特征、進(jìn)化關(guān)系及表達(dá)特性，以期為下一步的功能分析及塊莖水分平衡機(jī)制的闡釋奠定基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""植物材料""本研究所用油莎豆品系為熱研3號(hào)[14]，其中，起始期（起始后1"d）、膨大中期（起始后20"d）、膨大晚期（起始后25"d）和成熟期（起始后35"d）等不同發(fā)育時(shí)期的塊莖采集于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所文昌試驗(yàn)基地[23]。

1.1.2""菌株、載體及試劑耗材""大腸桿菌（Esc h eri chia"coli）DH5α感受態(tài)和植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1301由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存；酶、試劑盒及生化試劑購(gòu)自相應(yīng)的試劑公司。

1.2""方法

1.2.1""塊莖總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄""參照文獻(xiàn)[14]，采用天根植物多糖多酚RNA提取試劑盒分別提取不同發(fā)育時(shí)期塊莖的總RNA，并采用賽默飛反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.2.2""CeTIP2;1基因的克隆與載體構(gòu)建""為鑒定油莎豆中AtTIP2;1的直系同源基因，首先從CNGBdb（https：//db.cngb.org/search/assembl y/CN A 0 051961/）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.g ov/"bi o project/703731）數(shù)據(jù)庫(kù)分別下載油莎豆的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；以AtTIP2;1作為種子，采用本地TBLASTN程序（E值設(shè)為1e–10）搜索油莎豆的基因組，并利用StringTie（v2.2.0）將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)到基因組以界定轉(zhuǎn)錄區(qū)域；根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物對(duì)CeTIP2;1F/R（AAACG GAGACC CA A CAAGCAAAAC/CAACCAAACAAC A TCAG G A A ACCA）和CeTIP2;1HF/R（A G TGGTC TCT G T CCAGTCCTATGGCAGGCATTGCTTTTGG/GGT CTCAGCAGACCACAAGTTTAGTACTCGCTGC TGGACACTGG），分別用于全長(zhǎng)cDNA的分離和植物過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建，具體的PCR反應(yīng)和載體構(gòu)建流程詳見(jiàn)文獻(xiàn)[15]。

1.2.3""序列分析""采用在線軟件GSDS（v2.0）（http：//gsds.gao-lab.org/）分析基因結(jié)構(gòu)，并分別用Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）、CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）、Plant-"mPLoc"（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/pla nt-"m ulti/）、SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin /"np sa_automat.pl？"page=/NPSA/npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/"interactive）等在線軟件分析蛋白的理化特性、保守結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.4""多序列比對(duì)與進(jìn)化分析""采用MEGA（v6.06）軟件中的MUSCLE進(jìn)行蛋白多序列比對(duì)，其中，跨膜螺旋區(qū)和保守殘基根據(jù)與已結(jié)晶AtTIP2;1[12]和菠菜（Spinacia"oleracea）SoPIP2;1[24]的序列比對(duì)進(jìn)行鑒定；進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建采用MEGA軟件中的鄰接法以及1000次自舉重復(fù)。

1.2.5""轉(zhuǎn)錄譜分析""轉(zhuǎn)錄組讀段的比對(duì)采用StringTie軟件，并用FKPM（fragments"per"kilobase"of"exon"per"million"fragments"mapped）法均一化基因在不同樣本中的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6""蛋白譜分析""油莎豆的蛋白組數(shù)據(jù)下載于ProteomeXchange/PRIDE（https：//www.ebi.ac.uk/"pride/archive/projects/PXD021894），質(zhì)譜數(shù)據(jù)的檢索與分析采用Proteome"Discoverer（v2.4.1.15）軟件。

1.2.7""熒光定量分析""參照文獻(xiàn)[17]，以CeUCE2作為內(nèi)參，應(yīng)用引物對(duì)CeTIP2;1Fq/Rq（TCG TCATATTCAGCCCGGTGC/GGGTGCTTACCGGTAAGGTACTTG）進(jìn)行熒光定量分析，每樣本3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3""數(shù)據(jù)處理

采用SPSS"20軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用鄧肯單因素多樣本差異顯著性進(jìn)行方差分析。

2""結(jié)果與分析

2.1""CeTIP2;1基因的克隆與序列分析

通過(guò)同源搜索，從油莎豆基因組的Scaffold27鑒定1個(gè)AtTIP2;1同源基因，二者在蛋白水平的序列相似性高達(dá)87.20%，將其命名為CeTIP2;1。CeTIP2;1基因的全長(zhǎng)為3323"bp，包含2個(gè)內(nèi)含子，5'和3'"UTR分別為307"bp和1956"bp（圖1A）。隨后，采用RT-PCR技術(shù)對(duì)其747"bp的編碼區(qū)序列進(jìn)行分離，并成功構(gòu)建了植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1301-CeTIP2;1，桑格測(cè)序未發(fā)現(xiàn)堿基差異。進(jìn)一步的序列分析顯示，CeTIP2;1編碼區(qū)的GC含量為56.76%，編碼248個(gè)氨基酸，理論分子量為24.73"kDa，等電點(diǎn)為5.09，總平均疏水指數(shù)為0.948，脂肪族指數(shù)為114.60，不穩(wěn)定系數(shù)為21.76，屬于穩(wěn)定的酸性疏水型蛋白，這與AtTIP2;1類似，但不同于SoPIP2;1的堿性特性（表1）。CDD分析顯示，CeTIP2;1的14～231位為保守的MIP結(jié)構(gòu)域（圖1B）。雖然CeTIP2;1與SoPIP2;1的序列相似性僅為46.23%，但都擁有如圖1C所示的6個(gè)跨膜螺旋（TM1～6）、2個(gè)半螺旋（HB和HE）以及2個(gè)典型的NPA基序。CeTIP2;1的ar/R選擇性濾器為H-I-G-R，與AtTIP2;1一致，但不同于SoPIP2;1的F-H-T-R；CeTIP2;1的Froger位點(diǎn)為T-S-A-Y-I，不同于AtTIP2;1的T-S-A-Y-W和SoPIP2;1的M-S-A-F-W。與SoPIP2;1相比，CeTIP2;1和AtTIP2;1具有較短的N端，且僅含有對(duì)應(yīng)于SoPIP2;1"S96的磷酸化位點(diǎn)；CeTIP2;1的連環(huán)C含有1個(gè)對(duì)應(yīng)于AtTIP2;1"H131的組氨酸，而SoPIP2;1的相應(yīng)位點(diǎn)為N（圖1C）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，CeTIP2;1定位在液泡膜。CeTIP2;1的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，分別占37.90%和36.29%，這與AtTIP2;1和SoPIP2;1類似（表1）?；贏tTIP2;1的同源建模顯示，CeTIP2;1可形成同源四聚體，每個(gè)單體含有6個(gè)跨膜螺旋（圖1D）。

2.2""進(jìn)化分析

為進(jìn)一步鑒定CeTIP2;1的進(jìn)化關(guān)系，本研究將其與已報(bào)道的10個(gè)OsTIP和10個(gè)AtTIP構(gòu)建了無(wú)根進(jìn)化樹(shù)。如圖1E所示，21個(gè)TIP被聚為5組，即TIP1～5。TIP1明顯聚成2個(gè)分支，其中一支包括OsTIP1;1、AtTIP1;1和AtTIP1;2，另一支包括OsTIP1;2和AtTIP1;3；TIP2也聚成2個(gè)分支，其中一支包括CeTIP2;1、OsTIP2;2和AtTIP2;1，另一支包括OsTIP2;1、AtTIP2;2和AtTIP2;3，表明TIP1和TIP2早在單、雙子葉植物分化之前就已經(jīng)進(jìn)化成2個(gè)小組。與此相反，TIP3按物種聚在一起，這與AtTIP1;1/1;2、AtTIP2;2/-2;3和OsTIP4-1/4-2/4-3類似，表明這些基因在單雙子葉植物分化之后產(chǎn)生。綜上，這些結(jié)果表明CeTIP2;1屬于AtTIP2;1和OsTIP2;2的直系同源基因。

2.3""CeTIP2;1的組織特異性分析

為揭示CeTIP2;1在不同組織中的表達(dá)特性，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析其在幼嫩葉片、成熟葉片、葉鞘、根、芽尖、匍匐莖、塊莖等主要組織中的表達(dá)模式。如圖2A所示，CeTIP2;1在所有組織中均有較高水平的表達(dá)，其中，表達(dá)豐度最高的是塊莖和匍匐莖，其次是葉鞘、幼嫩葉片、成熟葉片和根，最低的是芽尖。

2.4""CeTIP2;1在不同發(fā)育時(shí)期塊莖中的表達(dá)模式

為揭示基因表達(dá)與塊莖發(fā)育的關(guān)系，采用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)一步分析CeTIP2;1在起始期、膨大中期、膨大晚期和成熟期等4個(gè)典型發(fā)育時(shí)期塊莖中的表達(dá)模式。如圖2B所示，結(jié)果表明基因在膨大中期的表達(dá)豐度最高，極顯著高于起始期和膨大晚期，而在成熟期的豐度最低。

2.5""CeTIP2;1在不同組織中的蛋白定量

為揭示CeTIP2;1在不同組織中的蛋白豐度，研究進(jìn)一步分析了油莎豆的蛋白組數(shù)據(jù)，即葉片、根、新鮮收獲的成熟塊莖（RT）、脫水塊莖（DT）、吸水48"h塊莖（RT）和萌發(fā)塊莖（ST）。如圖2C所示，結(jié)果表明CeTIP2;1在根中的豐度最高，顯著高于吸水48"h塊莖，而在萌發(fā)塊莖中的豐度最低；蛋白在塊莖的脫水、吸水過(guò)程中差異不顯著，豐度與葉片相當(dāng)。

3""討論

細(xì)胞膜定位的PIP和液泡膜定位的TIP是調(diào)控植物細(xì)胞水分平衡的主要AQP類型[2，"8]。相比于PIP，TIP高度分化，其在高等植物中至少存在5個(gè)亞類，且其決定底物特異性的ar/R選擇性濾器明顯呈現(xiàn)多樣化[3-7]。根據(jù)ar/R選擇性濾器的類型及殘基特性，BANSAL等[25]將擬南芥、水稻和玉米中的TIP歸為三大主要類型，第一類包含TIP1（H-I-A-V），第二類包含TIP2、TIP3和TIP4（H-I/M/V-G/A/S-R），第三類包含TIP5（N-V-G-C）。

本研究報(bào)道了在油莎豆塊莖中高水平表達(dá)的TIP基因CeTIP2;1，其編碼蛋白包含AQP家族特有的MIP結(jié)構(gòu)域，理化特性與AtTIP2;1高度相似，屬于穩(wěn)定的酸性疏水型蛋白。CeTIP2;1可歸為TIP2亞類，主要依據(jù)如下：首先，CeTIP2;1與AtTIP2;1和OsTIP2;2的序列相似性在87%以上；其次，3個(gè)蛋白在進(jìn)化分析中聚在一起，并獨(dú)立于OsTIP2;1、AtTIP2;2和AtTIP2;3。這些證據(jù)表明CeTIP2;1是AtTIP2;1的直系同源基因，而非AtTIP2;2和AtTIP2;3。根據(jù)先前的比較基因組學(xué)分析，與AtTIP3;1和AtTIP3;2一樣，AtTIP2;2和AtTIP2;3起源于蕓薹屬特有的α全基因組重復(fù)[5，"26]。因?yàn)锳tTIP2;1和AtTIP2;2/-2;3在水稻中都存在直系同源基因，暗示基因分化發(fā)生在單、雙子葉植物分化之前，這與TIP1類似[27]。也就是說(shuō)，在目前鑒定的5個(gè)TIP亞類中，TIP1和TIP2早在單、雙子葉植物分化之前就發(fā)生了進(jìn)一步的分化，因此，從進(jìn)化角度講，單、雙子葉植物中的TIP分為7個(gè)亞類更為適合?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，CeTIP2;1含有2個(gè)內(nèi)含子，其內(nèi)含子數(shù)量和位置與AtTIP2;1和OsTIP2;2完全一致[3-4]，表明進(jìn)化的保守性。CeTIP2;1含有2個(gè)典型的NPA基序，ar/R選擇性濾器為H-I-G-R，且其連環(huán)C含有1個(gè)保守的H殘基，這與AtTIP2;1和OsTIP2;2完全一致，表明其具有類似的生物學(xué)功能。在蟾蜍卵母細(xì)胞和酵母體系中功能分析顯示，AtTIP2;1和OsTIP2;2可轉(zhuǎn)運(yùn)水分、尿素和氨[10，"12，"28-29]。CeTIP2;1的重要性還體現(xiàn)在其泛組織、高水平表達(dá)。由于現(xiàn)有蛋白組技術(shù)的靈敏性，一般只有較高豐度的蛋白才能檢測(cè)到。先前研究表明，NIEMEYER等[30]采用nanoLC-MS/MS技術(shù)對(duì)45個(gè)樣本進(jìn)行了蛋白組分析，合計(jì)僅檢測(cè)到2257個(gè)蛋白。本研究的定量分析顯示，CeTIP2;1在葉片、根和4個(gè)時(shí)期的塊莖中均被檢測(cè)到，表明其在這些組織中的高水平表達(dá)。事實(shí)上，組織特異性分析顯示CeTIP2;1是1個(gè)泛組織表達(dá)基因，其在塊莖中的高水平表達(dá)與塊莖的高含水量及活躍的生理代謝是相適應(yīng)的。據(jù)前期研究結(jié)果表明，油莎豆塊莖發(fā)育早期的含水量一致維持在85%左右，在膨大晚期和成熟期逐漸降低到75%和45%[23]。CeTIP2;1在塊莖發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式與水分含量趨勢(shì)基本一致，峰值出現(xiàn)在膨大中期，而在膨大晚期和成熟期逐漸降低。CeTIP2;1在成熟期的顯著下調(diào)可能與其蛋白組中豐度低于根組織有關(guān)。

綜上，本研究報(bào)道了1個(gè)油莎豆TIP2基因CeTIP2;1，該基因含有2個(gè)內(nèi)含子，屬于AtTIP2;1的直系同源基因。該基因在不同組織中均高水平表達(dá)，與這些組織特別是塊莖的水分平衡密切相關(guān)，這為下一步的功能分析及油莎豆水分平衡機(jī)制的闡釋奠定基礎(chǔ)。

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