拮抗鏈霉菌R2A-15發(fā)酵條件優(yōu)化及其活性穩(wěn)定性分析

摘""要：柑橘是我國最重要的水果之一，其采后發(fā)生的柑橘綠霉病嚴重威脅柑橘的質量安全，而且還會引起果品中真菌毒素的污染。本團隊從廣東省湛江市廉江九洲江紅橙園的紅橙植株根部土壤中，分離篩選出一株對柑橘綠霉病病原菌具有良好拮抗作用的鏈霉菌R2A-15，對其進行發(fā)酵條件優(yōu)化和抑菌活性穩(wěn)定性分析，為柑橘綠霉病生防菌劑的制備與應用提供參考。本研究以指狀青霉（Penicillium"digitatum）為靶標菌，根據(jù)紙片擴散法的抑菌圈直徑大小判斷發(fā)酵液抑菌活性。采用單因素和交叉組合試驗優(yōu)化菌株R2A-15發(fā)酵培養(yǎng)基，通過響應面分析法對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，提高發(fā)酵液抑菌活性，并對發(fā)酵液進行不同的酸堿、溫度和紫外線條件的穩(wěn)定性研究。在單因素試驗和交叉組合試驗中，菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源為玉米面，最適氮源為酸水解酪蛋白。根據(jù)響應面分析法，得出玉米面和發(fā)酵時間對發(fā)酵液抑菌活性有顯著影響。經驗證試驗得出，最大的發(fā)酵液抑菌活性的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為：玉米面12.09"g，酸水解酪蛋白4.00"g，碳酸鈣2.00"g，硫酸鎂2.00"g，磷酸氫二鉀2.00"g，氯化鈉1.00"g，蒸餾水1"L；最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵初始pH"7.0、發(fā)酵時間37.50"h、發(fā)酵溫度34"℃、接種量3%、搖瓶裝液量100"mL/250"mL。菌株發(fā)酵液抑菌活性優(yōu)化后比優(yōu)化前提高了39%。菌株發(fā)酵液經過不同的溫度和紫外線條件處理后，整體抑菌活性能維持在一個相對穩(wěn)定的高活性水平上，但在強酸強堿條件下，發(fā)酵液抑菌活性有所下降。結果表明，鏈霉菌R2A-15對柑橘綠霉病病原菌具有較好的穩(wěn)定抑菌效果，有較好的實際應用前景，為后期規(guī)模化發(fā)酵以及菌劑的開發(fā)奠定基礎。

關鍵詞：指狀青霉；鏈霉菌R2A-15；抑菌活性；發(fā)酵優(yōu)化；穩(wěn)定性中圖分類號：S436.6""""""文獻標志碼：A

Optimization"of"Fermentation"Conditions"and"Analysis"of"Activity"Stability"of"Antagonist"Streptomyces"sp."R2A-15

LIANG"Jiazhen，"GUO"Jiayong，"YANG"Zhengyun，"LUO"Wan，"LUO"Dongcheng，"YANG"Chunmin，"LI"Yu，"XIE"Yuxuan*

Guangzhou"College"of"Technology"and"Business，"Foshan，"Guangdong"528135，"China

Abstract："Citrus"is"one"of"the"most"important"fruits"in"China，"and"its"post-harvest"occurrence"of"citrus"green"mold"is"a"serious"threat"to"the"quality"and"safety"of"citrus，"and"also"causes"mycotoxin"contamination"in"the"fruit."A"strain"of"Streptomyces"sp."R2A-15"with"good"antagonistic"effect"on"the"pathogen"of"citrus"green"mold"was"isolated"from"the"root"soil"of"red"orange"plants"in"the"red"orange"orchard"of"Jiuzhoujiang，"Lianjiang，"Zhanjiang"city，"Guangdong"province."The"optimization"of"the"fermentation"conditions"and"stability"analysis"of"the"bacterial"inhibition"activity"were"studied"to"provide"reference"for"the"preparation"and"application"of"the"biocontrol"agent"of"citrus"green"mold."In"this"study，"Penicillium"digitatum"was"used"as"the"target"fungus，"and"the"fermentation"broth"was"used"as"the"inhibitory"activity"according"to"the"size"of"the"diameter"of"the"inhibition"zone"by"paper"diffusion"method."The"fermentation"medium"of"strain"R2A-15"was"optimized"using"one-way"and"cross-combination"tests，"and"the"fermentation"conditions"were"optimized"by"response"surface"analysis"to"improve"the"inhibitory"activity"of"the"fermentation"broth，"and"the"stability"of"the"fermentation"broth"was"investigated"under"different"acid-base，"temperature"and"ultraviolet"light"conditions."The"optimum"carbon"source"for"the"fermentation"medium"of"the"strain"was"cornmeal"and"the"optimum"nitrogen"source"was"acid-hydrolyzed"casein"in"the"one-way"and"cross-combination"tests."Based"on"response"surface"analysis，"it"was"concluded"that"cornmeal"and"fermentation"time"had"a"significant"effect"on"the"bacteriostatic"activity"of"the"fermentation"broth."The"optimal"fermentation"medium"for"maximum"inhibitory"activity"of"the"fermentation"broth，"as"determined"by"validation"tests，"was"12.09"g"of"cornmeal，"4.00"g"of"acid-hydrolyzed"casein，"2.00"g"of"calcium"carbonate，"2.00"g"of"magnesium"sulfate，"2.00"g"of"dipotassium"hydrogen"phosphate，"1.00"g"of"sodium"chloride，"and"1"L"of"distilled"water."The"optimal"fermentation"conditions"were："initial"fermentation"pH"7.0，"fermentation"time"37.50"h，"fermentation"temperature"34"℃，"inoculum"volume"3%，"and"shake"flask"filling"volume"100"mL/250"mL."The"bacteriostatic"activity"of"the"fermentation"broth"of"the"strains"increased"by"39%"after"optimization."The"overall"bacteriostatic"activity"of"the"fermentation"broth"of"the"strain"could"be"maintained"at"a"relatively"stable"and"high"activity"level"after"treatment"with"different"temperatures"and"ultraviolet"light"conditions，"but"the"bacteriostatic"activity"of"the"fermentation"broth"decreased"under"strong"acid"and"alkali."The"results"indicate"that"Streptomyces"sp."R2A-15"has"a"good"and"stable"inhibitory"effect"on"the"citrus"green"mold"pathogen，"and"has"a"good"prospect"for"practical"application，"which"lays"a"foundation"for"the"later"scale"fermentation"as"well"as"the"development"of"bacterial"agents.

Keywords："Penicillium"digitatum;"Streptomyces"sp."R2A-15;"antibacterial"activity;"fermentation"optimization;"stability

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.08.018

放線菌是自然界中普遍存在的一類微生物，其存在于土壤、空氣和水中，尤其是在含水量較低、有機物含量較高的中性或弱堿土壤中。它們是一種重要的生物資源，可以產生新的活性物質[1-2]。近幾年，以放線菌為材料，制備微生物菌劑是防治植物病害的研究熱點[3-4]。據(jù)研究報道，放線菌發(fā)酵液對黃瓜枯萎病菌（Fusarium"oxysporum"f."sp."cucumerinum）[5]、大豆斑疹病菌（Xantho monas"axonopodis"pv."glycines）[6]、水稻白葉枯病菌（Xanthomonas"oryzae"pv."oryzae）[7]等植物病原菌具有良好的抑菌活性。隨著人們對食品安全越來越重視，農用抗生素放線菌的篩選與利用已成為當前農業(yè)微生物領域的一個重要課題[8-9]。

指狀青霉（Penicillium"digitatum）感染所致的柑橘綠霉病是柑橘采后中最為普遍的一種病害，每年成熟時都會導致大量的霉爛，給柑橘產業(yè)造成巨大的經濟損失。傳統(tǒng)的控制手段主要是利用化學農藥，但是化學農藥會帶來農藥殘留、環(huán)境污染、病原菌抗性和長期使用后藥效下降等問題[10]。而利用拮抗微生物的生物防治方法具有安全、環(huán)保、經濟效益高等優(yōu)點，本團隊從廣東省湛江市廉江紅橙植株根部土壤中分離篩選出的1株放線菌R2A-15對指狀青霉具有較好拮抗作用。采用16S"rRNA基因序列測定初步鑒定該菌株為弗吉尼亞鏈霉菌（Streptomyces"virginiae），相似性為99.29%。本團隊將進一步對菌株R2A-15開展試驗，以發(fā)酵液的抑菌活性為標準找出最優(yōu)發(fā)酵條件，為其進一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""供試菌株和病原真菌""從廣東省湛江市廉江九洲江紅橙園紅橙植株根部土壤分離篩選出拮抗鏈霉菌Streptomyces"sp."R2A-15。

指狀青霉（Penicillium"digitatum）由西南大學食品科學學院曾凱芳教授惠贈。

1.1.2""培養(yǎng)基""菌株生長培養(yǎng)基：ISP4培養(yǎng)基[11]。菌株發(fā)酵培養(yǎng)基：ISP1培養(yǎng)基、ISP2培養(yǎng)基、ISP3培養(yǎng)基、ISP4培養(yǎng)基、ISP5培養(yǎng)基、ISP6培養(yǎng)基、ISP7培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基[12]和改良高氏二號培養(yǎng)基?；钚詸z測培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[13]。

改良高氏二號培養(yǎng)基：葡萄糖1.00"g，蛋白胨0.50"g，胰蛋白胨0.30"g，氯化鈉0.50"g，蒸餾水1"L，pH"7.0。

1.2""方法

1.2.1""培養(yǎng)條件""菌種活化：將保存的菌種轉接到ISP4固體培養(yǎng)基中，28"℃培養(yǎng)5"d。

種子液制備：用直徑8"mm的無菌打孔器打取3個菌餅接種于ISP4液體培養(yǎng)基中，裝液量為100"mL/250"mL，在28"℃、180"r/min下培養(yǎng)3"d，作為種子液[14]。

初始搖瓶發(fā)酵：將5%接種量的種子液加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為100"mL/250"mL，28"℃、180"r/min，培養(yǎng)5"d[15]。

1.2.2""發(fā)酵液抑菌活性檢測""收集發(fā)酵上清液，以3000"r/min離心15"min，用0.22"μm的微孔濾膜過濾，用紙片擴散法測量抑菌圈的直徑。在PDA固體培養(yǎng)平板涂布接種0.20"mL指狀青霉菌懸液。用無菌鑷子將濾紙片（直徑6"mm）平整貼在平板表面，再在濾紙片上滴加20"μL發(fā)酵濾液。在28"℃培養(yǎng)3"d，測量抑菌圈的直徑，并重復3次試驗。

1.2.3""菌株R2A-15發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化""向250"mL三角瓶中分別加入1.1.2中的9種不同的100"mL液體培養(yǎng)基，進行搖瓶發(fā)酵，參照1.2.2的方法測定抑菌活性，從中選擇最優(yōu)培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基[16-17]。

采用單因素試驗法，在基礎培養(yǎng)基上，分別選用硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨、魚蛋白胨、酸水解酪蛋白、酵母提取物、大豆粉和麥芽粉作為氮源[18]；分別選用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、淀粉、小米、玉米面、大米和燕麥片作為碳源[19]。參照1.2.2的方法測定抑菌活性，篩選出最優(yōu)的3種氮源和碳源。

采用交叉組合試驗，將最優(yōu)的3種氮源和碳源進行交叉組合，參照1.2.2的方法測定抑菌活性，確定最優(yōu)的氮源、碳源組合作為最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方[20]。

1.2.4""菌株R2A-15發(fā)酵條件的優(yōu)化""在確定了最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方之后，參照1.2.2的方法，對菌株R2A-15在不同發(fā)酵條件下的發(fā)酵液進行指狀青霉的抑菌活性的測定，確定最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)[21-23]。在28"℃，250"mL三角瓶，180"r/min搖床培養(yǎng)，選取不同的發(fā)酵初始pH[24-26]：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；不同的發(fā)酵時間：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10"d；不同的發(fā)酵溫度：22、24、26、28、30、32、34、36、38"℃；不同的接種量：1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%；不同的搖瓶裝液量：25、50、75、100、125"mL。

1.2.5""影響發(fā)酵液抑菌活性的關鍵因子篩選""采用Minitab20軟件，根據(jù)單因素試驗所得各因素的范圍，對發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)條件中的7個因素進行Plackeett-Burman試驗設計[27]，每個因素選取高、低2個水平，以發(fā)酵液抑菌活性為響應值進行試驗次數(shù)為12次的試驗設計。根據(jù)試驗設計方案，對其進行發(fā)酵培養(yǎng)，并對其抑菌活性進行測定。通過對試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，找出對發(fā)酵液具有顯著抑菌活性的關鍵因子。

1.2.6""最陡爬坡試驗""根據(jù)抑菌效應的正負，對發(fā)酵液具有顯著抑菌活性的關鍵因子進行最陡爬坡試驗。正效應則提高因子水平，負效應則降低因子水平，并找到活性最高的區(qū)域。以響應面中心復合試驗的中心點，選取發(fā)酵液抑菌活性最高的處理條件為研究對象。

1.2.7""響應面設計試驗""在最陡爬坡試驗的基礎上，開展中心復合設計（CCD）試驗，得到二次多項回歸方程，對各因素進行分析，尋找最優(yōu)值，對最優(yōu)的發(fā)酵液抑菌活性進行預測。

1.2.8""驗證試驗""在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件基礎上，對該菌株的抑菌活性進行檢測，并對其進行驗證和可靠性分析，從而獲得該菌株最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件。

1.2.9""發(fā)酵液的抑菌活性穩(wěn)定性測定""取離心后的發(fā)酵上清液10"mL，分別在4、10、20、30、40、50、60"℃處理1"h，以未經處理的發(fā)酵液作為對照[28-29]，參照1.2.2的測定方法測定抑菌活性。

取離心后的發(fā)酵上清液10"mL，用1"mol/L的HCl和1"mol/L的NaOH將pH調為2.0、4.0、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0，在室溫放置1"h后，將pH調為原始值，以未經處理的發(fā)酵液作為對照，參照1.2.2的測定方法測定抑菌活性。

取離心后的發(fā)酵上清液10"mL，分別置于波長254"nm，功率30"W的紫外燈下20"cm處照射1、2、3、4、5、6、7、8、9"h，以未經處理的發(fā)酵液為對照，參照1.2.2的測定方法測定抑菌活性。

1.3""數(shù)據(jù)處理

結果以平均值±標準差表示。原始數(shù)據(jù)用Excel"2010軟件整理處理后，采用統(tǒng)計學軟件SPSS"25.0進行顯著性分析。

2""結果與分析

2.1""菌株R2A-15發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

通過對9種不同的液體培養(yǎng)基發(fā)酵液進行抑菌活性檢測，結果見圖1。抑菌活性較強的培養(yǎng)基分別有ISP2、ISP4和ISP6，3種培養(yǎng)基發(fā)酵液對靶標菌的抑菌圈平均直徑均為10.00"mm以上。其中ISP4培養(yǎng)基對靶標菌抑菌活性最優(yōu)，抑菌圈平均直徑為10.47"mm，因此基于ISP4培養(yǎng)基進行后續(xù)氮源、碳源組合的優(yōu)化。

在ISP4基礎培養(yǎng)基中分別選用9種不同氮源對菌株R2A-15進行發(fā)酵培養(yǎng)，結果見圖2。選用硫酸銨、蛋白胨和酸水解酪蛋白分別作為氮源時，3種發(fā)酵液對靶標菌的抑菌圈平均直徑分別10.53、10.32、10.88"mm，具有較強的抑菌活性。3種氮源發(fā)酵液抑菌圈平均直徑排序為酸水解酪蛋白gt;硫酸銨gt;蛋白胨，初步確定酸水解酪蛋白、硫酸銨和蛋白胨為菌株R2A-15最優(yōu)的發(fā)酵氮源。

在ISP4基礎培養(yǎng)基中分別選用10種不同碳源對菌株R2A-15進行發(fā)酵培養(yǎng)，結果見圖3。選用小米、玉米面和燕麥片作為碳源時，3種發(fā)酵液對靶標菌的抑菌圈平均直徑分別達到10.66、11.29、10.84"mm，具有較強的抑菌活性。3種碳源發(fā)酵液抑菌圈平均直徑排序為玉米面gt;燕麥片gt;小米，初步確定玉米面、燕麥片和小米為菌株R2A-15最優(yōu)的發(fā)酵碳源。

根據(jù)篩選獲得的最優(yōu)氮源、碳源進行交叉組合對菌株R2A-15進行發(fā)酵培養(yǎng)，結果見表1。選用酸水解酪蛋白和玉米面的組合抑菌活性最優(yōu)，抑菌圈平均直徑為11.35"mm，其次是硫酸銨和玉米面的組合，抑菌圈平均直徑為11.23"mm。因此選擇酸水解酪蛋白和玉米面作為菌株R2A-15發(fā)酵的最優(yōu)氮源、碳源組合。

2.2""菌株R2A-15發(fā)酵條件的優(yōu)化

菌株R2A-15發(fā)酵液的抑菌活性隨發(fā)酵初始pH的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，結果見圖4。當pH為7.0時該菌株發(fā)酵液抑菌活性最優(yōu)，抑菌圈平均直徑達到11.40"mm。該菌株在pH為10.0時無活性，pH為5.0時抑菌活性明顯下降，說明菌株R2A-15不宜在強酸堿性環(huán)境中產生活性物質。因此確定pH為7.0是菌株R2A-15的最優(yōu)發(fā)酵初始pH。

菌株R2A-15發(fā)酵液的抑菌活性隨發(fā)酵時間的增長呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，結果見圖5。第2天的發(fā)酵液抑菌活性最優(yōu)，其抑菌圈平均直徑為12.30"mm。因此確定發(fā)酵時間為2"d是菌株R2A-15的最優(yōu)發(fā)酵時間。

高而增強，結果見圖6。在34"℃下對靶標菌的抑菌圈平均直徑為12.90"mm，抑菌活性最優(yōu)。在34"℃以上，其發(fā)酵液的抑菌活性明顯下降，38"℃時對靶標菌無抑菌活性，說明菌株R2A-15不宜在高溫環(huán)境下產生活性物質。因此確定34"℃是菌株R2A-15的最優(yōu)發(fā)酵溫度。

菌株R2A-15發(fā)酵液的抑菌活性隨接種量的增多呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，結果見圖7。當接種量為3%時該菌株發(fā)酵液對靶標菌的抑菌活性最優(yōu)，抑菌圈平均直徑為11.78"mm。低于或超過此量均會使菌株R2A-15的抑菌活性降低。隨著接種量的增加，菌株的代謝物含量有所提高，抑菌活性能力增強。然而，當接種量超過3%時，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質有限，不利于細胞活性成分的生成，導致抑菌活性下降。因此確定接種量為3%是菌株R2A-15的最優(yōu)接種量。

菌株R2A-15發(fā)酵液的抑菌活性隨裝液量的增多呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，結果見圖8。當裝液量為100"mL時該菌株發(fā)酵液抑菌活性最優(yōu)，抑菌圈平均直徑為11.57"mm。錐形瓶中營養(yǎng)物質的增加使菌株R2A-15產生活性物質的能力更強，但液體體積逐漸增加后，錐形瓶中的氧含量逐漸降低，從而影響活性物質的產生能力。因此確定裝液量為100"mL是菌株R2A-15的最優(yōu)裝液量。

2.3""影響發(fā)酵液抑菌活性的關鍵因子篩選

以單因素試驗得到的7個因子范圍為基礎，對7個因子選取高低兩水平，設計見表2。按照Plackett-Burman試驗對7個因子高低兩水平設計，進行12次試驗檢測發(fā)酵液抑菌活性，結果見表3。

采用Minitab"20軟件，將發(fā)酵液的抑菌活性作為響應值，構建一次回歸方程：抑菌圈平均直徑=11.902–0.209X1–1.046X2+0.617X3–0.289X4–"0.631X5+0.856X6+0.042X7。回歸方程的多元相關系數(shù)R2大于90%，表明該方程的擬合性良好，可以用于預測各因子對發(fā)酵液抑菌活性的變化。根據(jù)回歸分析，7個因子對發(fā)酵液抑菌活性的顯著性影響分析結果見表4，在所考察的7個因子中，發(fā)酵時間的P值為0.013，玉米面的P值為0.026，均小于0.05，表明這2種因子對發(fā)酵液的抑菌活性有顯著影響。其他5個因素對發(fā)酵液的抑菌活性均無顯著性影響。發(fā)酵時間和玉米面的T值分別為–4.22

和3.46，表明發(fā)酵時間對發(fā)酵液的抑菌活性是負影響，而玉米面對發(fā)酵液的抑菌活性是正影響。

2.4""最陡爬坡試驗結果分析

從Plackett-Burman試驗可以看出，發(fā)酵時間和玉米面是影響菌株R2A-15發(fā)酵液對抑菌活性的關鍵因素。發(fā)酵時間是負效應，要適當縮短發(fā)酵時間；玉米面是正效應，可在發(fā)酵培養(yǎng)基中適當提高其含量。通過對2種因子的正、負效應及影響程度的分析，確定了2種因子的變化方向及步長：從48"h開始，發(fā)酵時間逐漸縮短；從10.00"g開始，增加玉米面的添加量。其他非主要因子，以單因素試驗的最優(yōu)值為發(fā)酵條件，對其進行發(fā)酵培養(yǎng)，并測定發(fā)酵液的抑菌活性。最陡爬坡試驗結果見表5。當發(fā)酵時間為36"h、玉米面為12.00"g時，發(fā)酵液的抑菌活性最大，故以此為各因子的中心點，進行后續(xù)的響應面分析優(yōu)化。

2.5""響應面試驗設計結果分析

根據(jù)最陡爬坡試驗結果發(fā)現(xiàn)，顯著性因子發(fā)酵時間和玉米面分別為36"h和12.00"g時，發(fā)酵液抑菌活性最大，抑菌圈平均直徑達到14.56"mm。以發(fā)酵時間（36"h）和玉米面（12.00"g）為中心點，對發(fā)酵時間和玉米面進行5個水平的中心復合試驗設計，中心復合試驗設計見表6。根據(jù)中心復合試驗設計，開展13組試驗檢測發(fā)酵液抑菌活性，中心復合試驗結果見表7。

用Minitab"20軟件進行二元回歸擬合，獲得抑菌圈平均直徑（Y）對發(fā)酵時間（X2）和玉米面（X6）的二次多項回歸方程：Y=1.76+0.1911X2+"1.524X6–0.002271X22–0.06050X62–0.00167X2X6。

經顯著性和方差分析后，得到F值為25.78，P值為0.000，說明回歸方程擬合較好，可靠性高。抑菌圈平均直徑與發(fā)酵時間、玉米面的曲面見圖9，等值線見圖10。由響應面的形狀可知，當發(fā)

酵時間（X2）為37.5，玉米面（X6）為12.09時，最大的抑菌圈平均直徑為14.56"mm。

2.6""驗證試驗

用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，對菌株R2A-15的發(fā)酵液抑菌活性進行驗證試驗（圖11）。結果表明，抑菌圈平均直徑達到14.56"mm，與理論計算結果14.56"mm一致，比優(yōu)化前10.47"mm高4.09"mm。

采用單因素試驗、Plackett-Burman試驗以及響應面分析法，經驗證試驗最終得到菌株R2A-15的最優(yōu)培養(yǎng)基為：玉米面12.09"g，酸水解酪蛋白4.00"g，碳酸鈣2.00"g，硫酸鎂2.00"g，磷酸氫二鉀2.00"g，氯化鈉1.00"g，蒸餾水1"L；最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵初始pH"7.0、發(fā)酵時間37.50"h、發(fā)酵溫度34"℃、接種量3%、搖瓶裝液量100"mL/250"mL。

2.7""發(fā)酵液的抑菌活性穩(wěn)定性分析

菌株R2A-15的發(fā)酵液經不同溫度處理后，抑菌圈平均直徑均在13.00"mm以上，波動范圍在±1.04"mm，總體活性表現(xiàn)穩(wěn)定，結果見圖12，表明其抑菌活性不隨溫度的變化而變化。

在不同pH條件下，菌株R2A-15發(fā)酵液的抑菌活性表現(xiàn)為先上升后下降的變化，結果見圖13。經pH為6.0～8.0處理后抑菌圈平均直徑均大于13.00"mm，抑菌活性較為穩(wěn)定。在pH為2.0的條件下，對靶標菌無抑菌活性；在pH為12.0的條件下，對靶標菌的抑菌活性明顯下降。說明強酸強堿能抑制該菌株發(fā)酵液活性。

菌株R2A-15的發(fā)酵液經不同時間紫外光照射后，其抑菌活性變化不顯著，結果見圖14。經15.09"mm。結果表明，發(fā)酵液的抑菌活性在紫外線照射下有所提高。

菌株R2A-15發(fā)酵液經過不同的溫度、酸堿和紫外線條件處理后，能維持較好的活性穩(wěn)定性，為今后柑橘綠霉病生防菌劑的制備與應用提供參考，也將為菌株R2A-15發(fā)酵的代謝活性物開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

3""討論

放線菌的代謝活性物往往含量較少，分離純化難度大。此外，放線菌的生長和代謝是一個復雜的過程，會受到許多環(huán)境及培養(yǎng)條件的影響，在生產應用的過程中，如果缺少穩(wěn)定的發(fā)酵方法，就會導致放線菌的代謝活性物在不同批次的含量波動較大，從而導致不同批次的農用抗生素的抑菌效果不同。因此，優(yōu)化菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，是穩(wěn)定提高微生物代謝活性物含量必不可少的一部分。

研究表明，不同的碳氮源選擇對微生物的發(fā)酵存在不同影響，本研究對菌株R2A-15的優(yōu)化結果發(fā)現(xiàn)，玉米面（碳源）含量對發(fā)酵液抑菌活性有顯著影響，放線菌A12-2-11[30]（蔗糖為碳源）、放線菌16-3-10[31]（乳糖為碳源）等均受碳源影響。此外，發(fā)酵初始pH、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等因素能刺激放線菌代謝活性物產生，如放線菌B11[27]是發(fā)酵時間和接種量等因素，放線菌LG-9[32]是發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度等因素，本研究結果表明發(fā)酵時間對發(fā)酵液抑菌活性有顯著影響。通過對菌株R2A-15的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化，使抑菌效果提高了39%，優(yōu)化后的抑制圈平均直徑為14.56"mm明顯比優(yōu)化前（10.47"mm）的抑菌效果好。且經過篩選，發(fā)酵時間從5"d縮減到37.5"h，大大提升發(fā)酵效率，節(jié)約生產成本。

放線菌是被應用于植物病害防治的微生物，但其產生的主要活性物質在生產應用中很不穩(wěn)定，從而影響放線菌的開發(fā)與應用。放線菌WMF106[21]發(fā)酵液的抑菌物質具有耐熱和耐光，但對酸敏感，放線菌DA4-3-12[33]的發(fā)酵液在不同酸堿、溫度和紫外照射條件下均表現(xiàn)良好的穩(wěn)定性。與其他放線菌發(fā)酵液穩(wěn)定性相似，菌株R2A-15發(fā)酵液在4～60"℃的溫度下，其抑菌圈平均直徑下降幅度不超過11%，維持了較高的抑菌活性，在紫外線照射1～9"h下抑菌活性有所提高，而在pH為6.0～8.0的范圍內抑菌活性較穩(wěn)定，但在強酸強堿環(huán)境下，菌株R2A-15發(fā)酵液中抑菌活性有所下降。初步探究菌株R2A-15發(fā)酵液經過不同的溫度、酸堿和紫外線條件處理后，能維持較好的活性穩(wěn)定性。

菌株發(fā)酵液具有較好的抑菌活性和穩(wěn)定性，能更好的開發(fā)和利用其發(fā)酵產物。He等[34]報道放線菌A217發(fā)酵液有較好的抑菌和防病效果，其發(fā)酵產物對多種植物病原真菌和細菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性，放線菌A217可作為植物病害生物防治劑的潛在應用。Xiu等[35]報道菌株AM-4發(fā)酵液對指狀青霉的菌絲生長抑制率為66.23%，菌株AM-4的發(fā)酵提取物對柑橘綠霉病的防治效果好，作為生防菌株具有良好的開發(fā)利用前景。在本研究中，從紅橙植株根部土壤中分離的菌株R2A-15，具有產生對指狀青霉抑菌活性強、穩(wěn)定性好的代謝產物的能力，可進一步開展菌株R2A-15在柑橘綠霉病染病植株上的抑菌效果評估等應用試驗，從而為實現(xiàn)拮抗柑橘綠霉病的生防菌產品開發(fā)和應用奠定基礎。

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