蘇鐵羽葉褐斑病病原菌鑒定及其化學防治藥劑的篩選

摘""要：本研究旨在分離并鑒定造成蘇鐵屬植物羽葉褐斑病的病原真菌，篩選出對該病原真菌具有強烈抑制作用的化學防治藥劑，為蘇鐵的保護提供理論依據(jù)。首先，通過病斑組織分離、純化后回接滇南蘇鐵葉片，根據(jù)科赫氏法完成其致病性驗證。其次，對其進行形態(tài)鑒定；再應用SSU、LSU、GAPDH、tef1、rpb2、Alt、OPA10-2、ITS"8個基因序列，構建多基因進化樹進一步鑒定病原真菌。最后，通過平板抑菌試驗，從7種化學藥劑中篩選出高效的抗菌藥劑。本研究發(fā)現(xiàn)，形態(tài)學鑒定與多基因聯(lián)合進化分析表明，該病原菌為鏈格孢屬的巴斯基鏈格孢（Alternaria"burnsii）；在7種化學藥劑平板抑菌試驗中，氟酰羥·苯甲唑效果最佳，其濃度在0.67"mg/L時抑菌率達到73.48%。

關鍵詞：蘇鐵；褐斑病；病原鑒定；巴斯基鏈格孢；平板抑菌試驗。中圖分類號：S432.4+4""""""文獻標志碼：A

Identification"of"Pathogen"Causing"Brown"Spot"in"Leaves"of"Cycas"and"Its"Chemical"Control"Agent"Screening

QIN"Qian1，"DING"Liqiong1，"CHI"Zhaojin1，"LU"Zuzheng1，"SHAN"Bin1，"XIE"Zhenxing1，"HUANG"Xinyi1，"XU"Tian2*

1."Guangxi"Subtropical"Crops"Research"Institute，"Nanning，"Guangxi"530001，"China;"2."Nanning"Botanical"Garden，"Nanning，"Guangxi"530029，"China

Abstract："This"research"aimed"to"identify"a"pathogenic"fungus"of"the"brown"spot"disease"in"the"leaves"of"Cycas"and"screen"for"its"chemical"control"agents，"which"provides"a"theoretical"basis"for"the"protection"of"Cycas."The"pathogenic"fungus"was"isolated"from"the"lesion"spots"in"some"Cycas"leaves."The"pathogenicity"of"the"fungus"was"confirmed"by"isolating"and"purifying"the"infected"leaf"tissuesnbsp;and"reintroduced"to"thenbsp;healthy"leaves"of"Cycas"diannanensis"following"Koch’s"postulates."Morphological"identification"of"the"pathogenic"fungus"was"conducted."To"further"confirm"the"identification，"a"phylogenetic"tree"was"constructed"using"eight"gene"sequences："SSU，"LSU，"GAPDH，"tef1，"rpb2，"Alt，"OPA10-2"and"ITS."Effective"chemical"control"agents"were"screened"from"seven"chemical"agents"by"inhibition"assay"in"vitro."Phylogenetic"analyses"showed"that"this"pathogen"was"Alternaria"burnsii."Among"the"tested"chemical"agents，"the"most"effective"inhibition"was"fluoxastrobin，"which"displayed"73.48%"inhibition"rate"at"a"concentration"of"0.67"mg/L.

Keywords："Cycas;"brown"spot;"pathogen"identification;"Alternaria"burnsii;"the"inhibition"assay"in"vitro

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.08.017

我國蘇鐵屬植物種類豐富，主要包括：蘇鐵（Cycas"revoluta）、叉孢蘇鐵（C."segmentifida）、叉葉蘇鐵（C."bifida）、寬葉蘇鐵（C."balansae）、長葉蘇鐵（C."dolichophylla）、單羽蘇鐵（C."simplicipinna）、篦齒蘇鐵（C."pectinata）、多歧蘇鐵（C."multipinnata）、銹毛蘇鐵（C."ferruginea）、灰干蘇鐵（C."hongheensis）、六籽蘇鐵（C."sexseminifera）、陳氏蘇鐵（C."chenii）、四川蘇鐵（C."szechuanensis）、德保蘇鐵（C."debaoensis）、貴州蘇鐵（C."guizhouensis）、臺灣蘇鐵（C."taiwaniana）、滇南蘇鐵（C."diannanensis）、攀枝花蘇鐵（C."panzhihuaensis）、臺東蘇鐵（C."taitungensis）和譚清蘇鐵（C."tanqingii）[1]。由于蘇鐵屬植物化石記錄豐富，它們?yōu)楣派飳W、古氣候學及古地理研究提供了大量證據(jù)，也為研究種子植物的起源和進化提供了重要線索[2]。蘇鐵屬早在1974年就被納入《瀕危野生動植物物種國際貿(mào)易公約》（CITES）保護范圍。在我國，蘇鐵屬在1996年被列為一級保護植物。目前，在我國多個地區(qū)，已專門為蘇鐵建立自然保護區(qū)。其中，遷地保護是一種有效的保護手段。南寧植物園（南寧青秀山）從1998年至今遷入蘇鐵屬、非洲鐵屬、澤米鐵屬等蘇鐵類植物1萬多株[3]。蘇鐵病害不僅破壞其觀賞價值，也是目前造成樹木死亡的主要原因之一，對蘇鐵資源的保護利用構成嚴重威脅。因此，對南寧植物園進行系統(tǒng)性的蘇鐵病害調查十分有必要。

目前，已有報道表明，蘇鐵屬真菌性病害主要包括由炭疽菌屬（Colletotrichum）的兩個種C."siamense[4]和C."cycadis[5]侵染引起的葉斑病，由蘇鐵擬莖點霉（Phomopsis"cycadis）引起的蘇鐵葉枯病[6]，由蘇鐵殼二孢菌（Ascochyta"cycadia）引起的蘇鐵白斑病[7]，由蘇鐵間座殼菌（Diaporthe"cycasis）引起蘇鐵葉枯病[8]，由茄腐皮鐮刀菌（Fusarium"solani）引起的蘇鐵根莖腐爛病[9]，由蘇鐵擬盤多毛孢（Pestalotiopsis"cycadis），蘇鐵殼蠕孢（Stagonospora"caricinella），鏈格孢屬（Alternaria）、葉點霉屬（Phyllosticta）和色二孢屬（Diplodia）引起的葉斑病[10-11]，由煤炱菌屬（Capnodium）引起的蘇鐵煤污病[12]以及由殼針孢屬（Septoria）引起的蘇鐵葉枯病[13]。曾報道印度有鏈格孢屬（Alternaria）和膠孢炭疽菌（C."gloeosporioides）引起的蘇鐵葉部病害。在美國佛羅里達和巴基斯坦有莖點霉屬（Phoma"sp.）引起的蘇鐵葉枯病[14-15]。

針對Colletotrichum"sp.、P."cycadis和A."cycadia引起的葉斑病所使用的化學防治藥劑主要包括多菌靈、苯甲丙環(huán)唑和戊唑醇[3]。放線菌屬（Streptomyces）及其次生代謝物對A."alternata的抑制率可達到（65.43±1.63）%[16]。但與大田作物相比，在蘇鐵上使用的化學藥劑種類報道較少。

我們在南寧植物園的蘇鐵園采集了多種病樣標本，其中包括發(fā)病羽片及莖稈標本，寄主包含德保蘇鐵（C."debaoensis）、篦齒蘇鐵（C."pectinata）、滇南蘇鐵（C."diannanensis）、叉葉蘇鐵（C."bifida）、叉孢蘇鐵（C."segmentifida）等。對所采集病害標本進行單孢分離純化，得到82個菌株。根據(jù)ITS區(qū)域對這些真菌進行初步鑒定，這些菌株主要包括炭疽菌屬（Colletotrichum）、鐮刀菌屬（Fusarium）、鏈格孢屬（Alternaria）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）、葉點霉屬（Phyllosticta）、黑孢霉屬（Nigrospora）、枝孢菌屬（Cladosporium）、球毛殼屬（Chaetomium）、炭團菌屬（Hypoxylon）、炭角菌屬（Xylaria）、葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）、曲霉屬（Aspergilus）、小新殼梭孢屬（Neofusicoccum），其中炭疽菌屬、葉點霉屬、鐮刀菌屬、鏈格孢屬、擬盤多毛孢屬的分離頻率最高。在已有文獻報道中，引起蘇鐵葉部病害的鏈格孢菌僅鑒定到屬。因此，需要進一步明確致病的鏈格孢菌物種，并確認其寄主類型。同時初步篩選出具有防治潛力的化學藥劑，為蘇鐵屬植物保護奠定理論基礎。

1""材料與方法

1.1""材料

用于分離病原真菌的蘇鐵品種：德保蘇鐵、滇南蘇鐵、叉孢蘇鐵。

用于致病性測定的蘇鐵品種：滇南蘇鐵。

1.2""病原菌的分離與純化

從南寧植物園青秀山蘇鐵園采集蘇鐵羽葉典型褐斑病的樣品，采用常規(guī)組織分離法分離病原菌[4]。待病原菌的菌落長出后，挑取頂端菌絲進行純化。采用單孢分離法獲得純培養(yǎng)后，再轉入PDA斜面培養(yǎng)與保存。

1.3""病原菌的致病性測定

采用離體葉片無傷、刺傷接種和幼苗刺傷接種2種方法測定菌株致病性。從田間摘取健康且長勢較為一致的滇南蘇鐵羽葉，用清水洗凈，再用75%乙醇進行表面消毒。用6"mm打孔器取供試菌株的菌餅分別接種于無傷和刺傷的離體羽葉，羽葉另一邊于無傷、刺傷處貼上空白PDA圓塊為對照，放入培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)。離體羽葉接種，每個處理重復6次，無傷和刺傷接種共計24個樣品。同時接種滇南蘇鐵幼苗，每個處理接種3盆幼苗，每盆幼苗接種3片羽葉。保濕培養(yǎng)10～"15"d，觀察處理的發(fā)病情況。再從發(fā)病的部位對病原菌進行分離。

1.4""病原菌的形態(tài)觀察及多序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

在PDA上培養(yǎng)病原菌，觀察菌落形態(tài)，培養(yǎng)14"d后，產(chǎn)生孢子。洗脫孢子制成孢子懸浮液，

在顯微鏡（Leica"DM2500"Microscope）下觀察。觀察樣本共計30份。

收集培養(yǎng)5～7"d的菌絲，使用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA。以DNA為模板，擴增SSU（NS1/NS4）、ITS（ITS1/ITS4）[17]、LSU（LSUFd/LR5）[18]、GAPDH（GPD1/GPD2）[19]、tef1（EF1-728F/EF1-986R）[20]、rpb2（RPB2-5F2[21]/"fRPB2-7cR[22]）、Alt（Alt-for/Alt-rev）[23]和OPA10-2（OPA10-2R/OPA10-2L）[24]8個基因序列。擴增所需引物如表2所示。

擴增體系如下：2×Es"Taq"MasterMix"20"μL，DNA"1"μL，10"mmol/L上游引物與10"mmol/L下游引物各1"μL，ddH2O"17"μL。PCR擴增條件為：94"℃預變性3"min；94"℃變性30"s，55"℃退火30nbsp;s，72"℃延伸1"min，共35個循環(huán)；72"℃終延伸5"min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖進行凝膠電泳，電壓為120"V，時間為30"min。在熒光圖像分析系統(tǒng)上成像拍照。將片段大小符合預期的擴增產(chǎn)物送至廣州擎科生物技術有限公司進行測序，在NCBI（National"Center"for"Biotechnology"Information）數(shù)據(jù)庫中進行測序結果的BLAST分析，并選擇同源性相近的真菌種屬序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。并將本研究擴增出來的正確序列提交至NCBI的

GenBank數(shù)據(jù)庫。通過MEGA6軟件對樣品及同源性相近的真菌種屬進行進化樹構建。采用Neighbor-"Joining法進行數(shù)據(jù)分析，bootstrap值為1000。

1.5""殺菌劑對病原菌室內防效測定

測定啶氧菌酯、苯甲·丙環(huán)唑、氟酰羥·苯甲唑、苯甲·嘧菌酯、氟菌·肟菌酯、氯氟醚·吡唑酯、吡唑醚菌酯7種殺菌劑對蘇鐵褐斑病病原菌的抑菌效果。將殺菌劑配制成不同濃度的母液，將母液依次以5倍的比例稀釋成4個濃度梯度，制成含藥PDA平板，含藥平板為田間用量的1/30。加入ddH2O為空白對照，每個濃度設置3個重復。用打孔器沿菌落外圍切成6"mm的菌餅，接種于含藥平板上，于（28±"1）℃培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)7"d。通過菌落生長速率計算其抑菌率。采用十字交叉法測量菌落直徑，計算公式：相對抑菌率=（對照菌落平均直徑-處理菌落平均直徑）/對照菌落直徑×100%，以藥劑濃度對數(shù)值為自變量（x）、相對抑菌率的幾率值為因變量（y），建立毒力回歸方程，計算相關系數(shù)（R）和抑菌有效中濃度（ID50）。

2""結果與分析

2.1""蘇鐵褐斑病病原菌的分離與鑒定

在對青秀山蘇鐵病害進行調查的過程中，在德保蘇鐵、滇南蘇鐵以及叉孢蘇鐵中觀察到一種褐色病斑，這種病斑中心呈淺褐色，邊緣呈深褐色，有的病斑周圍還有黃色暈圈（圖1A），在癥狀類似的葉部病斑上均可分離到病原菌。在滇南蘇鐵的離體葉片上，接種該病原菌，保濕培養(yǎng)10～15"d，羽葉上逐漸出現(xiàn)類似癥狀。離體葉片上的病斑中心和邊緣區(qū)別并不明顯，病斑周圍也有黃色暈圈（圖1B），接種該病原菌的12片離體葉片均出現(xiàn)上述癥狀。在滇南蘇鐵幼苗羽葉上，接種該病原菌，在30"d左右出現(xiàn)癥狀（圖1C），在接種該病原菌的滇南蘇鐵幼苗共計6盆中的18片羽葉均出現(xiàn)上述癥狀。在出現(xiàn)上述癥狀的羽葉上，可以重新分離到該病原菌，我們將該病原菌編號為GX225。

該病原菌在PDA上培養(yǎng)初期菌落成灰白色，菌落邊緣整齊，菌絲絨毛狀，氣生菌絲發(fā)達。在培養(yǎng)10"d后，菌落逐漸變成深棕色（圖1D），并在培養(yǎng)基中產(chǎn)生黑色色素（圖1E）。分生孢子梗呈棕色至深褐色，大多呈銳角分枝（圖1F）。分生孢子呈灰棕色至褐色，大多呈酒瓶狀，有縱隔和橫隔。有的分生孢子頂部有臍點（圖1G），有的分生孢子沒有明顯的臍點（圖1H）。分生孢子一般具有1～4個橫隔，0～2個縱隔，隔膜處有縊縮；長23.7～"31.5"μm，寬7.9～13.2"μm"（n=30）。我們根據(jù)分生孢子形態(tài)初步鑒定該病原菌為Alternaria"sp.。

以提取的致病菌株GX225的DNA為模板，采用PCR方法擴增SSU、LSU、GAPDH、tef1、rpb2、Alt、OPA10-2、ITS"8段基因序列。通過凝膠電泳檢測，將大小符合預期的片段進行測序分析。將獲得的序列提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫獲得序列登記號（表2）。將上述8段序列與Alternaria"sp.不同種的同源序列進行比對，并進行ClustalW分析，基于上述8個序列用鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育的進化關系，得知GX225菌株與Alternaria"burnsii關系最近。進化樹的所有分支置信值均大于50%，GX225菌株所在的分枝內的置信值達100%；GX225菌株與A."burnsii的相似性達99.2%，故將GX225菌株鑒定為A."burnsii。

2.2""7種殺菌劑對A."burnsii的抑制作用評估

為了篩選出具有防治潛力的化學藥劑，我們評估了市場上常用的殺菌劑對GX225菌株（A."burnsii）的抑制效果，結果如表3所示。在7種供試藥劑中，氟酰羥·苯甲唑的抑菌效果最佳，抑制中量（inhibition"dose，"ID50）為0.011"mg/L。當濃度為0.67"mg/L時，氟酰羥·苯甲唑的抑菌率可達到73.48%。氟菌·肟菌酯抑菌效果僅次于氟酰羥·苯甲唑，濃度為1.43"mg/L時抑菌率為73.45%，抑制中量為0.021"mg/L。此外，其余5種菌劑對菌株GX225（A."burnsii）均有較強的抑制作用（表3）。

3""討論

3.1""A."burnsii的寄主范圍

在孟加拉國，有研究報道A."burnsii可以寄生筍瓜（Cucurbita"maxima）的種子，但不引起明顯的病癥[25]。在印度則發(fā)現(xiàn)A."burnsii侵染孜然芹（Cuminum"cyminum）引起葉斑病，最終造成植株枯萎的情況[26]。而本研究是首次報道在蘇鐵中A."burnsii侵染的情況，從而豐富了該菌的寄主范圍。在形態(tài)鑒定中，蘇鐵上分離的A."burnsii與筍瓜和孜然芹上分離得到的A."burnsii描述基本一致，分生孢子的顯微形態(tài)也基本相同。

本研究不僅在滇南蘇鐵（C."diannanensis）上發(fā)現(xiàn)褐斑病，在具有相類似癥狀的德保蘇鐵（C."debaoensis）、叉孢蘇鐵（C."segmentifida）和2種蘇鐵屬的植物羽葉上均分離到A."burnsii。在滇南蘇鐵的離體葉片接種出現(xiàn)相似的癥狀，這表明A."burnsii可寄生蘇鐵屬植物的多個種。據(jù)前期研究報道，Alternaria"sp.可引起蘇鐵屬蘇鐵（C."revoluta）葉斑病，其病狀表現(xiàn)為：發(fā)病初期病斑為不規(guī)則形或長形病斑，后期擴展，病癥部位變?yōu)楹诤稚?，病健交界處為紅褐色波浪狀，病葉上有黑色霉層[10]。但上述研究并未將Alternaria鑒定到種，且根據(jù)其對蘇鐵羽葉上癥狀的描述，與本研究在德保蘇鐵、滇南蘇鐵、叉孢蘇鐵觀察到的癥狀有相似之處。故推測A."burnsii在蘇鐵屬植物的寄主范圍可能并不局限于上述3個種。關于A.nbsp;burnsii在蘇鐵屬植物是否存在其他寄主，有待進一步研究。

3.2""Alternaria"sp.的鑒定

根據(jù)WOUDENBERG等[27]的報道，鏈格孢屬（Alternaria）內種的鑒定可基于SSU、LSU、GAPDH、tef1、rpb2、Alt、OPA10-2、ITS和endoPG"9個序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。而本研究中根據(jù)上述文獻推薦的endoPG擴增引物擴增出的片段與其預期大小不符，這可能是其推薦的endoPG引物序列在Alternaria"spp.不夠保守導致的。而根據(jù)WOUDENBERG等[28]早期的文獻報道，GAPDH、tef1、rpb2、Alt和ITS也可以較好地區(qū)分鏈格孢屬內不同的種。因此，本研究基于SSU、LSU、GAPDH、tef1、rpb2、Alt、OPA10-2和ITS構建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，可以較好地將Alternaria"spp.包括A."alstroemeriae、A."arborescens、A."burnsii、A."eichhorniae、A."gaisen、A."gossypina、A."iridiaustralis、A."jacinthicola、A."longipes、A."tenuissima和A."alternata區(qū)分開。

3.3""A."burnsii引起的蘇鐵褐斑病的防治

多菌靈、苯甲丙環(huán)唑和戊唑醇可防治Colletotrichum"sp.、P."cycadis和A."cycadia引起的葉斑病[3]。本研究在啶氧菌酯，苯甲·丙環(huán)唑、氟酰羥·苯甲唑、苯甲·嘧菌酯、氟菌·肟菌酯、氯氟醚·吡唑酯和吡唑醚菌酯7種藥劑中，篩選到抑菌效果最好的是氟酰羥·苯甲唑。然而，眾所周知，長期使用單一化學藥劑極易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。所以，后續(xù)研究可以擴大藥劑的篩選范圍，同時也可以篩選具有生物防治潛力的微生物，用于防治A.burnsii引起的蘇鐵屬植物葉斑病。根據(jù)報道，針對115株A."alternata菌株的抗藥性測定顯示，A."alternata對嘧菌酯類藥物尚未產(chǎn)生抗藥性，而對戊唑醇類藥物抗藥性的頻率達100%；同時，雖然A."alternata對啶酰菌胺產(chǎn)生的抗藥性弱，但抗藥性發(fā)生頻率達98.26%；此外，即使A."alternata對腐霉利抗藥性發(fā)生頻率僅為12.17%，但所產(chǎn)生的抗藥性較為強烈[29]。因此，我們在使用化學藥劑防治時需要警惕菌株抗藥性的產(chǎn)生。據(jù)報道，在室內平板抑菌試驗中，濃度為100"μg/mL的ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對A."dumosa的抑制率可達80.10%，濃度為200"μg/mL的肉桂酸鉀對A."dumosa的抑制率可達71.80%[30]。放線菌屬（Streptomyces"sp.）NEAU-ZC16菌株在平板對峙試驗中對A."alternata的抑菌率可達到（69.77±"1.20）%。其次生代謝物分離出的活性成分Ⅲ-2-1對A."alternata抑菌率可達到（65.43±1.63）%，其ID50為1.89"pg/mL，毒力回歸方程為y=4.8357+"0.5949x，r=0.9820[16]。由此可見，通過篩選拮抗菌及其次生代謝產(chǎn)物來防治A."burnsii引起的蘇鐵屬植物褐斑病是一種極具潛力的方式。

4""結論

A."burnsii能引起德保蘇鐵（C."debaoensis）、滇南蘇鐵（C."diannanensis）、叉孢蘇鐵（C."segmentifida）褐斑病。通過SSU、LSU、GAPDH、tef1、rpb2、Alt、OPA10-2、ITS"8個基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，可以有效鑒定Alternaria"sp.。氟酰羥·苯甲唑能有效抑制A."burnsii的生長，因此，氟酰羥·苯甲唑是一種具有防治A."burnsii引起的蘇鐵屬植物褐斑病潛力的化學藥劑。

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