木薯MeMLO12基因克隆及其CRISPR-Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建

摘""要：MLO基因是植物中特有的一類抗病性負(fù)調(diào)控因子，該基因突變導(dǎo)致植物產(chǎn)生廣譜抗病性。本研究從木薯全基因組中克隆獲得木薯MLO12基因的DNA和cDNA序列，并將其命名為MeMlLoO12。該基因全長3743"nt、編碼區(qū)（ORF）全長1728"nt，具有一個(gè)完整的開放閱讀框，含有15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子，編碼586個(gè)氨基酸，蛋白的分子質(zhì)量為67.2"kDa，等電點(diǎn)為8.85。該基因編碼的蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，無信號(hào)肽，在23～45、74～96、161～183、285～307、312～334、371～393、413～435"aa處形成7次跨膜結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR定量分析發(fā)現(xiàn)，受木薯黃單胞病菌侵染后，MeMloLO12基因在木薯抗、感品種中的表達(dá)量存在明顯的差異，參與木薯與黃單胞菌之間的互作，表現(xiàn)出負(fù)調(diào)控作用。選擇該基因第11個(gè)外顯子進(jìn)行Snap"Gene"Viewer分析，獲得了10"455條sgRNA的種子序列，從中選取3條靶序列約23"nt，堿基組成上3￠末端含G結(jié)尾，將其構(gòu)建到CRISPR/-Cas9載體上，經(jīng)驗(yàn)證，確認(rèn)MeMloLO12的3條靶序列已經(jīng)成功構(gòu)建到基因編輯載體上，將其命名為pSGR-Cas9-AT-MeMLO12載體。

關(guān)鍵詞：木薯；MeMloLO12基因；克??；表達(dá)分析；CRISPR-Cas9載體；構(gòu)建中圖分類號(hào)：S533""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Cloning"of"Cassava"MeMLO12"Gene"and"Construction"of"Its"CRISPR-"Cas9"Expression"Vector

CAI"Jimiao，"LI"Boxun*，"HUANG"Guixiu，"LI"Chaoping，"SHI"Tao，"WANG"Guofen

1."Environment"and"Plant"Protection"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Integrated"Pest"Management"on"Tropical"Grops，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs，"China"/"Hainan"Engineering"Research"Center"for"Biological"Control"of"Tropical"Crops"Diseases"and"Insect"Pest，"Haikou，"Hainan"571101，"China

Abstract："MLO"gene"is"an"unique"negative"regulatory"factor"for"disease"resistance"in"plants，"and"the"mutation"in"the"gene"can"lead"to"broad-spectrum"disease"resistance"in"plants."In"this"study，"a"DNA"and"cDNA"sequence"of"cassava"MLO12"gene"were"cloned"from"the"entire"cassava"genome"and"named"MeMloLO12."This"gene"has"a"total"length"of"3743"nt"and"a"coding"region"（ORF）"of"1728"nt，"with"a"complete"open"reading"frame"containing"15"exons"and"14"introns，"encoding"586"amino"acids."The"protein"has"a"molecular"weight"of"67.2"kDa"and"an"isoelectric"point"of"8.85."MeMloLO12"protein"is"located"on"the"endoplasmic"reticulum"membrane，"without"signal"peptides，"and"forms"seven"transmembrane"domains"at"23?45，"74?96，"161?183，nbsp;285?307，"312?334，"371?393，"413?435"aa."Quantitative"analysis"by"qRT"PCR"revealed"significant"differences"in"the"expression"of"MeMloLO12"gene"in"resistant"and"susceptible"cassava"germplasms"after"infection"with"Xanthomonas"axonopodis，"indicating"a"negative"regulatory"effect"in"the"interaction"between"cassava"and"Xam."Selecting"the"11th"exon"of"the"gene"for"Snap"Gene"Viewer"analysis，"10"455"seed"sequences"of"sgRNA"were"obtained."Three"target"sequences"of"approximately23nt"were"selected，"with"a"G"terminus"at"the"3￠"end"of"the"base"composition，"and"they"were"constructed"onto"the"CRISPR/-Cas9"vector."After"verification，"it"was"confirmed"that"the"three"target"sequences"of"MeMloLO12"have"been"successfully"constructed"onto"the"gene"editing"vector，"named"pSGR-Cas9-AT-MeMLO12"vector.

Keywords："cassava;"MeMlo12"gene;"cloning;"expression"analysis;"CRISPR-Cas9"vector;"construction

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.08.002

木薯（Manihot"esculenta"Crantz）是世界熱帶、亞熱帶國家和地區(qū)的糧食作物，也是我國重要的熱帶工業(yè)原料作物，在保障糧食和能源安全以及熱帶農(nóng)產(chǎn)品國際貿(mào)易等方面占有重要地位[1]。細(xì)菌性萎蔫?。–asssva"Becterial"Blight，，"CBB）是為害木薯最為嚴(yán)重的葉部病害之一，在木薯整個(gè)生長季節(jié)均可發(fā)生，主要為害葉片和莖桿，能導(dǎo)致葉片大面積凋萎、干枯脫落，高溫高濕且臺(tái)風(fēng)雨頻繁的區(qū)域發(fā)病最為嚴(yán)重[2]。其病原地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種（Xanthomonas"axonopodis"pv"manihotis）于2007年被列入《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》，是國內(nèi)檢疫性對(duì)象。研究發(fā)現(xiàn)，該病菌已經(jīng)對(duì)銅基殺菌劑產(chǎn)生一定程度的抗藥性[3]，常規(guī)的化學(xué)藥劑如春雷霉素、氫氧化銅、硫酸鏈霉素，以及新型免疫誘抗劑氨基寡糖素等對(duì)該病的防效也均不理想[4-5]，。木薯封行后，在高溫高濕和臺(tái)風(fēng)雨季節(jié)發(fā)病最為嚴(yán)重，這個(gè)時(shí)候進(jìn)行人工施藥也比較困難，勞動(dòng)力成本高，容易加重抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)603份木薯種質(zhì)中有6份對(duì)該病表現(xiàn)出高抗水平[7]，42份食用木薯種質(zhì)中也有4份表現(xiàn)出中抗水平[8]，其余的均為感病種質(zhì)，說明在我國木薯種質(zhì)資源中，存在一定數(shù)量的抗病種質(zhì)材料，并且這些抗、感種質(zhì)在田間種植過程中也都會(huì)感染細(xì)菌性萎蔫病，只是抗病種質(zhì)的病情指數(shù)和受害程度要低于感病種質(zhì)，在發(fā)病高峰期，抗病種質(zhì)的落葉量在10%～20%之間，而感病種質(zhì)的落葉量高達(dá)60%，并且抗病種質(zhì)的最終產(chǎn)量也顯著高于同期的感病種質(zhì)（內(nèi)容資料尚未待發(fā)表）。因此，對(duì)于多年生、非精細(xì)化管理的木薯來說，抗病種質(zhì)的選育才是解決該病最為經(jīng)濟(jì)有效的途徑，而抗病基因資源的挖掘與利用是抗病種質(zhì)鑒選及創(chuàng)制利用的關(guān)鍵。

MLO是一類參與植物多種生物與非生物脅迫反應(yīng)的廣譜抗病因子，是由單基因控制的隱性抗病基因，在植物的抗病過程起負(fù)調(diào)控作用，目前已有198個(gè)植物MLO基因被克隆鑒定[9]。MLO是一種跨膜蛋白，有7個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域，定位在細(xì)胞膜上[10]，在距離第7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的10～15個(gè)氨基酸處有1個(gè)鈣調(diào)素結(jié)合蛋白區(qū)域[11]。目前，已經(jīng)證明大麥（Hordeum"vulgare）[12]、番茄（Solanum"lycopersicum）[13]、擬南芥（Arabidopsis"thaliana）[14]中MLO基因的突變體是對(duì)白粉病菌具有廣譜抗性，缺失MLO基因的隱性突變對(duì)白粉菌不同生理小種具有廣譜、高效和持久抗性，是白粉病抗病性的負(fù)調(diào)控基因[15]。除白粉病外，MLO"還參與稻瘟菌、銹菌、卵菌、黃單胞菌等各種生物和非生物脅迫響應(yīng)[16-19]。覃碧等[20]從木薯全基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出21個(gè)MLO家族基因，劃分為6個(gè)遺傳類群，其中MeMLOloＬＯ1、MeMLOloＬＯ2、MeMLOloＬＯ3、MeMLOloＬＯ6、MeMLOloＬＯ12和MeMLOloＬＯ17等6個(gè)家族基因含有與抗病性相關(guān)的兩段保守結(jié)構(gòu)域和鈣素結(jié)合區(qū)，可能與抗病性相關(guān)。在橡膠樹中HbMLO9、HbMLO12參與橡膠樹的激素信號(hào)傳導(dǎo)和逆境脅迫響應(yīng)過程[21-22]，而HbMLO12沉默可以抑制白粉菌的侵染，并在與橡膠樹和白粉菌互作過程中提高了橡膠樹的免疫反應(yīng)[23]，說明MLO12基因可能參與抗病性相關(guān)反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，通過基因編輯對(duì)MLO相關(guān)等位基因進(jìn)行定點(diǎn)突變可創(chuàng)制廣譜抗白粉病又高產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)小麥新種質(zhì)[24]，通過對(duì)感病S基因的突變來提高作物對(duì)病原菌的抗性，獲得廣譜和持久抗性的新種質(zhì)材料，是目前作物抗病育種研究的焦點(diǎn)。為此，本研究對(duì)木薯MLO家族中與抗病性相關(guān)的MLO12基因進(jìn)行全長克隆和表達(dá)特性分析。同時(shí)以MeMLO12基因?yàn)榘悬c(diǎn)，構(gòu)建了1個(gè)sgRNA表達(dá)盒的CRISPR/Cas9載體pSGR-Cas9-AT-MeMLO12，證明了載體的有效性，為后續(xù)轉(zhuǎn)基因木薯的突變情況及、遺傳穩(wěn)定性分析以及抗病木薯新種質(zhì)材料的創(chuàng)制提供新的途徑。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""供試病原菌和載體""供試木薯黃單胞菌株GX11由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所的黃貴修研究團(tuán)隊(duì)分離、鑒定和保存[3]。用于基因編輯的pSGR-Cas9-AT載體是由中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心張鵬研究員提供。

1.1.2""供試木薯種質(zhì)材料""供試的9份木薯種質(zhì)HN8、HN12、HN18、GR4、GXC09、H1701、CP1、SC8、SC205均來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所演豐基地木薯種質(zhì)保存圃，其中HN8、HN12、HN18、GXC09、H1701、CP1為本實(shí)驗(yàn)室有性雜交獲得的對(duì)細(xì)菌性萎蔫病具有一定抗性的木薯種質(zhì)；GR4、SC8、SC205是生產(chǎn)上普遍種植的感病木薯品種，均采用常規(guī)的起壟種植方法。

1.1.3""試劑和耗材""用于MLO12基因克隆和實(shí)施熒光定量表達(dá)分析的引物（表1）均由深圳華大基因科技有限公司合成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)所需的Buffer、Taq"DNA聚合酶、dNTPs、DNA"marker等生物學(xué)試劑，以及植物總RNA提取試劑盒（DP441）、FastQuant"cDNA第一鏈合成試劑盒（KR106）、SYBR"Green"SuperReal熒光定量預(yù)混試劑（FP205）均購自天根生化（北京）科技有限公司。E.Z.N.A."Gel"Extraction"Kit（D2500-01）膠回收試劑盒購自O(shè)mega"Bio-Tek公司，其他化學(xué)試劑、藥品等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4""儀器設(shè)備""Bio-Rad"T100型梯度PCR儀，美國伯樂公司；UVI"FireReader凝膠成像系統(tǒng)，英國UVItec公司；ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500型，美國ABI公司。

1.2""方法

1.2.1""總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄""參照RNA提取試劑盒說明書，對(duì)抗、感木薯葉片的總RNA進(jìn)行提取。參照FastQuant"cDNA第一鏈合成試劑盒說明書對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄第一鏈，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于?20"℃冰箱保存。

1.2.2""基因克隆""將同屬大戟科的橡膠樹HbM L O 12基因序列（GenBank登錄號(hào)：XP_021673570）

在木薯全基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blastn比對(duì)，獲得的序列在Softberry服務(wù)器（http：//www."softberry."com）在線軟件中選用已知的模式植物全基因組

序列，對(duì)基因全長進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得MLO12基因的cDNA和基因組序列。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，設(shè)計(jì)簡并引物MeMLO12-F和MeMLO12-R（表1），分別用以木薯種質(zhì)HN8葉片DNA和總RNA為模板，采用PCR和RT-PCR方法對(duì)基因全長進(jìn)行克隆。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得目的片段經(jīng)凝膠回收純化試劑盒回收，連接到pMD18-T載體上送深圳華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.3""序列分析""利用DNAMAN"Version"5.2.2軟件分析目的基因編碼的氨基酸序列，使用ProtParam服務(wù)器（http：//www.expasy.org/tools/protparam."html）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的相關(guān)信息，TMHMM-2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域。同時(shí)，下載近源物種的同源基因氨基酸序列，用MEGA"version"6.0軟件中的NJ（Neighbor-Joining）方法生成系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap方法對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢驗(yàn)，1000次重復(fù)。

1.2.4""表達(dá)分析""參照SYBR"Green"SuperReal熒光定量試劑盒說明書，以組成型表達(dá)基因18s"rRNA為內(nèi)參基因，分析MeMLO12基因在木薯抗、感種質(zhì)受黃單胞菌（GX11）接種的不同時(shí)間段（12、24、48、72"h）的差異表達(dá)情況，以不接種病原菌清水處理的葉片作為對(duì)照。每個(gè)樣品均重復(fù)3次，在ABI"7500實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行，采用2?ΔΔCT法進(jìn)行分析。

1.2.5""靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)及基因編輯載體構(gòu)建""采用在線設(shè)計(jì)軟件CRISPR-P"v2.0[25]，在MeMLO12基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)3條sgRNA靶序列。合成靶點(diǎn)引物（表2），參照郭文雅等[26]的方法克隆基因編輯載體。菌液PCR篩選出陽性克隆后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pSGR-Cas9-AT-MeMLO12。

2""結(jié)果與分析

2.1""MeMLO12基因的克隆及表達(dá)特性分析

2.1.1""MeMLO12基因的克隆""以木薯種質(zhì)HN8葉片的DNA和cDNA為模板，用引物對(duì)MeMLO12-F/R進(jìn)行PCR和RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）經(jīng)測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因全長3743"nt，編碼區(qū)（ORF）全長1728"nt，具有一個(gè)完整的開放閱讀框，含有15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子（圖2），編碼586個(gè)氨基酸，蛋白的分子質(zhì)量為67.2"kDa，等電點(diǎn)為8.85，將其命名為MeMLO12（GenBank登錄號(hào)：ON_624099）。

2.1.2""MeMLO12基因及其不同物種同源蛋白的聚類關(guān)系分析""從NCBI下載木薯MeMLO1（XP_"021613330）、MeMLO4（XP_021618110）、MeMLO09（XP_021614134）、MeMLO10（XP_021605658）、MeMLO11（XP_021608377）、MeMLO13（XP_"021616696），橡膠樹HbMLO8（XP_021687228）、HbMLO10（XP_021691439）、HbMLO12（XP_"021673570），擬南芥AtMLO12（BAF_00789），麻風(fēng)樹JcMloLO12（XP_012086496）和蓖麻RiMloLO12（XP_002533246）的蛋白氨基酸序列，采用NCBI"Consered"Domains進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MeMLO12蛋白在12～489"aa之間存在1個(gè)MLO家族保守結(jié)構(gòu)域（圖3）。將MeMLO12基因蛋白的氨基酸序列與這6種植物MLO基因蛋白的氨基酸序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，不同物種的MLO蛋白具有很高的同源性，木薯MeMLO12基因與橡膠樹、麻風(fēng)樹、蓖麻、擬南芥的MLO12基因都聚在同一個(gè)小分支上，與同屬于大戟科的橡膠樹親緣關(guān)系最近；另外MeMLO12與木薯MLO家族的MeMLO1、MeMLO4、MeMLO09、MeMLO10也在同一個(gè)大分支上，屬于同一個(gè)類群，親緣關(guān)系也較近，而與木薯MeMLO4、MeMLO11、MeMLO13，分屬于不同的類群，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4）。

2.1.3""MeMLO12基因的生物信息學(xué)分析""根據(jù)SPORT亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)MeMLO12基因編碼的蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，無信號(hào)肽（圖5）。TMHMM預(yù)測(cè)MeMLO12蛋白分別在23～45、74～96、161～183、285～307、312～334、371～393、413～435"aa處形成7次跨膜結(jié)構(gòu)域（圖6），跨膜結(jié)構(gòu)域是參與細(xì)胞與外界通信的特殊整合膜蛋白，說明該蛋白在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮獨(dú)特和重要的作用。

2.1.4""病原菌誘導(dǎo)對(duì)MeMLO12基因表達(dá)的影響""MLO基因是一類非常典型的感病基因，在寄主受病原菌侵染后起到負(fù)調(diào)控作用[9]。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖7），在供試的9份木薯種質(zhì)中，不同抗性水平的木薯種質(zhì)在接種0"h時(shí)MeMLO12基因表達(dá)量存在一定的差異，其中HN18"的表達(dá)量略高于其他種質(zhì)。以0"h作為對(duì)照，接種木薯黃單胞菌（GX11）均能誘導(dǎo)MeMLO12基因表達(dá)量的變化，且不同抗、感種質(zhì)間的表達(dá)量和表達(dá)模式差異顯著。從表達(dá)模式上看HN8、HN12、RXC09、H1701、CP1、SC205和GR4基本一致，黃單胞菌（GX11）接種12"h時(shí)MeMLO12基因的表達(dá)量比對(duì)照略有升高，之后呈逐漸上升的趨勢(shì)，直至48"h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，接種72"h后又逐漸下降，其中HN8、HN12、RXC09和H1701等4個(gè)抗病種質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量顯著高于感病種質(zhì)SC205、GR4和SC8。而HN18和SC8兩個(gè)種質(zhì)的表達(dá)模式又不同于其他種質(zhì)的表達(dá)模式，HN18在接種12"h時(shí)其表達(dá)就達(dá)到了峰值，24"h后表達(dá)量呈逐漸下降趨勢(shì)，72"h表達(dá)量最低；而SC8在接種24"h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，48"h后表達(dá)量顯著下降。說明不同抗性水平的木薯種質(zhì)中MeMLO12基因會(huì)隨著病程的發(fā)展而呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，在病原菌侵染初期，不論抗病種質(zhì)還是感病種質(zhì)，MeMLO12基因的表達(dá)量均會(huì)略有升高，此時(shí)也啟動(dòng)了寄主的免疫反應(yīng)來抑制病原菌的進(jìn)一步侵染，隨著病原菌和寄主之間相互作用增強(qiáng)，其表達(dá)量也達(dá)到峰值，接種72"h后均呈下降趨勢(shì)，進(jìn)一步推測(cè)MeMLO12基因可能參與木薯和黃單胞菌之間的互作，然而這種調(diào)控作用如何發(fā)揮還有待進(jìn)一步研究。

2.2""木薯MeMlo12基因CRISPR/-Cas9敲除載體構(gòu)建

2.2.1""sgRNA靶點(diǎn)選擇及其寡核苷酸鏈的合成""通過生物信息學(xué)分析，選擇該基因第11個(gè)外顯子進(jìn)行Snap"Gene"Viewer的分析，獲得了10"455條sgRNA的種子序列。通過對(duì)mismatchPos、mitOfftargetScore、cfdOfftargetScore分值的評(píng)價(jià)，保證靶點(diǎn)特異性，降低脫靶效應(yīng)。從候選的sgRNA的種子序列優(yōu)選了3條靶序列（表2），每條靶序列23"nt，堿基組成上3'末端含G結(jié)尾，將其構(gòu)建到CRISPR/-Cas9載體上。

用BbsⅠ對(duì)pSGR-Cas9-AT表達(dá)載體進(jìn)行酶切，切膠回收，將sgRNA引物退火合成雙鏈，用T4連接酶將雙鏈sgRNA連接到pSGR-Cas9-AT載體上，片段約8000"nt（圖8），轉(zhuǎn)化DH5α（Amp+），用M13F/oligo"2引物對(duì)擴(kuò)增sgRNA表達(dá)框載體，得到約350"nt的片段，經(jīng)測(cè)序片段序列與預(yù)期一致（圖9）。

2.2.2"nbsp;pSGR-Cas9-AT重組質(zhì)粒的驗(yàn)證""將轉(zhuǎn)化DH5α的陽性克隆送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用MEGA6.0軟件進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示3條靶序列均已成功構(gòu)建到預(yù)期的靶點(diǎn)位置上（圖10）。將測(cè)序正確的質(zhì)粒進(jìn)行Cas9元件的擴(kuò)增，獲得了250"nt左右的片段，與預(yù)期目的片段大小一致（圖11）。對(duì)已構(gòu)建好的靶序列載體進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)MeMloLO12的3條靶序列已經(jīng)成功構(gòu)建到基因編輯載體上，將其命名為pSGR-Cas9-AT-MeMLO12載體（圖12）。

3""討論

MLO基因是植物特有的一類感病S基因與植物的感病性有關(guān)，負(fù)調(diào)控植物的抗病過程。S感病基因功能的喪失會(huì)使植物獲得隱性遺傳抗性，其等位基因也正好彌補(bǔ)了抗病R基因抗性上的缺點(diǎn)，具有與R基因不同的抗病模式[27]。研究發(fā)現(xiàn)MLO蛋白定位在細(xì)胞膜上，中心疏水區(qū)域具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其N端在細(xì)胞外，通常是與配體結(jié)合，C端在細(xì)胞內(nèi)與G蛋白結(jié)合[28]。MLO家族基因在信號(hào)肽上存在一定差異，覃碧等[20]發(fā)現(xiàn)，木薯MeMLO8、MeMLO10和MeMLO18三個(gè)家族成員各有1個(gè)N端信號(hào)肽，這些信號(hào)肽均與第1次跨膜結(jié)構(gòu)存在重疊區(qū)，而本研究中的MeMLO12基因沒有信號(hào)肽，有別于其他家族成員。MLO基因廣泛參與植物多種生物和非生物脅迫反應(yīng)，在白粉菌侵染早期協(xié)助病原菌入侵寄主植株，調(diào)節(jié)寄主表皮細(xì)胞內(nèi)乳突的形成，在侵染位點(diǎn)抑制細(xì)胞壁產(chǎn)生H2O2，利于病原菌侵入，削弱了植物的防御能力[29-30]。當(dāng)MLO基因缺失或突變，將解除了對(duì)白粉菌的抗性和細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控，使植物產(chǎn)生了對(duì)白粉病持久、高效和廣譜抗性[31]。2014年，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞課題組，利用TALENs基因組編輯技術(shù)首次在六倍體小麥中對(duì)MLO基因的3個(gè)拷貝同時(shí)進(jìn)行了突變，獲得了對(duì)白粉病具有廣譜抗性的小麥材料，為植物抗病育種新材料或品種的創(chuàng)制提供了一個(gè)全新的思路和技術(shù)路線[32]。近些年通過基因編輯技術(shù)敲除MLO基因在很多植物如擬南芥、小麥、番茄等都通得到了對(duì)白粉病具有抗性的突變株[33-34]，擴(kuò)大了MLO基因的利用范圍。

細(xì)菌性萎蔫病是國內(nèi)木薯為害最為嚴(yán)重的病害，高溫高濕或臺(tái)風(fēng)雨后，能在短時(shí)間內(nèi)爆發(fā)流行，導(dǎo)致植株萎蔫枯死，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，病害的防治技術(shù)一直是制約木薯產(chǎn)業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的瓶頸問題[2]，傳統(tǒng)的銅基殺菌劑已經(jīng)對(duì)該病產(chǎn)生了抗藥性，不僅達(dá)不到預(yù)期防效，而且防治成本高，因此抗病種質(zhì)的鑒選與創(chuàng)制利用才是防治該病最有效且綠色環(huán)保的措施。然而，傳統(tǒng)的雜交育種周期長，需要多個(gè)世代，盡管目前有許多遺傳改良或基因修飾途徑，但均存在突變位點(diǎn)鑒定困難，基因表達(dá)不夠徹底，不能穩(wěn)定遺傳等諸多缺陷，而基因編輯技術(shù)相比于其他技術(shù)來說具有明顯的優(yōu)勢(shì)。另外，相較于抗病R基因，敲除感病S基因獲得的抗病性會(huì)更加持久，也更容易通過基因編輯技術(shù)操作[33]。所以利用基因編輯技術(shù)敲除植物的感病S基因來創(chuàng)制抗病新種質(zhì)是一條可靠的途徑。因此本研究對(duì)木薯MLO家族中與抗病性相關(guān)的MLO12基因進(jìn)行了全長克隆和表達(dá)特性分析。同時(shí)以MeMLO12基因?yàn)榘悬c(diǎn)，構(gòu)建了1個(gè)sgRNA表達(dá)盒的CRISPR/-Cas9載體pSGR-Cas9-AT-MeMLO12，并證明了該載體的有效性，為后續(xù)轉(zhuǎn)基因木薯的突變情況及遺傳穩(wěn)定性分析以及抗病木薯新種質(zhì)材料的創(chuàng)制提供新的途徑。

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