TaqMan實時熒光定量PCR法檢測對蝦肝腸胞蟲（EHP）步驟優(yōu)化

摘要" 優(yōu)化蝦肝腸胞蟲（EHP）的TaqMan實時熒光定量PCR檢測流程，目的是更準(zhǔn)確、快速地檢測出蝦苗，餌料，親蝦體內(nèi)攜帶的EHP。本研究采用酚/氯仿抽提法與水生動物病原體核酸提取試劑盒兩種DNA提取方法，對等量的病原組織樣本進行了對比提取。此外，還設(shè)置不同濃度的裂解液以探究其對病原組織裂解效果的影響，并設(shè)定不同裂解時間以優(yōu)化裂解步驟。最后，通過調(diào)整qPCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)，確定最佳的檢測條件。結(jié)果顯示，水生動物病原體試劑盒提取的DNA檢出率高于酚/氯仿抽提法提取，裂解液濃度90%時檢測出的EHP含量最高；裂解時間30"min時檢測出的EHP含量較高；循環(huán)數(shù)在40次時足以檢測出EHP。綜上，優(yōu)化后的檢測流程為用水生動物病原體核酸提取試劑盒提取病原組織DNA，裂解液濃度90%，裂解時間30"min及qPCR檢測條件的循環(huán)數(shù)控制在40次。

關(guān)鍵詞" 蝦肝腸胞蟲；DNA提??；條件優(yōu)化；TaqMan實時熒光定量PCR

中圖分類號" S945.1"""""" 文獻標(biāo)識碼" A"""""" 文章編號" 1007-7731（2024）21-0032-05

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.21.007

基金項目 國家自然科學(xué)基金“羅非魚CD209介導(dǎo)非特異性細胞毒性細胞（NCC）殺傷活性的分子機制”（32002426）；廣東省南美白對蝦現(xiàn)代種業(yè)產(chǎn)業(yè)園項目“南美白對蝦疫病防控體系的建立與實施”（K22219）。

作者簡介 李慰欣（2001—），女，福建龍巖人，碩士研究生，從事魚類免疫學(xué)及病害防控研究。

通信作者 黃瑜（1986—），男，安徽六安人，博士，副教授，從事魚類免疫學(xué)及病害防控研究。

收稿日期 2024-07-18

Optimization of the steps of TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR for the detection of Enterocytozoon hepatopenaei （EHP）

LI Weixin1，2""" CHEN Zhengsi1，2""" HUANG Yu1，2

（1College of Fishery， Guangdong Ocean University， Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animal， Zhanjiang 524088， China;

2Key Laboratory of Control for Disease of Aquatic Animals of Guangdong Higher Education Institutes， Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory， Zhanjiang 524088， China）

Abstract" Optimize the TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR detection process of Enterocytozoon hepatopenaei （EHP） to detect EHP in larvae， bait， and parent shrimps more accurately and quickly. Two DNA extraction methods， phenol/chloroform extraction and aquatic animal pathogen nucleic acid extraction kit， were used to compare and extract the same amount of pathogenic tissue samples. In addition， different concentrations of lysates were set up to investigate the effect of lysates on the lysate of pathogenic tissues， and different lysate times were set up to optimize the lysate steps. Finally， the optimal detection conditions were determined by adjusting the number of qPCR cycles.The results showed that the detection rate of DNA extracted by the aquatic pathogen kit was higher than that of the phenol/chloroform extraction method， and the highest content of EHP was detected when the concentration of lysis solution was 90%; The highest content of EHP was detected when the lysis time was 30"min; The number of cycles of 40 was sufficient to detect EHP. To sum up， the optimized procedure was as follows： use aquatic animal pathogen nucleic acid extraction kit to extract DNA from pathogenic tissues， the concentration of lysate was set at 90%， the lysis time was set at 30"min， and the number of cycles of qPCR was controlled at 40"times for the reaction.

Keywords" Enterocytozoon hepatopenaei; DNA extraction; condition optimization; TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR

蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei， EHP）是一種可以感染多種真核生物的專性細胞內(nèi)寄生蟲。Tourtip等[1]通過組織病理學(xué)、超微結(jié)構(gòu)和分子技術(shù)等手段對其進行分析研究，將這種新型胞子蟲命名為EHP。江海儀等[2]將其歸類為真菌界、微胞子蟲門、單倍期綱、壺胞目、腸胞蟲科、腸胞蟲屬。近年來，EHP的流行在一定程度上對蝦類養(yǎng)殖造成影響[3]。

EHP的檢測方法包括組織學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。李楠英等[4]研究表明，組織學(xué)技術(shù)較費時且繁瑣，特別是當(dāng)病原體處于低水平或潛伏期時，容易漏診或誤診，因此與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合，以做出更確切的診斷；分子生物學(xué)方法包括原位雜交技術(shù)、套式PCR以及TaqMan實時熒光定量PCR方法等。關(guān)于EHP的檢測，市場上出現(xiàn)了各式各樣的快速檢測試劑盒，其特點是便捷快速，但價格較高[5]。考慮到企業(yè)的生產(chǎn)規(guī)模和生產(chǎn)成本，普遍采用TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法。該方法通過對DNA模板的定量，來實現(xiàn)對病原的檢測，對分析微孢子蟲載量和開展病原防控研究具有重要意義。從樣品核酸提取到檢驗完成，整個檢測反應(yīng)只需2"h，大大提高了EHP檢測效率[6]。駱云慧等[7]研究表明，這種方法對EHP標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的檢測靈敏度和檢測效率比常規(guī)PCR高數(shù)10倍，從樣品核酸提取到檢驗完成，檢測時間在2～3"h，可以滿足蝦苗培育基地大量檢測樣品的需求。張娜等[8]研究顯示，TaqMan實時熒光定量PCR方法比組織學(xué)方法和套式PCR方法準(zhǔn)確性更高，靈敏性更強。因此，為了在蝦苗培育階段保證EHP的檢測覆蓋率，及檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率和穩(wěn)定性，有必要對蝦肝腸胞蟲的TaqMan實時熒光定量PCR檢測流程進行優(yōu)化。劉珍等[9]對實時熒光定量PCR反應(yīng)中的引物濃度、探針濃度、退火溫度和反應(yīng)循環(huán)數(shù)等條件進行優(yōu)化，建立了EHP的SYBR Green I實時定量PCR檢測方法，該方法靈敏度高、成本低且操作簡單，適用于親蝦、苗種的快速檢測。篩選簡單易行、靈敏準(zhǔn)確的EHP檢測方法可為EHP早期預(yù)防控制提供便利。

目前針對EHP的檢測方法大多是從特異性引物角度出發(fā)，在PCR檢測程序上做優(yōu)化，以建立一套新穎的檢測流程，而有關(guān)EHP組織DNA的提取方法研究有待進一步深入，本研究從DNA提取流程和檢測程序兩部分對整個檢測流程進行優(yōu)化，提高蝦苗組織的EHP檢出準(zhǔn)確性，為種苗產(chǎn)品的質(zhì)量檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗品種 2022年5月在山東濰坊某養(yǎng)殖場采集發(fā)病凡納濱對蝦30尾，體重30"g左右，每一尾蝦用95%的乙醇溶液保存。

1.1.2 試驗試劑及器材 水生動物病原體核酸提取試劑盒（離心柱法）V2.0、EHP核酸檢測試劑盒V2.0（廣州華峰生物科技有限公司），PBS緩沖液、TE緩沖液、PCR八聯(lián)管、1.5"mL離心管、0.2"mL薄壁管、2"mL離心柱和細胞裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司），10× Ex Taq Buffer和Premix Taq（Ex Taq V2.0）（上海百賽生物技術(shù)有限公司），高速離心機、熒光定量PCR儀（博日FQD-16BEA4）。

1.2 試驗方法

根據(jù)EHP的檢測步驟和蝦苗培育基地實驗室的客觀條件，通過以下幾個方面對檢測流程進行優(yōu)化并設(shè)計試驗：DNA的提?。ㄎr肝腸胞蟲DNA用作陽性對照）與PCR反應(yīng)條件的調(diào)控。

1.2.1 不同方式提取DNA （1）使用水生動物病原體核酸提取試劑盒（離心柱法） 提取DNA。步驟如下：取0.5"g的病蝦肝胰腺置于1.5"mL的EP管中，分別加入少量無菌水，用小型電鉆將其充分研磨，做好標(biāo)記；分別取磨碎后的樣品至3個新的離心管內(nèi)，12"000"r/min，離心10"s，加入700"μL裂解液，充分混勻，使樣品充分接觸裂解液，靜置15"min。取3個離心柱，分別加入500"μL離心柱活化液進行活化，12"000"r/min，離心1"min，棄濾液，套上離心柱收集管備用。靜置后，離心管內(nèi)樣品12"000"r/min，離心1"min，將樣品轉(zhuǎn)移到活化后的離心柱中，12"000"r/min，離心1"min，棄濾液；加入700"μL 95%無水乙醇，12"000"r/min，離心1"min，棄濾液；12"000"r/min，離心2～3"min，將離心柱晾干，再轉(zhuǎn)移至新的1.5"mL的離心管內(nèi)，開蓋放置1～2"min，使無水乙醇完全揮發(fā)，再懸空滴加30～60"μL TE緩沖液，室溫靜置3"min后，12"000"r/min，離心1"min，將液體樣品放入-20"℃的冰柜內(nèi)保存。

（2）使用酚/氯仿抽提法提取DNA。該方法具體操作過程如下。取50"μL樣品和100"μL"細胞裂解液于0.2"mL的薄壁管中，做好標(biāo)記。將薄壁管放入PCR儀內(nèi)中加熱30"min，加入700"μL"DNA提取液（酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1），顛倒充分混勻，分別將薄壁管中的液體吸到離心柱內(nèi)，1"000"r/min，離心1"min，棄濾液。加500"μL"95%無水乙醇溶液，1"000"r/min，離心1"min（重復(fù)2次），棄濾液后離心2"min，分別將離心柱放置在新的薄壁管上，開蓋室溫放置2"min，加50"μL"TE緩沖液，離心2"min，丟棄吸附柱，將液體樣品放入-20"℃的冰柜內(nèi)保存。

1.2.2 不同濃度的細胞裂解液提取DNA 在提取DNA時的細胞裂解步驟中分別用3種不同濃度的細胞裂解液對病原體組織進行裂解，分別是50%，75%和90%，裂解時間均為15"min，其余步驟按提取試劑盒的方法操作。PCR反應(yīng)體系如表1所示，反應(yīng)程序如表2所示。

1.2.3 不同裂解時間提取DNA 設(shè)置3個裂解時間分別為15、30和45"min，裂解液濃度保持不變，均為90%，其余步驟按提取試劑盒的方法操作。

1.2.4 引物設(shè)計和反應(yīng)條件 根據(jù)NCBI公布的EHP基因組信息，使用Primer 5軟件設(shè)計EHP核酸序列引物，由廣州生工技術(shù)公司合成。該反應(yīng)總體系20 μL，由Premix Taq（DNA Polymerase、Buffer和dNTP Mixture的2倍濃度的混合物）、10× Ex Taq Buffer、EHP引物（EHP-F：5’-AGTAACTATGCCGACCA；EHP-R：AATTAAGCAGCACAATCC-3’）、TaqMan探針（5’-TCCTGGTAGTGTCCTTCCGT-3’）、ddH2O和模板DNA組成。具體用量如表1所示，實時熒光定量PCR反應(yīng)條件如表2所示。

1.2.5 不同循環(huán)次數(shù)檢測DNA 按水生動物病原體試劑盒方法提取的病原體核酸分別采用兩種不同的反應(yīng)程序進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，程序1循環(huán)40次（表2），程序2循環(huán)50次（表3），探針的標(biāo)記熒光基團選擇FAM；淬滅基團選擇None。

1.3 測定指標(biāo)和方法

PCR反應(yīng)程序運行結(jié)束后，在程序分析中獲得樣品檢測的CT值。CT值是檢測出EHP病原所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)。CT值越小，說明所檢測的病原EHP的含量越高。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行歸納整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方式選擇

用酚/氯仿抽提法和試劑盒法對病原體的核酸提取后進行PCR檢測，結(jié)果如表4所示。酚/氯仿抽提法提取的DNA出現(xiàn)CT值檢測不出的情況，結(jié)果顯示陰性；用試劑盒法提取的DNA，可以穩(wěn)定地檢測出CT值。因此，在實際試驗中需選擇合適的提取試劑盒，來提高DNA獲得率，以提高EHP的檢出率。

2.2 檢測條件優(yōu)化

2.2.1 不同的裂解濃度 由表5可知，不同濃度的細胞裂解液（50%、75%和90%）裂解組織，進行PCR檢測，得到的CT值具有一定差距。50%組的平均CT值最高，為39.14；75%組平均CT值33.66；90%組的平均CT值最低，為30.64。說明90%濃度的細胞裂解液提取的DNA質(zhì)量較好，檢出的EHP含量較高。

2.2.2 不同的裂解時間 由表5可知，對病原體組織進行同一濃度細胞裂解液但不同裂解時間（15、30和45"min）處理，進行PCR檢測，得出的CT值有所不同。15"min組的平均CT值最高，為36.64；30"min組的平均CT值30.64，45"min組的平均CT值最低，為28.60。結(jié)果表明，適當(dāng)延長時間可提高EHP的檢測率。實際試驗中考慮時間效率問題，可選擇裂解時間30"min。

2.2.3 不同的循環(huán)次數(shù) 由表5可知，循環(huán)次數(shù)在40時，平均CT值36.64；當(dāng)循環(huán)次數(shù)增加到50次，平均CT值36.64。兩者平均CT值相同，說明循環(huán)40次時足以檢測出EHP。

3 結(jié)論和討論

蝦肝腸胞蟲病是一種由鞭毛體寄生于肝胰腺的原蟲病，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中一種常見的傳染性疾病[10]。EHP的感染不僅導(dǎo)致蝦類的生長緩慢，也對水產(chǎn)品的品質(zhì)和經(jīng)濟效益產(chǎn)生影響[11]。因此，準(zhǔn)確地檢測出EHP的感染狀況對蝦肝腸胞蟲病的防治工作具有重要意義。劉寶彬等[12]研究表明，TaqMan實時熒光定量PCR是常用的EHP檢測方法，相較于普通PCR，能夠同時實現(xiàn)定性和定量的分析，且整個檢測時間可控制在2"h內(nèi)，具有較好的時效性。適合水產(chǎn)種苗生產(chǎn)基地每天大量的樣品檢測。

目前，在對蝦種苗培育基地質(zhì)量檢測實驗室中，EHP的檢測步驟主要有以下幾個方面。（1）采集樣本：從蝦苗體內(nèi)或周圍環(huán)境中采集可能攜帶EHP病原的樣本，如蝦苗的體液、組織、糞便和水樣等。（2）樣品處理：將采集到的樣本進行處理，如消毒、過濾和離心等，以提高樣品的檢測靈敏度和準(zhǔn)確性。（3）分離純化：將樣品分離出可能存在的病原生物，進行純化處理，以便進一步鑒定和檢測。（4）鑒定檢測：對分離純化后的病原生物進行鑒定和檢測，如顯微鏡觀察、生化試驗和分子生物學(xué)檢測等，以確定病原類型和數(shù)量。（5）結(jié)果分析：根據(jù)鑒定和檢測結(jié)果，分析可能存在的病害為害和風(fēng)險，并制訂相應(yīng)的防治措施。魏俊利等[13]通過使用商品化海洋動物DNA提取試劑盒，酚/氯仿抽提等方法對EHP進行基因組DNA提取，研究發(fā)現(xiàn)，海洋動物DNA提取試劑盒提取的EHP基因組濃度高于氯仿抽提法。與本研究得出的結(jié)果一致。劉珍等[9]建立的實時熒光定量PCR檢測EHP的方法，通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，表明qPCR擴增效果最好的退火溫度為60"℃。雷燕等[6]通過優(yōu)化PCR擴增條件，建立了快速檢測凡納濱對蝦EHP的PCR方法。但是，在檢測樣本的準(zhǔn)備過程中，還存在許多需進一步優(yōu)化的步驟。

本研究采用酚/氯仿抽提法和水生動物病原體核酸提取試劑盒對病蝦組織進行DNA的提取，將提取的DNA進行TaqMan實時熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明，商業(yè)化水生動物病原體核酸提取試劑盒法比酚氯仿抽提法更適用于蝦苗培育基地生產(chǎn)過程中對蝦苗病原檢測時DNA的提取。本研究在試劑盒提取DNA的條件下，通過不同濃度的細胞裂解液，不同裂解時間和不同循環(huán)次數(shù)，對檢測流程進行優(yōu)化，以提高DNA提取質(zhì)量，提升EHP檢測準(zhǔn)確度、靈敏度和穩(wěn)定性。綜上，優(yōu)化后的方案為采用水生動物病原體核酸提取試劑盒對病原組織核酸進行提取，裂解液濃度90%，裂解時間30"min，PCR檢測條件的循環(huán)次數(shù)控制在40次。本方案在不增加成本的基礎(chǔ)上，進一步提高了EHP檢測精確度和靈敏度，為對蝦種苗公司培育高質(zhì)量苗種提供參考。

參考文獻

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（責(zé)任編輯：胡立萍）