不同氮水平下外源褪黑素對鎘脅迫煙草幼苗生長及鎘積累的影響

關鍵詞：煙草幼苗；褪黑素；鎘積累；硝態(tài)氮；非生物脅迫

中圖分類號：S572.01 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）11-0106-08

鎘（Cd）是一種用途廣泛的金屬，也是對生物體構成有害影響的元素之一。過量的Cd²⁺可能引發(fā)植物一系列嚴重的形態(tài)、生理和代謝紊亂，例如光合作用和蒸騰作用受到抑制、碳水化合物代謝紊亂、蛋白質(zhì)降解和脂質(zhì)過氧化。研究表明，低濃度的Cd對植物生長有一定的刺激作用。然而，過量的Cd會干擾植物細胞的新陳代謝和離子平衡，導致植株生長減慢、葉片變黃，作物生物量、品質(zhì)和產(chǎn)量下降，甚至死亡。

褪黑素（melatonin，MT）是一種普遍存在于生物有機體的具有兩親性的吲哚雜環(huán)類化合物。褪黑素作為一種抗氧化劑參與植物脅迫的應激反應，清除植物體內(nèi)過量的活性氧（ROS）和活性氮，減少細胞的活性氧損傷。MT還充當植物生理調(diào)節(jié)劑，其在植物中的生理功能主要表現(xiàn)在：調(diào)節(jié)植物生長、調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律和光周期反應，提高植物抗逆性和抗氧化作用。劉自力等研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，100μmol/L MT處理顯著提高小白菜幼苗的生物量和光合參數(shù)，并顯著降低鎘含量，減弱鎘生長抑制和光抑制，從而提高煙草對鎘的耐受性。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可降低煙苗中HMA2和HMA4的轉(zhuǎn)錄水平，從而降低Cd從根部到木質(zhì)部的易位效率，并且抑制Cd誘導的IRT1和Nramp1轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)，從而減少葉片中Cd的積累。另一項研究表明，100μmol/LMT和地衣芽孢桿菌處理可以增強菠菜的SOD、POD、CAT活性，從而促進對Cd的應激防御。Zhao等發(fā)現(xiàn)，寒冷脅迫下用200μmol/L MT處理可增強黃瓜幼苗的AsA-GSH循環(huán)酶活性，上調(diào)AsA-GSH循環(huán)酶生物合成相關基因的表達，激活AsA-GSH循環(huán)，維持氧化還原平衡，提高黃瓜幼苗的抗寒性。煙草屬于富集和轉(zhuǎn)運鎘能力較強的經(jīng)濟作物，MT提高鎘的耐受性在煙草上也得到證實：與對照相比，葉面噴施褪黑激素（特別是100μmol/L處理）減少煙草中的鎘積累，減弱鎘生長抑制和光抑制，從而提高煙草對鎘的耐受性。

氮素在提高植物鎘耐受性方面發(fā)揮著關鍵作用，高硝態(tài)氮可以提高植物的鎘耐受性。最新的研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以提高植物氮代謝及其基因的表達、提高酶活性、增強氮素的吸收與利用，從而提高植物對各種逆境脅迫的耐受性（冷害、干旱等）。重金屬鎘脅迫是一種重要的逆境脅迫，推測褪黑素可能與不同用量氮素互作而影響植物的鎘耐受性，但到目前為止，其影響機制仍不清楚。因此，本試驗采用水培方法，研究不同硝態(tài)氮水平與鎘脅迫處理下，噴施外源褪黑素對煙草幼苗抗性生理特征及鎘積累的影響，旨在探明其在緩解Cd脅迫過程中的作用，為摸清外源褪黑素調(diào)控煙草對Cd的耐受生理機制和進一步揭示煙草耐Cd機理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料與煙苗培育

試驗于2022年在河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院品質(zhì)生態(tài)實驗室的人工氣候室內(nèi)進行。供試煙草品種為K326，由河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院育種實驗室提供。褪黑素試劑購于北京索萊寶科技有限公司。

試驗采用無土栽培育苗。將煙草種子消毒后用無菌水清洗3次，點至育苗盤，并放置在人工智能培養(yǎng)箱中（晝／夜溫度：28℃/25℃：晝／夜時長：14 h/10 h；濕度70%±5%）培養(yǎng)30d后移栽到盛有l(wèi)/2Hoagland營養(yǎng)液的蛭石盆（規(guī)格：上、下口徑分別為11、10cm，高8cm）中，每盆5株。待煙苗長至四葉一心時，挑選生長狀況一致且健壯的煙苗移栽至5L水培盒中開展后續(xù)試驗。

1.2試驗設計與處理方法

本試驗以NaNO₃作為氮源，將煙苗移栽至盛有不同濃度硝態(tài)氮的Hoagland營養(yǎng)液中進行3d馴化，而后同時進行Cd處理和MT噴施處理。本試驗以CdCl₂·2.5H₂O作為鎘源，加入去離子水溶解并配制成1mmol/L母液，之后試驗過程中加入Hoagland營養(yǎng)液稀釋至目標濃度（20μmol/L），營養(yǎng)液的更換頻率為3d更換一次：同時連續(xù)噴施100μmol/L MT溶液7d，每株噴10 mL。MT噴施在上午進行，噴至葉片正反兩面均勻布滿水珠為宜，噴施后進行黑暗處理th，噴施間隔為24 h。

試驗設置3個氮素營養(yǎng)條件，分別為高氮（Nl0：10 mmol/L）、正常供氮（N5：5 mmol/L）、低氮（NO.1：0.1mmol/L）。試驗共設9個處理，分別為高氮營養(yǎng)條件下的NlO-Control、NlO-Cd、Nl0-Cd-MT;常氮營養(yǎng)條件下的N5-Control、N5-Cd、N5-Cd-MT;低氮營養(yǎng)條件下的NO.1 -Control、NO.l-Cd、NO.1-Cd-MT，每處理重復3次。處理后14 d記錄煙苗表型并取樣進行指標測定。

1.3測定指標及方法

1.3.1煙苗表型及生物量測定 煙樣生物量（干重）用電子天平（型號：FB224）稱量。

1.3.2葉片抗氧化酶活性及MDA含量測定 SOD（超氧化物歧化酶）、POD（過氧化物酶）、CAT（過氧化氫酶）、APX（抗壞血酸過氧化物酶）活性均采用試劑盒（北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品）說明書中的微量法測定；MDA（丙二醛）含量采用試劑盒說明書（蘇州科銘生物技術有限公司產(chǎn)品）中的可見分光光度法測定。

1.3.3葉片AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)測定 AsA（抗壞血酸）、DHA（氧化型抗壞血酸）、GSH（還原型谷胱甘肽）、GSSG（氧化型谷胱甘肽）含量均采用試劑盒（北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品）說明書中的微量法測定。

1.3.4煙苗鎘濃度測定 鎘濃度采用濕式消解法[15]進行前處理，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS 7500A，美國Agilent產(chǎn)品）測定。轉(zhuǎn)運系數(shù)=地上部Cd含量／根部Cd含量：轉(zhuǎn)移系數(shù)=地上部Cd積累量／根部Cd積累量：滯留系數(shù)=根部Cd積累量／單株Cd積累量。

1.3.5基因表達分析 對各處理煙苗進行根部取樣，并根據(jù)GenBank發(fā)布的煙草Cd轉(zhuǎn)運相關基因序列設計擴增引物，以煙草核糖體蛋白編碼基因Nt L25為內(nèi)參基因，具體引物信息見表1。采用Trizol法提取煙苗根部總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照Vazyme公司的qPCR Master Mix（Taq Pro Universal SYBR）試劑盒說明書進行實時定量RT-PCR，每個樣品重復3次。實時定量的結(jié)果采用2^-ΔΔCt方法進行分析。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

采用Micorosoft Excel 2021和SPSS 2018軟件進行數(shù)據(jù)整理與分析，采用Origin 2021作圖。

2結(jié)果與分析

2.1不同硝態(tài)氮水平下外源MT對鎘脅迫煙草幼苗表型及生物量的影響

由圖1可知，不同硝態(tài)氮水平下噴施MT能夠緩解Cd毒害，且處理間存在顯著差異。Cd脅迫下煙草幼苗地上部生物量顯著降低，根系發(fā)育受到顯著抑制：噴施MT后地上部生物量和根系表型顯著緩解，地上部生物量不同硝態(tài)氮水平間差異顯著，單株生物量與Cd脅迫處理相比分別提高87.50%、75.61%和89.29%。表明，鎘脅迫下外源MT可有效提高幼苗生物量，N10和NO.1水平提升效果更好。

2.2不同硝態(tài)氨水平下外源MT對鎘脅迫煙草幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響

由圖2可知，N10水平下Cd脅迫均提高煙葉SOD、POD、CAT、APX活性且除SOD外均達到顯著水平，而NO.1水平下Cd脅迫卻顯著抑制煙葉SOD、POD、APX活性，表明硝態(tài)氮可促進煙草幼苗抗氧化系統(tǒng)的修復，維持氧化還原平衡。Cd脅迫下噴施MT處理中煙苗SOD、POD、CAT、APX活性大多顯著高于單一Cd處理，其中SOD、POD、APX活性隨硝態(tài)氮濃度增加而增加。與單一Cd處理相比，N5、NO.1水平下Cd脅迫噴施MT處理中煙苗MDA含量顯著降低，且MDA含量隨硝態(tài)氮濃度增加而降低。說明硝態(tài)氮可促進外源MT提高幼苗的抗氧化酶活性，緩解Cd毒害引起的膜脂過氧化反應，促進煙苗生長。

2.3不同硝態(tài)氨水平下外源MT對鎘脅迫煙草幼苗AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的影響

AsA、DHA、GSH、GSSG是參與AsA-GSH循環(huán)的關鍵非酶化合物。圖3顯示，Cd脅迫下，煙草幼苗AsA、GSH含量顯著降低且隨硝態(tài)氮濃度增加而增加，DHA、GSSG含量顯著增加且隨硝態(tài)氮濃度增加而降低。與單一Cd處理相比，Cd脅迫下噴施MT處理煙草幼苗中除NO.1水平下AsA增加不顯著外，其他氮水平下AsA和GSH含量均顯著增加，且隨硝態(tài)氮濃度增加而增加；Cd脅迫下噴施MT可顯著降低DHA、GSSG含量，且DHA、GSSG含量隨硝態(tài)氮濃度降低呈上升趨勢。表明，鎘脅迫下，硝態(tài)氮可促進外源MT加快AsA-GSH循環(huán)的進行，以此來減少ROS積累。

2.4不同硝態(tài)氨水平下外源MT對鎘脅迫煙草幼苗鎘濃度及其積累量的影響

由圖4可知，未添加Cd時，不同硝態(tài)氮水平下煙草幼苗地上部和地下部均未檢出Cd。Cd處理后14d，不同硝態(tài)氮水平下地上部Cd濃度表現(xiàn)為N10gt;N5gt; NO.1，地下部Cd濃度也表現(xiàn)為N10gt;N5gt;NO.1，且不同處理間差異達到顯著水平。噴施MT處理后，幼苗地上部和地下部Cd濃度均顯著下降，并隨硝態(tài)氮濃度降低而降低，與Cd處理相比，N10、N5、NO.1處理地上部Cd濃度降幅分別為18.62%、16.10%、20.77%，地下部Cd濃度降幅分別為12.75%、13.23%、11.91%，其中地上部Cd濃度中Nl0、NO.1水平下降幅較大，地下部Cd濃度降幅呈相反趨勢。

由表2可以看出，Cd脅迫下Nl0處理（N10-Cd）煙草幼苗地上部Cd累積量最大，噴施MT后N10處理（N10-Cd-MT）地上部和根系Cd積累量分別減少3.33%、-18.10%，N5-Cd-MT處理分別減少6.68%、-29.41%，NO.1-Cd-MT處理分別減少12.29%、8.33%；3個氮水平下各處理單株Cd積累量均降低且N5、NO.1水平下達到顯著水平。表明外源MT可抑制煙苗Cd的積累。

此外，隨著硝態(tài)氮濃度的降低，Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)呈現(xiàn)出先增加再降低的趨勢，其中Nl0條件下各處理Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)高于NO.1，NO.1條件下各處理Cd轉(zhuǎn)運系數(shù)高于N10;滯留系數(shù)變化趨勢與兩者相反，噴施MT后，Cd滯留系數(shù)增加。說明硝態(tài)氮可促進煙草幼苗生長，提高Cd的吸收與轉(zhuǎn)運：硝態(tài)氮可促進外源MT提高根對Cd的滯留能力，降低Cd從根系向地上部的轉(zhuǎn)運。

2.5不同硝態(tài)氧水平下外源MT對鎘脅迫煙草幼苗根部鎘吸收轉(zhuǎn)運相關基因表達的影響

煙苗根部Cd吸收轉(zhuǎn)運相關基因表達結(jié)果（圖5）顯示，Cd脅迫后，N10水平下NtIRT1、Nt-NRAMP3、Nt HMA2的相對表達量顯著降低，N5水平下Nt IRT1、NtNRAMP3的相對表達量顯著降低，NO.1水平下NtNRAMP1的相對表達量顯著降低。與單一Cd脅迫相比，Cd脅迫下外施MT后N10水平中NtIRT1、NtNRAMP1、NtHMA2、NtHMA3的相對表達量不同程度地降低，而NO.1水平中Nt-IRT1、NtNRAMP1、Nt HMA3的相對表達量大多顯著增加，且NtIRT1、NtNRAMP3、NtHMA2的相對表達量隨硝態(tài)氮濃度的降低而降低。說明外源MT可通過下調(diào)Cd吸收及轉(zhuǎn)運相關基因的表達來抑制煙苗對Cd的吸收，硝態(tài)氮的增施可促進MT對Cd吸收的抑制。

3討論

植物農(nóng)藝性狀作為評價植株生長狀況的指標之一，可以直觀地展現(xiàn)出植株的表觀特征。本研究結(jié)果顯示.Cd脅迫下煙草幼苗生物量顯著降低，植株生長受到抑制，而噴施MT后煙苗生物量得到有效恢復，其中生物量隨硝態(tài)氮濃度的增加而增加。表明，增施硝態(tài)氮和外源MT對提升幼苗生物量具有積極作用，促進幼苗生長，緩解鎘對煙草幼苗的毒害作用。

在非生物脅迫中，植物通過調(diào)節(jié)各種相關酶活性及物質(zhì)含量來增強抗氧化防御體系，防止ROS的過度積累，保護細胞膜的通透性和完整性。外源MT會影響植物中的抗氧化酶活性。外施MT可增加干旱脅迫下蘋果葉片的CAT和POD活性。本研究中，Cd脅迫對煙草幼苗SOD、POD、CAT、APX活性均有顯著影響；Cd脅迫下噴施MT可進一步提高其活性，且隨著硝態(tài)氮濃度的增加呈上升趨勢。表明高硝態(tài)氮（N10）可促進外源MT提高煙苗抗逆性。除此之外，AsA和GSH是主要的非酶抗氧化劑，在細胞中起到氧化還原緩沖作用，維持ROS穩(wěn)態(tài)，所以AsA與GSH在氧化應激中至關重要。本試驗中，Cd脅迫下外施MT可顯著增加AsA、GSH含量，降低DHA、GSSG含量，且隨著硝態(tài)氮濃度的增加其促進作用增強。這表明，高硝態(tài)氮（N10）可促進外源MT通過觸發(fā)煙苗非酶和酶抗氧化系統(tǒng)來維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，以防止Cd誘導氧化應激反應的發(fā)生。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，是植物葉片衰老的標志，對Cd毒害誘導的氧化損傷極為敏感。本試驗中，Cd脅迫下外施MT各處理間MDA含量顯著下降，MDA含量隨硝態(tài)氮濃度增加而減少。說明硝態(tài)氮與外源MT互作對緩解煙草幼苗膜脂過氧化反應有積極作用，硝態(tài)氮能夠促進煙苗生物量積累和代謝物質(zhì)的合成，從而提高煙苗自身的防御機制。

本研究結(jié)果顯示，噴施MT可顯著降低煙苗Cd濃度，這與劉仕翔等的研究結(jié)果一致。就不同硝態(tài)氮水平而言，Cd脅迫下，煙草幼苗Cd吸收及累積量隨硝態(tài)氮濃度增加而增加：N10處理Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)大于NO.1處理，外施MT后N10處理Cd滯留能力和轉(zhuǎn)運能力小于NO.1，說明硝態(tài)氮可促進煙苗對Cd的吸收與積累，促進MT對Cd吸收的抑制作用。值得注意的是，無論是單一Cd處理還是Cd脅迫下外施MT處理，Nl0水平下幼苗地上部和根系的Cd濃度及累積量最高，根系對Cd的吸收和滯留能力高于其他處理。這表明硝態(tài)氮可增強根部對Cd的耐受性，其原因可能是煙草中的Cd發(fā)生化學螯合作用生成不易被植物利用的螯合物，減少Cd向地上部的遷移，增加了根對Cd的滯留能力。

對Cd脅迫下N10處理的Cd吸收轉(zhuǎn)運關鍵基因的表達分析發(fā)現(xiàn)，NtIRT1、NtNRAMP1、Nt皿MA2、Nt HMA3在外施MT條件下低表達是導致煙苗Cd含量顯著降低的主要原因，對Cd脅迫下NO.1處理的Cd轉(zhuǎn)運關鍵基因的表達分析發(fā)現(xiàn)NtNRAMP3和Nt HMA2在Cd脅迫下低表達是導致煙苗Cd積累較低的主要原因，而NO.1水平中Nt IRT1、NtVtNRAMP1、NtHMA3的相對表達量上調(diào)是煙苗根系Cd積累量增加的原因，說明Nl0水平下外源MT可通過降低NtIRT1、NtNRAMP1、Nt-HMA2、Nt HMA3的表達來抑制煙苗對Cd的吸收，N0.1水平下外源MT可通過上調(diào)NtIRT1、Nt-NRAMP1、Nt HMA3的表達來促進煙苗Cd的轉(zhuǎn)運。

4結(jié)論

不同硝態(tài)氮水平下外源MT對Cd脅迫的緩解能力存在差異。（1）高硝態(tài)氮（N10）下外施MT可顯著提高煙草生物量和抗氧化酶活性，降低MDA含量，提高煙草Cd的耐受性。這可能是由于硝態(tài)氮增強了煙草幼苗自身的免疫能力，并促進Cd²⁺的螯合沉淀，降低活性Cd對煙草幼苗的毒害，提高了自身對Cd的耐受性。（2）低硝態(tài)氮（NO.1）下外施MT對提高煙草Cd耐受性的效果并不明顯，但可有效降低煙草的Cd吸收能力，從源頭上緩解Cd對煙草生長的毒害作用。其原因可能是，低氮下煙草幼苗生物量下降、生長活性降低，從而導致根系吸收能力下降。總的來說，高硝態(tài)氮有助于MT緩解鎘脅迫，效果最好。