骨傷三方對膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的影響研究

【摘要】目的 探討骨傷三方治療膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）對軟骨退變的影響及其作用機(jī)制。方法 選取2021年1月至2023年8月于廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院進(jìn)行膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的42例患者的關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)退變軟骨，所有標(biāo)本放于液氮中保存，以隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和骨傷三方組，各21例。分離、提取并培養(yǎng)KOA患者軟骨細(xì)胞，骨傷三方組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)時加入骨傷三方提取物400 μL干預(yù)，對照組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)時則加入等量的生理鹽水，均培養(yǎng)72 h，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測兩組軟骨細(xì)胞miRNA-140基因表達(dá)水平；采用蛋白免疫印跡法檢測兩組軟骨細(xì)胞磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）蛋白表達(dá)水平；采用MTT檢測兩組軟骨細(xì)胞24、48、72 h的活性。結(jié)果 干預(yù)后，骨傷三方組的miRNA-140表達(dá)水平高于對照組（Plt;0.05）；干預(yù)后，骨傷三方組PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)量均低于對照組（均Plt;0.05），且骨傷三方組PI3K、AKT、mTOR熒光檢查蛋白印跡灰度比明顯低于對照組。培養(yǎng)24～72 h，兩組軟骨細(xì)胞組織的吸光度值（OD）均逐漸升高，且各時間點(diǎn)骨傷三方組均高于對照組（均Plt;0.05）。結(jié)論 骨傷三方可上調(diào)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞miRNA-140的表達(dá)量，降低PI3K/AKT/mTOR通道相關(guān)蛋白表達(dá)量，繼而增強(qiáng)軟骨細(xì)胞活性，以抑制關(guān)節(jié)軟骨退變，延緩KOA的發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】膝骨關(guān)節(jié)炎 ; 軟骨細(xì)胞 ; miRNA-140 ; 磷脂酰肌醇-3激酶 ; 蛋白激酶B ; 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

【中圖分類號】R593.24+1 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-3718.2024.21.0014.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.21.005

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis， KOA）是骨科常見的退行性疾病，主要發(fā)生于老年人群，該病主要是由生物學(xué)因素和力學(xué)因素共同作用誘發(fā)，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變，進(jìn)而出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)疼痛、活動障礙甚至畸形，嚴(yán)重影響患者的正常生活。中醫(yī)將KOA歸屬于“膝痹”范疇，臨床將KOA辨證分型分為氣滯血瘀、肝腎虧虛、氣血虛弱、濕熱痹阻證、寒濕痹阻證等5種分型，而對于老年患者主要以肝腎虧虛證型為主，其病因病機(jī)主要是肝腎不足、風(fēng)寒濕邪氣外侵，屬本虛標(biāo)實(shí)證[1]。中醫(yī)藥治療KOA目前在臨床中得到了普遍的應(yīng)用，常用的中藥方劑有獨(dú)活寄生湯、補(bǔ)腎活血湯等。本研究所用的骨傷三方是廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院治療KOA的常用方劑，包含菟絲子、黃芪等多味中藥，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效，在臨床治療中可改善KOA患者的臨床癥狀，但對于骨傷三方治療KOA的具體分子生物學(xué)機(jī)制尚未明確。KOA以軟骨退變?yōu)橹?，其生物學(xué)變化是軟骨細(xì)胞的增殖、凋亡失調(diào)。在骨骼系統(tǒng)中，微小RNA（miRNA）在蛋白翻譯水平精細(xì)調(diào)控軟骨細(xì)胞的分化，影響軟骨的生長發(fā)育，且目前研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-140在骨性關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞中的表達(dá)量顯著降低[2]。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路屬于細(xì)胞內(nèi)信號通路，主要調(diào)控細(xì)胞增殖、存活、凋亡等。有報道稱，該信號通路相關(guān)蛋白在骨性關(guān)節(jié)炎患者細(xì)胞中表達(dá)量升高，抑制該條通路磷酸化對于骨性關(guān)節(jié)炎具有保護(hù)作用[3]?；诖?，本研究通過研究軟骨細(xì)胞miRNA-140、PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)情況，探討骨傷三方干預(yù)對膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制，為臨床治療該病提供應(yīng)用基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年1月至2023年8月廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院進(jìn)行膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的42例KOA患者的關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)退變軟骨，所有標(biāo)本放于液氮中保存，以隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和骨傷三方組。其中男性9例，女性33例；年齡60～78歲，平均（69.14±4.95）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合《膝骨關(guān)節(jié)炎階梯治療專家共識（2018年版）》 [4]中KOA的診斷標(biāo)準(zhǔn)；⑵符合中醫(yī)《膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療指南（2020年版）》 [5]中“膝痹”的診斷標(biāo)準(zhǔn)，辨證為肝腎虧虛證，主癥為關(guān)節(jié)隱隱作痛，次癥為腰膝酸軟無力，酸困疼痛，遇勞更甚，舌質(zhì)紅，舌苔，脈沉細(xì)無力；⑶根據(jù)臨床癥狀、體征、病史、影像學(xué)檢查確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、滑膜軟骨瘤病、剝脫性骨軟骨炎、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎；⑵合并惡性腫瘤。本研究經(jīng)廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（編號2020083），所有入選研究對象均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 骨傷三方：菟絲子20 g、黃芪20 g、肉蓯蓉30 g、山萸肉15 g、熟地黃20 g、白術(shù)15 g、木瓜15 g、炙甘草10 g，分別煎2次，每次加入蒸餾水500 mL，每次煎1 h，合并2次藥汁，過濾后濃縮至1 g/mL作為骨傷三方提取物，保存在-20 ℃冰箱中備用。所有中藥藥物均由廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院中藥房提供，且經(jīng)藥劑科鑒定均為純正藥材。

1.3 主要試驗(yàn)試劑與儀器 主要試劑：牛血清白蛋白（BSA）、D-Hanks液、DMEM培養(yǎng)液（賽默飛世爾科技公司）；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）專用預(yù)混液（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；HiScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）引物（上海生工生物有限公司）；RIPI緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、磷酸鹽緩沖液（PBS）、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、TBSTx （10X）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（碧云天生物技術(shù)有限公司）；一抗、二抗（上海艾博抗貿(mào)易有限公司）、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）（普利萊基因技術(shù)有限公司）等。

主要儀器：實(shí)時熒光定量PCR儀（賽默飛世爾科技公司，型號：ABI7500）；高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，型號：TGL-16GB）；CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司，型號：Midi 40）；小型垂直電泳槽[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，型號：165-8001]、轉(zhuǎn)印槽[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，型號：170-3930]；酶標(biāo)儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，型號：iMark]等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 關(guān)節(jié)退變軟骨獲取、培養(yǎng)、分組和處理 將在手術(shù)中獲取的KOA退變軟骨放置于無菌環(huán)境中，利用生理鹽水反復(fù)沖洗后，在無菌培養(yǎng)皿中除去軟骨周圍結(jié)締組織。用D-Hanks液漂洗培養(yǎng)皿中標(biāo)本，將關(guān)節(jié)軟骨組織剪成l mm3大小的組織塊，應(yīng)用濃度為0.1%的Ⅱ型膠原酶消化組織；置于37 oC搖床震蕩消化培養(yǎng)45 min，吸去上清液，以1500 r/min離心5 min后，移至50 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入4 mL新鮮DMEM培養(yǎng)液，在5% CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱37 ℃下培養(yǎng)24～48 h。待細(xì)胞鋪滿瓶底80%～90%進(jìn)行細(xì)胞傳代。實(shí)驗(yàn)選用2～5代對數(shù)生長期細(xì)胞。將退變軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為對照組和骨傷三方組，各21例，骨傷三方組將骨傷三方提取物400 μL加入軟骨細(xì)胞，對照組將等量的生理鹽水加入軟骨細(xì)胞中，均培養(yǎng)72 h，然后收集兩組細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.4.2 RT-PCR檢測兩組miRNA-140基因表達(dá)情況 采用TRIzol、氯仿、異丙醇等提取軟骨上的RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為性質(zhì)穩(wěn)定的cDNA，然后將RNA樣本加入滅菌水8 μL稀釋并加入3 μL的miR-140-5p基因引物及內(nèi)參U6引物（具體引物序列見表1），然后加入PCR混合液12.5 μL后放入qRT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR儀檢測兩組軟骨細(xì)胞miRNA-140相對表達(dá)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃退化10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸35 s。擴(kuò)增結(jié)束后，參照U6引物，采用2?ΔΔCt法計算miRNA-140基因相對表達(dá)。

1.4.3 蛋白免疫印跡法檢測PI3K、AKT、mTOR的蛋白表達(dá)量 使用含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液從不同組別軟骨細(xì)胞中制備出總蛋白質(zhì)，將裂解物在冰上孵育30 min，然后在4 ℃以12 000 r/min離心15 min取上清液。使用BCA試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。將相同量的蛋白質(zhì)通過10%十二烷基硫酸鈉 - 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含5% BSA的磷酸緩沖液（PBST）封閉1 h，取出膜用PBST將膜洗3次，分別加入不同濃度的一抗（濃度PI3K 1∶1000，AKT 1∶500，mTOR 1∶500），4 ℃孵育過夜，再加入二抗（1∶10 000稀釋），封閉1 h；ECL發(fā)光顯影，定影后進(jìn)行分析結(jié)果。

1.4.4 MTT檢測各組軟骨細(xì)胞增殖能力 將兩組軟骨細(xì)胞分別干預(yù)24、48、72 h，將各時間段的軟骨細(xì)胞分別經(jīng)胰蛋白酶消化，將細(xì)胞懸液制成1×104個/mL并接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每組設(shè)5個復(fù)孔，在5% CO2、37 ℃條件下孵育，分別在24、48及72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄除孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。在酶標(biāo)儀波長為490 nm處測量各孔吸光度值（OD），記錄兩組分別干預(yù)24、48、72 h后的結(jié)果。

1.5 觀察指標(biāo) ⑴比較兩組軟骨細(xì)胞miRNA-140基因表達(dá)情況。⑵比較兩組軟骨細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)結(jié)果。⑶比較兩組軟骨細(xì)胞24、48、72 h的軟骨細(xì)胞活性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料均使用S-W法檢驗(yàn)證實(shí)服從正態(tài)分布，以（ x ±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時間點(diǎn)比較采用配對t檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組軟骨細(xì)胞miRNA-140基因表達(dá)水平比較 干預(yù)后，使用qRT-PCR儀檢分別檢出對照組miRNA-140基因表達(dá)水平為（1.02±0.31），骨傷三方組為（1.40±0.22），骨傷三方組的miRNA-140表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.195，Plt;0.05），見圖1。

2.2 兩組軟骨細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)結(jié)果比較 通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)用蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值的比值表示相對蛋白含量，結(jié)果表明，干預(yù)后，骨傷三方組PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05），見表2、圖2。骨傷三方組PI3K、AKT、mTOR熒光檢查蛋白印跡灰度比明顯低于對照組，見圖3。

2.3 兩組軟骨細(xì)胞活性比較 MTT檢測軟骨細(xì)胞活性，干預(yù)24、48、72 h，兩組軟骨細(xì)胞組織的吸光度值（OD）均逐漸升高，且各時間點(diǎn)骨傷三方組均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05），見表3、圖4。

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎屬于祖國醫(yī)學(xué)“膝痹”，因膝關(guān)節(jié)退行性變引起，祖國傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療此病有著豐富的經(jīng)驗(yàn)?！饵S帝內(nèi)經(jīng)·素問》就對痹癥的病因、病機(jī)進(jìn)行了描述，按部位分為“五體痹”，膝骨關(guān)節(jié)炎屬于“骨痹”范疇。東漢張仲景則在《金匱要略》中提到了“中風(fēng)歷節(jié)病篇”，描述了歷節(jié)病的發(fā)生與肝腎虧虛有關(guān)，并認(rèn)為膝關(guān)節(jié)炎的內(nèi)因?yàn)楦文I虧虛，治療上應(yīng)重視補(bǔ)益肝腎。

骨傷三方以“補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨”為治療原則，方中重用肉蓯蓉溫壯腎陽為君藥；熟地黃滋陰補(bǔ)腎、填精益髓，山萸肉滋補(bǔ)肝腎，菟絲子補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨為臣藥；佐以黃芪、白術(shù)補(bǔ)脾益氣，以資生氣血之源，木瓜舒筋活絡(luò)；炙甘草緩急止痛、調(diào)和諸藥為使藥，諸藥合用，陰陽氣血并補(bǔ)，陽得陰助而生化無窮，陰得陽生而泉源不竭，諸癥自愈[6]。本研究通過分析骨傷三方對于治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，為骨傷三方治療膝骨關(guān)節(jié)炎提供新的理論依據(jù)。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于miRNA深入的研究，miRNA在骨關(guān)節(jié)炎中的異常表達(dá)可以調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。陳俊等[7]通過研究獨(dú)活寄生湯含藥血清對體外培養(yǎng)的大鼠退變軟骨細(xì)胞表達(dá)miRNA-140的影響，發(fā)現(xiàn)獨(dú)活寄生湯治療骨關(guān)節(jié)炎的部分作用機(jī)制是有效促進(jìn)退變軟骨細(xì)胞miRNA-140的表達(dá)。蔡風(fēng)等[8]通過研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的miRNA-140可以抑制其軟骨細(xì)胞凋亡并促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。骨傷三方中的肉蓯蓉為治療肝腎虧虛型骨關(guān)節(jié)炎的常用中藥，張珊珊等[9]通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計中醫(yī)藥治療KOA的用藥規(guī)律，其中肉蓯蓉因子貢獻(xiàn)率2.62%。張明煥等[10]通過研究發(fā)現(xiàn)熟地黃多糖可能參與了miRNA-140的表達(dá)，其可促進(jìn)膝關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖，并可以抑制凋亡，為熟地黃治療KOA提供了理論依據(jù)。山茱萸通過抑制人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）、細(xì)胞結(jié)締組織生長因子（CTGF）mRNA和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制TGF-β1/CTGF信號通路的激活有關(guān)，也有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制凋亡的作用[11]。菟絲子也有改善骨關(guān)節(jié)炎的作用，主要是依靠菟絲子中的活性有效成分芝麻素降低環(huán)氧合酶2的表達(dá)達(dá)到改善骨關(guān)節(jié)炎的癥狀[12]。木瓜也可以通過槲皮素、白樺脂酸、表兒茶酸等活性成分調(diào)控相關(guān)靶點(diǎn)，控制炎癥，調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨代謝、生長和修復(fù)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，抑制細(xì)胞凋亡和抵抗氧化應(yīng)激等以達(dá)到控制KOA發(fā)生發(fā)展的目的[13]。本研究中骨傷三方組的miRNA-140表達(dá)水平高于對照組，這表明骨傷三方中的中藥成分參與了KOA軟骨退變的代謝，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，從而延緩膝關(guān)節(jié)的退變。

作為本研究中的另一觀察指標(biāo)，PI3K/AKT/mTOR蛋白表達(dá)與KOA的進(jìn)展相關(guān)，PI3K為上游靶點(diǎn)，其調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110構(gòu)成二聚體，進(jìn)一步與生長因子受體結(jié)合后，使AKT的蛋白結(jié)構(gòu)改變，活化AKT后，并以磷酸化作用激活或抑制下游一系列底物如凋亡相關(guān)蛋白Bad、Caspase9活性，進(jìn)而可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及遷移等，對PI3K/AKT通路的抑制，可以進(jìn)一步誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬，并可以減輕KOA炎癥反應(yīng)[14]。mTOR是PI3K/Akt下游靶點(diǎn)，mTOR信號通道與KOA的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。王夢婷等[15]通過研究發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR信號通路可增強(qiáng)細(xì)胞自噬，減少細(xì)胞死亡、抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等來減緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程，在軟骨退化過程中可以起到軟骨保護(hù)作用，使得骨關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀得到顯著改善。本研究中，與對照組對比，骨傷三方組PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)均降低，這表明骨傷三方可以抑制PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)，抑制軟骨退變，改善KOA癥狀。MTT檢測也已廣泛用于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性檢測，本研究中，培養(yǎng)24～72 h兩組軟骨細(xì)胞OD值均逐漸升高，且各時間點(diǎn)骨傷三方組均高于對照組，且骨傷三方組隨著用藥的時長增加，OD值增加更顯著，這進(jìn)一步表明骨傷三方可以調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖及分化，進(jìn)一步減少細(xì)胞死亡，同時抑制炎癥等進(jìn)程來緩解KOA的病情。

綜上，骨傷三方可增加miRNA-140表達(dá)量，降低PI3K/AKT/mTOR通道相關(guān)蛋白表達(dá)量降低，增加軟骨細(xì)胞活性，以抑制關(guān)節(jié)軟骨退變，延緩KOA的發(fā)展。然而本研究未進(jìn)一步觀察軟骨組織的形態(tài)學(xué)變化，選取的指標(biāo)有限，未來可進(jìn)一步增加評價指標(biāo)，為骨傷三方中藥治療KOA提供更多的理論基礎(chǔ)和思路。

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