?3種殺菌劑及1種生防菌對(duì)柑橘黃龍病的防治效果

摘要：柑橘黃龍病是柑橘產(chǎn)業(yè)中最具毀滅性的病害，通過(guò)田間小區(qū)試驗(yàn)，評(píng)估了葉面噴施和灌根施用聚六亞甲基胍鹽酸（PHMG）、2，2-二溴-3-次氮基丙酰胺（DBNPA）、0.2%抑菌性可溶性多糖（NK）和枯草芽孢桿菌M23菌株對(duì)柑橘黃龍病的防治效果。結(jié)果表明：在黃龍病初侵染時(shí)，使用PHMG或DBNPA進(jìn)行葉面噴施處理可有效抑制其病情的發(fā)展；在黃龍病侵染后期，使用DBNPA、NK或M23灌根處理可有效降低感病植株的病情級(jí)別，并減少柑橘葉片內(nèi)亞洲韌皮部桿菌（CLas）的濃度。研究結(jié)果為柑橘黃龍病的田間防控提供了可供選擇的新藥劑。

關(guān)鍵詞：柑橘黃龍病；防治效果；化學(xué)防控；生防菌

中圖分類號(hào)：S482.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2024）11-0055-05

Control Effect of Three Fungicides and One Biocontrol Bacteria on Citrus Huanglongbing

HAN Shi-qi1，SUN Zi-xiang1，LI Jing1，TANG Tao2，ZHAO Ming-ping3，QIU Fa-jin3，YI Tu-yong1

（1. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests， Changsha 410128， PRC; 2. Hunan Institute of Plant Protection， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC; 3. Jianghua County Agriculture and Rural Bureau， Yongzhou 425500， PRC）

Abstract： Citrus Huanglongbing is the most devastating disease in the citrus industry. In this study， a field plot experiment was conducted to evaluate the control effects of leaf spraying and root irrigation with polyhexamethylene guanidine （PHMG）， 2，2-dibromo-3-nitrilopropionamide （DBNPA）， 0.2% bacteriostatic soluble polysaccharide （NK）， and Bacillus subtilis M23 on citrus Huanglongbing. The results show that leaf spraying with PHMG or DBNPA can effectively inhibit the development of the disease during the early stage of Huanglongbing. At the later stage of Huanglongbing， root irrigation treatments with DBNPA， NK， or M23 are effective in reducing the disease level of susceptible plants and the concentration of Candidatus Liberibacter asiaticus （CLas） in citrus leaves. The results provide a new drug for field control of citrus Huanglongbing.

Key words： citrus Huanglongbing; control effect; chemical prevention and control; biocontrol bacteria

柑橘黃龍?。℉uanglongbing，HLB）是一種嚴(yán)重危害柑橘產(chǎn)業(yè)的病害，被稱為柑橘“癌癥”。其病原菌為革蘭氏陰性細(xì)菌[1]，分為3個(gè)亞種，即亞洲種（Candidatus Liberibacter asiaticus，CLas）、美洲種（Candidatus Liberibacter americanus，CLam）和非洲種（Candidatus Liberibacter africanus，CLaf）[2-4]，

中國(guó)境內(nèi)發(fā)生的柑橘黃龍病病原菌屬亞洲種。目前，仍無(wú)有效根治黃龍病的方法，在生產(chǎn)上常使用“種植無(wú)毒苗木、防控柑橘木虱和清除病樹(shù)”的“三板斧”防治手段來(lái)控制黃龍病的危害。筆者通過(guò)評(píng)估3種殺菌劑及1種生防菌在葉面噴施和灌根2種不同施藥方式下對(duì)柑橘黃龍病的田間防治效果，觀察其病情級(jí)別的變化，并通過(guò)熒光定量PCR的方法檢測(cè)其葉片內(nèi)菌濃度的變化，旨在為柑橘黃龍病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2023年9月到2024年3月在湖南省永州市江華縣白芒營(yíng)鎮(zhèn)柑橘園進(jìn)行。供試品種為愛(ài)媛38號(hào)（果凍橙），樹(shù)齡5 a。

供試藥劑有25%液體聚六亞甲基胍鹽酸（PHMG–25）（廣州云麗生物科技有限公司）和2，2–二溴–3–次氮基丙酰胺（DBNPA）（山東優(yōu)索化工科技有限公司），以上藥劑均市場(chǎng)購(gòu)買；0.2%抑菌性可溶性多糖（NK）（南開(kāi)大學(xué)徐鳳波研究員提供），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）M23（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院園藝作物病害研究室分離獲得，施用前活化）。

供試儀器主要有常規(guī)PCR儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳儀、離心機(jī)等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)常規(guī)PCR檢測(cè)確定其陽(yáng)性植株，對(duì)其進(jìn)行掛牌標(biāo)記，以供后續(xù)施藥試驗(yàn)、樣品采集和外觀分級(jí)調(diào)查。植株編號(hào)及施用藥劑等信息見(jiàn)表1。

葉面噴施第1～4次施藥時(shí)間為9月11日、10月2日、10月23日、11月13日。每次施藥前進(jìn)行上一次施藥后的取樣工作，最后一次葉面噴施取樣時(shí)間為12月4日。灌根第1～4次施藥時(shí)間為10月23日、11月13日、12月4日、12月25日。每次施藥前進(jìn)行上一次施藥后的取樣工作，最后一次灌根取樣時(shí)間為翌年3月19日。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃龍病檢測(cè) 將采集的葉片取中脈，剪碎研磨，取適量樣本使用CTAB法提取DNA。使用常規(guī)PCR方法檢測(cè)黃龍病。HLB檢測(cè)引物使用黃霖霄等[5]改良的OI1/OI2c–gj特異性引物，OI1：5'–GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA–3'；OI2c–gj：5'–TCGCGACTTCGCAACCCAT–3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 167 bp。反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性5 min，（95℃，45 s；55℃，30 s；72℃，60 s）35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶，確定陽(yáng)性樣本。

1.3.2 病情級(jí)別調(diào)查 柑橘黃龍病病情分級(jí)調(diào)查的標(biāo)準(zhǔn)參考袁亦文等[6]的方法，病情級(jí)別共分為6級(jí)，0級(jí)：全樹(shù)無(wú)?。?級(jí)：1～2個(gè)梢有斑駁黃化葉片出現(xiàn)；2級(jí)：部分側(cè)枝或主枝有斑駁黃化癥狀，癥狀枝占全樹(shù)的1/3以下；3級(jí)：癥狀側(cè)枝或主枝占全樹(shù)的1/3以上和2/3以下；4級(jí)：癥狀枝在2/3以上；5級(jí)：全樹(shù)死亡。在每次施藥前及最后一次取樣前，對(duì)植株黃龍病病情級(jí)別調(diào)查結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.3 黃龍病菌表達(dá)量變化分析 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法進(jìn)行CLas相對(duì)表達(dá)量變化分析，使用的特異性引物為HLBas（5'–TCGAGCGCGTATGCAATACG–3'）/HLBr（5'–GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG–3'）[7]，使用的柑橘內(nèi)參基因引物為CsCOX–F（5'–GTATGCCACGTCGCATTCCAGA–3'）/CsCOX–R（5'–GCCAAAACTGCTAAGGGCATTC–3'）[8]，每個(gè)DNA樣品進(jìn)行3次重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃延伸10 s，60℃退火30 s，延伸和退火40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將生成標(biāo)準(zhǔn)曲線圖、擴(kuò)增曲線圖、濃度和樣品Ct值。

使用2-△△Ct法計(jì)算CLas相對(duì)表達(dá)量的變化程度，使用樣本的CLas產(chǎn)物Cq值–樣本的內(nèi)參基因產(chǎn)物Cq值得到樣本的△Ct值，再使用施藥后樣本的△Ct值–未施藥樣本的△Ct值得到△△Ct值，通過(guò)公式2-△△Ct計(jì)算得到CLas相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果大于1說(shuō)明樣本內(nèi)CLas表達(dá)量上調(diào)，結(jié)果小于1則說(shuō)明樣本內(nèi)CLas表達(dá)量下調(diào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理柑橘黃龍病病情級(jí)別變化

葉面噴施處理組病情級(jí)別調(diào)查結(jié)果見(jiàn)表2，該處理組中存在4株初始病情級(jí)別為1的患病植株（2號(hào)、8號(hào)、9號(hào)和12號(hào)植株），其中2號(hào)、8號(hào)和9號(hào)植株在每次施藥后并無(wú)病情加重的趨勢(shì)，而陽(yáng)性對(duì)照（CK+）12號(hào)植株病情級(jí)別隨時(shí)間變化加重。在初始病情級(jí)別為4的各處理中除3號(hào)和7號(hào)植株病情級(jí)別略有下降，其余均無(wú)明顯變化。結(jié)果表明葉面噴施PHMG或DBNPA在HLB初始病情級(jí)別較低時(shí)對(duì)其有一定的抑制效果，可在短期內(nèi)減緩病情的發(fā)展，但在HLB初始病情級(jí)別較高時(shí)，葉面噴施PHMG、DBNPA或NK均無(wú)法有效抑制黃龍病的發(fā)展。

灌根處理組病情級(jí)別調(diào)查結(jié)果見(jiàn)表3，灌根處理組中所有植株的初始病情級(jí)別均為4級(jí)，經(jīng)過(guò)4次施藥處理后，DBNPA處理的病情級(jí)別降低較為明顯，分別降至1級(jí)和2級(jí)；NK處理的效果稍差，病情級(jí)別分別降至2級(jí)和3級(jí)；M23處理中2株降低至2級(jí)，2株降低至3級(jí)；陽(yáng)性對(duì)照中均無(wú)病情級(jí)別的降低。

綜合上述結(jié)果表明，灌根處理的效果要優(yōu)于葉面噴施處理，特別是2，2–二溴–3–次氮基丙酰胺（DBNPA）和0.2%抑菌性可溶性多糖（NK）通過(guò)灌根處理表現(xiàn)出更好的效果，枯草芽孢桿菌（M23）在不同重癥植株中均發(fā)揮效果，有效降低了植株的病情級(jí)別，但其效果不穩(wěn)定，可能由于其受土壤環(huán)境影響較大。

2.2 不同處理植株CLas相對(duì)表達(dá)量變化

葉面噴施處理組的CLas相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表4，所有處理在4次施藥后的CLas相對(duì)表達(dá)量均有不同程度的提升，說(shuō)明葉面噴施各處理均不能完全抑制黃龍病菌的增殖擴(kuò)散。結(jié)合病情級(jí)別調(diào)查結(jié)果，初始病情級(jí)別為1級(jí)的陽(yáng)性對(duì)照12號(hào)植株CLas相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)逐步大幅度上升，第4次施藥后較施藥前的CLas基因表達(dá)量提升至45.53倍，與病情級(jí)別提升的變化一致。而初始病情級(jí)別同為1級(jí)的2號(hào)、8號(hào)和9號(hào)植株在4次施藥后的CLas相對(duì)表達(dá)量分別為1.64、3.69和4.09，顯著低于陽(yáng)性對(duì)照12號(hào)植株的CLas相對(duì)表達(dá)量，說(shuō)明以上3個(gè)處理均有效抑制了CLas在初侵染植株中的增殖擴(kuò)散，但不能使其濃度降低。綜合上述，葉面噴施的5種處理雖不能降低病株帶菌量，但對(duì)處于初侵染階段的柑橘苗木使用PHMG或DBNPA進(jìn)行葉面噴施處理可有效抑制CLas的增殖擴(kuò)散，使其在葉片中的濃度增長(zhǎng)緩慢，其中PHMG的效果要優(yōu)于DBNPA。

灌根處理組的CLas相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表5，在4次施藥后NK處理、DBNPA處理以及M23處理的19、20號(hào)植株CLas相對(duì)表達(dá)量均有不同程度的下調(diào)，其中M23處理的19號(hào)植株CLas相對(duì)表達(dá)量在第4次施藥后有一定程度的回升，說(shuō)明以上3種處理的6棵植株在施藥后CLas濃度降低。其中枯草芽孢桿菌M23處理的21、22號(hào)植株在4次施藥后的CLas相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，與該處理的19、20號(hào)植株結(jié)果不同，說(shuō)明該菌可能受土壤環(huán)境影響較大。結(jié)合灌根處理組的病情級(jí)別調(diào)查結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，在4次施藥后DBNPA處理的CLas相對(duì)表達(dá)量和病情級(jí)別均下降最多，說(shuō)明該處理的灌根治療效果最優(yōu)，NK處理次之，M23處理對(duì)HLB的治療效果受環(huán)境影響較大。

綜合上述，對(duì)于HLB初侵染的植株，使用PHMG或DBNPA進(jìn)行葉面噴施可在一定程度上減緩HLB的發(fā)展，但不能降低植株中CLas的濃度；對(duì)于HLB侵染后期的植株，葉面噴施處理無(wú)法有效緩解HLB病情，使用NK、DBNPA或M23灌根處理可有效緩解HLB病情，且可降低植株中CLas的濃度，其中M23的效果受環(huán)境影響較大。

3 討論與結(jié)論

感染黃龍病的柑橘植株會(huì)逐年減產(chǎn)，果實(shí)品質(zhì)下降，直至植株死亡，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益[9]。該病可由柑橘木虱傳播[10]，在柑橘抽梢期柑橘木虱活動(dòng)旺盛，此期間如果防控柑橘木虱不及時(shí)，則很可能大范圍感染黃龍病[11-12]。目前沒(méi)有可以根治黃龍病的方法，且由于其致病菌在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)尚無(wú)建立純培養(yǎng)的成熟體系，因此該病的防治藥劑篩選工作進(jìn)展緩慢。研究通過(guò)在田間使用葉面噴施和灌根2種施藥方式，評(píng)估了3種殺菌劑和1種生防菌對(duì)柑橘黃龍病陽(yáng)性植株的防治效果，篩選出可以有效降低黃龍病陽(yáng)性植株內(nèi)CLas濃度的藥劑（DBNPA和NK）及生防菌（M23），并明確了灌根處理對(duì)于柑橘黃龍病的治療效果更優(yōu)。

柑橘植株感染黃龍病后，一方面，韌皮部發(fā)生堵塞導(dǎo)致光合產(chǎn)物難以運(yùn)輸，造成淀粉和可溶性糖在葉片中積累[13]，其田間癥狀與缺鐵、缺鋅等缺素癥狀極其相似[14]，難以在田間做出準(zhǔn)確診斷；另一方面，該病原主要寄生在韌皮部細(xì)胞內(nèi)，可通過(guò)維管束到達(dá)根部，在根中定殖并引發(fā)根部腐敗[15]。目前，黃龍病常用的診斷方法為常規(guī)PCR檢測(cè)[16]。Zhang等[17]認(rèn)為土壤農(nóng)殘含量高、pH酸化或堿化、鹽漬化、有機(jī)質(zhì)含量低等原因是導(dǎo)致柑橘黃龍病加重的原因，提出了基于土壤修復(fù)改良為主的黃龍病綜合防治技術(shù)，并通過(guò)實(shí)踐證明了土壤修復(fù)改良對(duì)感染黃龍病的柑橘植株可以較為明顯地提高產(chǎn)量并改良了品質(zhì)。這側(cè)面說(shuō)明了柑橘黃龍病植株通過(guò)根部治愈的可能性，由于葉片中有較多淀粉與胼胝質(zhì)的積累，藥劑難以從葉片吸收并傳導(dǎo)到根部，而從根部直接施藥則更容易被植株吸收，與研究中灌根處理較葉面噴施處理效果更好的結(jié)果一致。Ma等[18]提出黃龍病是一種免疫介導(dǎo)疾病，黃龍病菌觸發(fā)的活性氧產(chǎn)生位于富含韌皮部的樹(shù)皮組織中，隨后伴隨細(xì)胞和篩細(xì)胞的全身細(xì)胞死亡，這也是黃龍病導(dǎo)致柑橘死亡的主要原因。研究中通過(guò)添加赤霉素可上調(diào)編碼過(guò)氧化氫的清除酶基因和下調(diào)NADPH氧化酶。最為重要的是，用赤霉素或抗氧化劑（尿酸、蘆?。﹪姙⑹茳S龍病影響的柑橘葉片可降低韌皮部組織中的過(guò)氧化氫濃度和細(xì)胞死亡，并減輕黃龍病癥狀。

研究結(jié)果表明，使用0.2%抑菌性可溶性多糖（NK）或2，2–二溴–3–次氮基丙酰胺（DBNPA）對(duì)黃龍病樹(shù)灌根處理可降低其葉片內(nèi)CLas相對(duì)表達(dá)量，并降低其病情級(jí)別。使用枯草芽孢桿菌M23菌株活化后的菌液對(duì)柑橘黃龍病樹(shù)灌根處理亦存在一定的治療效果，但其效果或受環(huán)境影響較大。使用25%液體聚六亞甲基胍鹽酸（PHMG–25）或DBNPA進(jìn)行葉面噴施，能在一定程度上減緩病情級(jí)別較低的黃龍病樹(shù)的病情發(fā)展，并延緩CLas的增值速度。研究結(jié)果為柑橘黃龍病防治藥劑的篩選提供了參考，但仍需擴(kuò)大試驗(yàn)范圍，并探究其抑制CLas的原理，從而實(shí)現(xiàn)其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯：肖彥資）