油茶皂苷和噻菌靈混配抑制稻黑孢菌的效果

摘要：稻黑孢菌可侵染玉米、水稻、小麥、高粱、棉花、生姜、菩提榕樹(shù)等多種植物。目前，有關(guān)稻黑孢菌危害及防治的報(bào)道較少，且用常規(guī)藥劑防治該菌的效果不理想。采用菌絲生長(zhǎng)速率法、十字交叉法以及Wadley法，在分別測(cè)定油茶皂苷和噻菌靈對(duì)稻黑孢菌的生物活性影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究2種藥劑混配后的抗菌活性，為篩選防治稻黑孢菌的高效環(huán)保新藥劑提供依據(jù)。結(jié)果顯示，當(dāng)油茶皂苷的濃度為10.50 μg/L，噻菌靈濃度為1.30 μg/L時(shí)，抑菌率均達(dá)到80%以上，噻菌靈對(duì)稻黑孢菌的抑菌效果更明顯。毒力回歸方程測(cè)定結(jié)果顯示，油茶皂苷的EC50為630 μg/L，噻菌靈的EC50為0.87 μg/L，2種藥劑對(duì)稻黑孢菌均有良好的防治效果。采用Wadley法篩選藥劑混配增效配方，得到油茶皂苷和噻菌靈（3 ∶[KG-*3]7）的毒力比（TR）為2.84和共毒系數(shù)（CTC）為140，表明兩者混配后有協(xié)同增效作用。研究結(jié)果可為防治稻黑孢菌提供新的藥劑配方。

關(guān)鍵詞：稻黑孢菌；油茶皂苷；噻菌靈；混配

中圖分類(lèi)號(hào)：S432.4+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）11-0122-06

稻黑孢菌（Nigrospora oryzae）是一種在全球范圍內(nèi)廣泛分布的病原真菌，可侵染玉米、水稻、小麥、高粱、棉花、生姜、菩提榕樹(shù)等多種植物［1］。在我國(guó)主要分布在黑龍江省、江蘇省、四川省、湖南省、廣東省等主要稻區(qū)［2］，會(huì)引發(fā)水稻穗腐病、水稻鞘枯病、木芙蓉黑斑病、鴨跖草葉斑病、水稻穗枝腐病、生姜葉斑病等病害［3-8］。針對(duì)該菌的防治報(bào)道目前相對(duì)較少，李戌清等報(bào)道，75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、325 g/L苯甲·嘧菌酯懸浮劑、250 g/L嘧菌酯懸浮劑對(duì)該菌的平板抑制效果較好［9］。馮愛(ài)卿等檢測(cè)了10種殺菌劑對(duì)該菌的抑制效果，結(jié)果顯示，苯醚甲環(huán)唑、咯菌腈、咪鮮胺錳鹽以及苯甲·丙環(huán)唑等藥劑可作為防治稻黑孢菌的候選藥劑［10］。在生物防治方面，Sempere等證明，草酸青霉能抑制稻黑孢霉生長(zhǎng)，但大田還沒(méi)有試驗(yàn)驗(yàn)證及推廣應(yīng)用［11］。因此，盡快開(kāi)發(fā)對(duì)稻黑孢菌有防治效果的新藥劑顯得十分必要和迫切。

油茶皂苷是一種性能優(yōu)良的天然表面活性劑，有抗氧化等多種生物活性［12］。針對(duì)這些活性，目前研發(fā)了基于油茶皂苷的洗滌劑、殺蟲(chóng)劑、各類(lèi)工業(yè)乳化劑、啤酒發(fā)泡劑和食品工業(yè)乳化劑等［13］。近年來(lái)，利用油茶皂苷防治植物致死型病原真菌的研究被廣泛關(guān)注，黃繼光等測(cè)試12種植物病原菌后發(fā)現(xiàn)，油茶皂苷對(duì)稻瘟病、柑橘青霉病、番茄小核病、荔枝霜疫霉、玉米小斑病的5種病原菌菌絲生長(zhǎng)有顯著抑制作用［14］。此外，油茶皂苷可與化學(xué)農(nóng)藥混配，提高其殺蟲(chóng)活性，降低田間施用量，如與代森錳鋅混配作用于辣椒炭疽病能提高其防效［15］。油茶皂苷也可提高勝紅薊素、殺蟲(chóng)單、滅多威、三氟氯氰菊酯、尼索朗、噠螨靈、魚(yú)藤酮、樂(lè)果、B.t.、苯霜靈、速克靈等農(nóng)藥的防治效果［16］。董道青等測(cè)定了油茶皂苷對(duì)植物源農(nóng)藥雷公藤乳油防治茶尺蠖幼蟲(chóng)的增效作用，發(fā)現(xiàn)雷公藤乳油加入2 g/L油茶皂苷后對(duì)茶尺蠖2齡幼蟲(chóng)可增效5.68～11.10倍，達(dá)到相同的使用效果可減少雷公藤用量85%以上［17］。由此可見(jiàn)，充分利用油茶皂苷的抗蟲(chóng)抗菌和農(nóng)藥增效活性，開(kāi)發(fā)綠色環(huán)?？咕鷦┗?qū)嵭新?lián)合用藥對(duì)化學(xué)農(nóng)藥減量和綠色除菌具有重大意義。

噻菌靈（probenazole）屬苯并咪唑類(lèi)殺菌劑，又名特克多，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中用于防治由子囊菌、半知菌和擔(dān)子菌等引發(fā)的農(nóng)作物、果樹(shù)及經(jīng)濟(jì)作物上的多種病害，尤其能夠防治麥類(lèi)黑穗病、赤霉病、水稻稻瘟病、紋枯病等真菌性病害［18］。本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法、十字交叉法以及Wadley法，分別測(cè)定油茶皂苷和噻菌靈2種藥劑及其混配對(duì)稻黑孢菌的抑菌活性。試驗(yàn)結(jié)果旨在為油茶皂苷和噻菌靈混配制備農(nóng)藥用于大面積防治稻黑孢菌導(dǎo)致的病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稻黑孢菌采自湖南科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)田病害稻葉，經(jīng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）固體培養(yǎng)基常規(guī)分離、純化、鑒定后，斜面保存于4 ℃?zhèn)溆?。油茶皂苷?gòu)自湖南漢清生物技術(shù)有限公司，噻菌靈購(gòu)自臺(tái)灣雋農(nóng)實(shí)業(yè)股份有限公司，PDA培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

試驗(yàn)地點(diǎn)為湖南科技學(xué)院湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室，試驗(yàn)時(shí)間為2022年7月至2023年5月。

1.2.1 稻黑孢菌的活化 將斜面固體保存的菌接種于PDA平板中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，菌落生長(zhǎng)至充滿(mǎn)培養(yǎng)皿的2/3即可。

1.2.2 油茶皂苷和噻菌靈抑菌活性測(cè)定

1.2.2.1 油茶皂苷濃度梯度培養(yǎng)基的配制 將油茶皂苷母液加水稀釋制成105.00、94.50、84.00、73.50、63.00、52.50、42.00 μg/L濃度，向培養(yǎng)皿中加入1 mL稀釋液和9 mL PDA培養(yǎng)基混勻，分別制成10.50、9.45、8.40、7.35、6.30、5.25、4.20 μg/L濃度的油茶皂苷PDA平板，空白組加1 mL無(wú)菌水和9 mL培養(yǎng)基，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，共24個(gè)平板。

1.2.2.2 噻菌靈濃度梯度培養(yǎng)基的配制 將噻菌靈母液加水稀釋制成13.00、11.00、9.00、7.00、500 μg/L濃度，向培養(yǎng)皿中加入1 mL稀釋液和 9 mL PDA培養(yǎng)基混勻，分別制成含1.30、1.10、090、0.70、0.50 μg/L濃度的油茶皂苷PDA平板，空白組加1 mL無(wú)菌水和9 mL培養(yǎng)基，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，共18個(gè)平板。

1.2.2.3 抑菌活性測(cè)定 將5 mm打孔器打孔活化的稻黑孢菌菌餅接種到含藥PDA平板中央，將帶藥及空白平板培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)。每24 h觀察1次，直至空白對(duì)照菌落直徑達(dá)到培養(yǎng)皿的 2/3 時(shí)，每個(gè)菌落用十字交叉法測(cè)量菌落直徑各1次，取其平均值。根據(jù)測(cè)得的結(jié)果計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。再由濃度、抑制率繪制毒力回歸方程，計(jì)算有效中濃度（EC50）。

菌落直徑=測(cè)量的菌落直徑-0.5 cm。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.2.3 混合藥劑增效配方的篩選 采用Wadley法［19］進(jìn)行篩選。按油茶皂苷和噻菌靈的EC50以 0 ∶10、1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3、8 ∶2、9 ∶1、10 ∶0進(jìn)行混藥配比，不加藥劑為空白對(duì)照，接種后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)。每24 h觀察1次，直至空白對(duì)照菌落直徑達(dá)到培養(yǎng)皿的2/3時(shí)，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑各1次，取其平均值，并計(jì)算抑菌率。

由混合配比的預(yù)測(cè)值和實(shí)際值，計(jì)算毒力比（TR）［20］：TR=EC50理論值/EC50實(shí)際值×100%。

當(dāng)TRgt;1時(shí)兩者的相互作用是協(xié)同的，當(dāng) TRlt;1 時(shí)為拮抗作用，當(dāng)TR=1時(shí)相互作用是可加的。TR顯著值決定最佳配比，以此配比進(jìn)行稀釋?zhuān)苽?2個(gè)PDA平板，培養(yǎng)菌餅，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，測(cè)量菌落直徑各1次，取其平均值。計(jì)算毒力回歸方程、混劑回歸方程y=ax+b和r值，求EC50（A+B），最后再求出共毒系數(shù)（CTC）［20］。

CTC=［（EC50A/EC50（A+B）］/［（EC50A/EC50A）×Pa+（EC50A/EC50B）×Pb］×100%。

式中：A、B分別表示油茶皂苷與噻菌靈2種藥劑組分；a、b是油茶皂苷與噻菌靈 2 種組分在混劑中的含量比值；Pa、Pb分別代表A、B在混劑中的占比。當(dāng)CTCgt;100時(shí)，兩者具有協(xié)同作用；CTClt;100時(shí)為拮抗作用；當(dāng)CTC約為100時(shí)，相互作用是相加的［21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 單劑抑菌活性測(cè)定

采用菌落生長(zhǎng)速率法，測(cè)定2種殺菌劑對(duì)稻黑孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率。從表1可以看出，油茶皂苷和噻菌靈對(duì)稻黑孢菌均有抑制效果，而且抑制效果明顯，兩者均呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性。其中，噻菌靈對(duì)稻黑孢菌的抑菌效果更明顯。油茶皂苷抑制效果每增加10％，濃度增幅超過(guò)1.0 μg/L；噻菌靈抑制效果每增加10％，濃度增幅遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于油茶皂苷，也從側(cè)面說(shuō)明了噻菌靈抑菌效果比油茶皂苷好。

稻黑孢菌菌絲生長(zhǎng)狀況也反映了油茶皂苷和噻菌靈的抑制效果（圖1），對(duì)照組（F和L）的菌絲飽滿(mǎn)晶瑩，內(nèi)部結(jié)構(gòu)充盈且連續(xù)，整體表現(xiàn)為健康的生長(zhǎng)狀態(tài)，而經(jīng)過(guò)2種殺菌劑處理過(guò)后其他組（A～E、G～K）的菌絲發(fā)生了明顯變化，菌絲出現(xiàn)嚴(yán)重褶皺、干癟，且菌絲內(nèi)部出現(xiàn)明顯的斷層現(xiàn)象。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是油茶皂苷對(duì)菌絲細(xì)胞膜的完整性造成了嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，類(lèi)似于丁香酚對(duì)婁地青霉和黑曲霉的損傷作用［22］，而噻菌靈的作用機(jī)制為抑制真菌有絲分裂過(guò)程中微管蛋白的形成。這兩者對(duì)稻黑孢菌的具體殺傷機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

2.2 單劑對(duì)稻黑孢菌的毒力測(cè)定

由表2可知，油茶皂苷的EC50為6.30 μg/L，噻菌靈的EC50為0.87 μg/L，對(duì)稻黑孢菌的EC50均小于[KG*3]0.10 mg/L， 毒力效果較理想。 而且兩者EC50都在95％置信限內(nèi)，2個(gè)卡方值均顯著大于0.150，在置信限度中未有任何異質(zhì)性因子，說(shuō)明數(shù)值可靠。就毒力大小而言，EC50值越小，其毒力越大，故油茶皂苷的毒力小于噻菌靈，后者的毒力是前者的7倍左右。可見(jiàn)，噻菌靈防治稻黑孢菌的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于油茶皂苷。

2.3 混合藥劑增效配方的篩選

根據(jù)表2結(jié)果，以油茶皂苷和噻菌靈的EC50為基礎(chǔ)，進(jìn)行0 ∶10、1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3、8 ∶2、9 ∶1、10 ∶0的不同體積配比，每個(gè)配比重復(fù)3次，再按相對(duì)應(yīng)的濃度梯度順序?qū)?種單劑混合，菌落生長(zhǎng)速率法測(cè)定抑菌效果。

由表3的標(biāo)準(zhǔn)差可知，油茶皂苷單劑、噻菌靈單劑以及混劑的標(biāo)準(zhǔn)差大部分小于0.1，說(shuō)明試驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定性好，數(shù)據(jù)結(jié)果可靠。根據(jù)表4的抗真菌指數(shù)來(lái)看，除3 ∶7、10 ∶0、0 ∶10比例外，其余配比預(yù)測(cè)值均高于觀測(cè)值，均有不同程度的拮抗作用，毒性比率均lt;1（除3 ∶7比例外）。3 ∶7 比例混合的實(shí)際抑制率為8807％，毒性比率為2.84。因此，藥劑混配的最佳配比為EC50劑量油茶皂苷 ∶噻菌靈=3 ∶7，其毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)、CTC如表5所示。

3 討論

油茶皂苷是美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局（US EPA）認(rèn)可的具有殺蟲(chóng)/殺菌活性的生物農(nóng)藥［23］， 其中含有目前已經(jīng)鑒定過(guò)的皂苷成分超過(guò)70種［24］。噻菌靈目前主要用來(lái)防治稻瘟?。?5］，也可用于水果和蔬菜的防腐保鮮［26］。對(duì)油茶總皂苷抑菌活性的初步研究發(fā)現(xiàn)，油茶總皂苷對(duì)小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis van der Hoven）和棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）的抑菌活性最高，EC50分別為0.081、0.169 μg/L［27］。侯昌亮等采用菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)定了11種殺菌劑對(duì)小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噻菌靈對(duì)病菌有抑制作用，EC50為0.411 0 mg/L［28］。以上研究結(jié)果說(shuō)明，油茶皂苷單劑和噻菌靈單劑都有[CM（21]較好的抑菌活性。本研究采用菌落生長(zhǎng)速率法、十字交叉法測(cè)定油茶皂苷和噻菌靈的抑菌活性。油茶皂苷、噻菌靈對(duì)稻黑孢菌的抑制效果隨著濃度的增大而增強(qiáng)，當(dāng)油茶皂苷的濃度為10.50 μg/L，噻菌靈濃度為1.30 μg/L 時(shí)，真菌在帶藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，抑菌率均達(dá)到80%以上。本試驗(yàn)結(jié)果表明，這2種單劑對(duì)稻黑孢菌均有顯著的抑菌活性，而且噻菌靈的抑菌活性更好。油茶皂苷對(duì)菌絲生長(zhǎng)EC50抑制值為 6.30 μg/L，噻菌靈EC50為0.87 μg/L，其效果和商品化藥劑75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑、250 g/L嘧菌酯懸浮劑的殺菌效果［9］相當(dāng)，顯示出了極好的應(yīng)用潛力。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于油茶皂苷和噻菌靈混配對(duì)病菌防治效果的研究報(bào)道較少，因此對(duì)油茶皂苷和噻菌靈混配的抑菌具體濃度和使用價(jià)值還需要進(jìn)一步的深入研究。前人研究顯示，油茶皂苷與其他藥劑混配對(duì)病菌具有增效抑制作用。例如，郝衛(wèi)寧等研究了茶皂素與甲霜靈混配對(duì)黃瓜疫病菌的增效作用，發(fā)現(xiàn)茶皂素與甲霜靈有效成分質(zhì)量比為4 ∶6和3 ∶7時(shí)對(duì)病菌菌絲具有較強(qiáng)的抑制作用，增效比（SR）分別為2.53和1.76，為顯著增效作用［29］。

本研究采用Wadley法對(duì)有增效作用的配比進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示，油茶皂苷與噻菌靈混配對(duì)稻黑孢菌具有增效抑制作用，能顯著提高另一種農(nóng)藥的抗真菌活性，這些結(jié)果可為防治稻黑孢菌病害提供新的藥劑配方。油茶皂苷單獨(dú)作用于微生物的殺菌機(jī)制已經(jīng)有一些報(bào)道，如其可通過(guò)抑制生物膜的形成而抑制無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）的生長(zhǎng)［30］，但對(duì)于油茶皂苷以及噻菌靈的作用方式、作用機(jī)制均有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，油茶皂苷和噻菌靈單劑對(duì)稻黑孢菌有較為顯著的抑制效果，與目前已經(jīng)上市的一些商品化農(nóng)藥的效果相當(dāng)，因此這兩者均具有防治稻黑孢菌引起的植物病害的潛力。其中，噻菌靈因已有較為成熟系統(tǒng)的使用經(jīng)驗(yàn)，且其抑制效果比油茶皂苷更好，具有更快更好的應(yīng)用前景。而油茶皂苷作為一種植物提取物，則在環(huán)境友好性方面更具有優(yōu)勢(shì)。如將兩者混配，在某種程度上可以兼顧兩者的優(yōu)勢(shì)。故此，本研究采用科學(xué)方法篩選出了油茶皂苷和噻菌靈有增效作用的配比，既提高了殺菌效果，又提升了環(huán)境友好性，為稻黑孢菌的防控提供了新的藥劑配方。當(dāng)然，后續(xù)還需進(jìn)一步研究這2種單劑或混配在具體田間的病害防控效果、劑型選擇、使用方法、防控措施等，對(duì)其作用方式和作用機(jī)制也需深入研究。

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