全基因組關(guān)聯(lián)分析在果樹品質(zhì)及抗性性狀中的研究進展

摘要：全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association analysis，GWAS）是一種基于連鎖不平衡理論的成本低、精度高的基因分型方法，用于影響復(fù)雜性狀的基因或基因組區(qū)域定位。隨著果樹各樹種基因組的陸續(xù)公布，近年來GWAS在果樹研究中得到廣泛應(yīng)用。本文介紹了GWAS的基本原理和影響因素，綜述了GWAS在仁果類、核果類、柑橘類、漿果類和其他經(jīng)濟類果樹中的研究進展，關(guān)聯(lián)性狀主要集中在果實品質(zhì)性狀評估（風(fēng)味、香氣、質(zhì)地、果實外觀、色澤、單果重等）和抗性基因鑒定（蘋果褐斑病、李痘病毒、褐腐病、草莓枯萎病、葡萄裂果等）等方面，梳理了利用結(jié)構(gòu)變異、轉(zhuǎn)座子開展關(guān)聯(lián)分析的研究報道，基于GWAS+TWAS等衍生應(yīng)用在作物中的研究進展分析了對果樹相關(guān)研究的借鑒和參考意義，最后歸納了果樹GWAS研究的不足，并提出未來研究方向和建議。

關(guān)鍵詞：全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）；果樹；品質(zhì)性狀；抗性性狀

中圖分類號：S660.1文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）11-0010-10

我國是目前世界上最大的水果生產(chǎn)國和消費國，種植面積和產(chǎn)量均居世界第一。全國共有21個國家果樹種質(zhì)資源圃，保存果樹種質(zhì)資源2.3萬余份，是多種果樹的起源演化中心之一，同時也是世界上最大的果樹資源國［1］。然而，我國的果樹資源仍然存在數(shù)量不足、覆蓋面積不足、缺少外國種質(zhì)等問題［2］。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，自1950年以來，我國育成了約2 000多個果樹品種［1］，但在實際生產(chǎn)中這些品種的應(yīng)用十分有限，這主要是由于在種質(zhì)資源利用方面，骨干親本的重復(fù)利用導(dǎo)致品種間基因同質(zhì)性高、遺傳背景狹窄。此外，我國的果樹育種以傳統(tǒng)的雜交育種為主，現(xiàn)代育種技術(shù)與理論基礎(chǔ)結(jié)合不夠緊密，未能實現(xiàn)分子標記輔助育種、基因編輯、全基因組選擇等實用化技術(shù)突破。我國的果樹產(chǎn)業(yè)與先進國家之間存在一定差距，尤其是突破性優(yōu)良品種方面，需加強對優(yōu)異野生資源的挖掘利用，加強高效育種技術(shù)理論研究和實踐應(yīng)用，以高效培育出遺傳背景豐富、品質(zhì)優(yōu)異的特色品種，調(diào)整產(chǎn)業(yè)品種結(jié)構(gòu)、引領(lǐng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）是利用連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）為理論基礎(chǔ)，通過大樣本群體中的表型變異和多態(tài)性標記展開統(tǒng)計分析，定位影響復(fù)雜性狀的基因或基因組區(qū)域，是一種成本低、精度高的基因分型方法［3］，通過高密度單核苷酸多態(tài)性序列標記（single nucleotide polymorphism，SNP）在全基因組的分布，至少找到1個能夠影響目標性狀的數(shù)量性狀位點（quantitative trait locus，QTL），從而實現(xiàn)目標性狀的定位、新標記開發(fā)和新基因挖掘。GWAS已成為研究植物種質(zhì)資源和育種的重要手段和方法［4］。在作物領(lǐng)域，關(guān)聯(lián)分析主要應(yīng)用于水稻稻瘟?。?］、小麥穗粒數(shù)［6］、玉米穗部性狀［7］、油菜角果粒數(shù)［8］、棉花產(chǎn)量［9］、大豆耐低磷性［10］等。近年來，隨著全基因重測序成本大幅度降低，果樹基因組序列陸續(xù)公布，GWAS已應(yīng)用于包含櫻桃［11］、桃［12］、蘋果［13］、梨［14］、葡萄［15］、柑橘［16］等果樹研究中。本文基于全基因組關(guān)聯(lián)分析的基本原理和影響因素概述，重點闡述了GWAS在果樹重要性狀定位的最新研究進展，探討了果樹GWAS未來研究趨勢。

1 全基因組關(guān)聯(lián)分析的基本原理

連鎖不平衡（LD）是指在一段基因序列中，2個不同基因座之間的2種等位基因非隨機地聯(lián)合存在的現(xiàn)象［17］。LD的存在會影響全基因組關(guān)聯(lián)分析的精度和可靠性，其程度的高低受多種因素影響，包括基因座的物理距離、遺傳多樣性、種群歷史等。在關(guān)聯(lián)分析中，通常使用D′（standardized disequilibrium coefficients，D′）和r2（squared allele-frequency correlation，r2）2個參數(shù)來衡量基因座間的LD程度。D′值范圍在0～1之間，表示2個基因座間的非隨機聯(lián)合存在程度；r2值也在0～1之間，表示2個基因座在不同群體中的等位基因頻率的協(xié)方差，值越高表示LD程度越高［18］。全基因組關(guān)聯(lián)分析利用LD的特性，對大規(guī)模遺傳數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，尋找基因座與性狀之間的關(guān)聯(lián)，從而找到可能影響性狀的基因或基因組區(qū)域具有重要意義。

在GWAS分析中，r2被認定為是衡量LD的首選指標，用于評估標記和遺傳變異性狀之間的相關(guān)性［19］。LD衰減是指隨著物理距離的增加，基因座之間的r2值逐漸減小的過程，表示從連鎖不平衡狀態(tài)到平衡狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。一般情況下，馴化程度較高的群體，其LD衰減距離較大。

2 全基因組關(guān)聯(lián)分析的影響因素

2.1 群體大小和結(jié)構(gòu)

群體大小直接影響表型和基因型之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，大型群體具有增強友系關(guān)聯(lián)的作用［20］。然而，特定的育種親本及其后代可能會影響群體結(jié)構(gòu)，從而影響群體中SNP與目標性狀之間的關(guān)聯(lián)，是因為估計的育種值會顯著高于其他親本材料，并且在親本后代組成的亞群中等位基因頻率更高，因此在特定亞群中可能存在假陽性結(jié)果［21］。為了平衡遺傳多樣性和等位基因頻率，選擇全球范圍內(nèi)的多樣性個體組成大群體是最佳選擇［20］。

2.2 表型變異

表型變異是關(guān)聯(lián)分析的重要組成部分，為了保證分析的準確性，表型數(shù)據(jù)應(yīng)符合正態(tài)分布。通常情況下，繪制箱線圖可以排除極端異常值。為了減少誤差，經(jīng)常采用采集多年多點表型數(shù)據(jù)的方式，但是這種方法可能會受到環(huán)境的影響，從而導(dǎo)致遺傳力下降。為了解決這個問題，可以使用最佳線性無偏預(yù)測（BLUP）和最佳線性無偏估計（BLUE）等方法進行數(shù)據(jù)歸一化處理，調(diào)整基因型×環(huán)境間的相互作用，上述方法可以有效地減少誤差并提高分析的準確性［22］。

2.3 統(tǒng)計模型

根據(jù)基因控制的數(shù)量不同，可以將性狀分為質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀。對于質(zhì)量性狀，通常采用Logistic回歸模型進行關(guān)聯(lián)分析。而對于數(shù)量性狀，關(guān)聯(lián)分析多采用一般線性模型（GLM）和混合線性模型（MLM）2種方法［23］，GLM模型通過引入?yún)f(xié)變量來解釋基因型在群體中的方差［24］，而MLM則在GLM的基礎(chǔ)上加入群體結(jié)構(gòu)和個體間關(guān)系，以減少假陽性的影響［25］。

3 GWAS在果樹中的應(yīng)用

對于果樹，果實品質(zhì)（內(nèi)在品質(zhì)和外觀品質(zhì)）和抗性是種質(zhì)資源和育種研究經(jīng)久不衰的方向，以下綜述了GWAS在仁果類、核果類、柑橘類、漿果類及其他果樹上的研究應(yīng)用，分析現(xiàn)有文獻，關(guān)聯(lián)分析相關(guān)研究也主要集中在品質(zhì)性狀評估和抗性基因鑒定等方面，詳見表1。

3.1 仁果類果樹

蘋果是仁果類果樹中的代表性樹種，我國蘋果栽培面積和產(chǎn)量居世界首位［26］，果實品質(zhì)、病害、脅迫響應(yīng)機制等一直是蘋果研究的重點，GWAS也不例外，但相關(guān)報道較少。果實香氣受糖酸含量、著色、重量、外界環(huán)境等多因素影響，是蘋果重要的品質(zhì)因子［27］。研究人員基于氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）從149個蘋果樣本中鑒定出49種揮發(fā)性有機化合物（volatile organic compounds，VOCs），經(jīng)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，在2號染色體上有和乙酸丁酯、乙酸己酯相關(guān)的

顯著性標記，同時檢測到3個與收獲時期顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點，其中1個SNP（chr3：31409362）位于果實成熟轉(zhuǎn)錄因子NAC18.1的編碼區(qū)［28］。蘋果褐斑?。╝pple marssonina blotch，AMB）是由蘋果雙殼菌引起的病害，可在葉片和果實上發(fā)生，導(dǎo)致早期落葉、降低果實質(zhì)量、影響樹木活力和生長。通過全基因組關(guān)聯(lián)分析探索影響AMB疾病感染的基因，發(fā)現(xiàn)5個極顯著SNP位點與AMB抗性相關(guān)，LOC103442381和LOC103443382這2個SNP位點相關(guān)的候選基因可能與AMB抗性密切相關(guān)［29］。葉片蠟質(zhì)能夠阻止非氣孔水分流失，從而增強植株的抗寒、抗旱能力［30-32］，CAO等基于GC-MS方法分析123份蘋果新鮮葉片中蠟成分并進行GWAS，篩選得到了大量顯著性位點，并結(jié)合GO富集分析，研究發(fā)現(xiàn)7個與葉蠟合成和運輸相關(guān)的基因，分別是MdSHN1、MdWSD1、MdLTP4、MdRDR1、MdACBP6、MdNLE和MdABCG21，以上研究及結(jié)果為蘋果育種中品質(zhì)、抗病性基因挖掘及分析標記開發(fā)提供了重要參考［33］。

我國梨栽培面積和產(chǎn)量占世界一半以上［34］，但存在著果實品質(zhì)較差、經(jīng)濟效益低的問題［35］，開展梨品質(zhì)資源鑒定、性狀遺傳基礎(chǔ)研究從而進行性狀改良遺傳育種，解決梨口味淡、品質(zhì)差的弊端具有重要意義。研究者基于312個沙梨初花期、果實發(fā)育期和營養(yǎng)生長天數(shù)等果實物候期性狀、單果重、石細胞含量、果皮顏色等果實品質(zhì)性狀的GWAS，發(fā)現(xiàn)了與物候期相關(guān)的5個基因座和與果實品質(zhì)相關(guān)的37個候選基因座，其中候選基因PbrSTONE的功能被證實參與了梨石細胞形成的調(diào)控，這項研究為利用GWAS研究果實復(fù)雜生物學(xué)性狀提供了新思路［36］。尹明華等對2種上饒早梨品種進行全基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序，將獲得的基因組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)共有1 561個基因在上饒梨中表達，其中198個轉(zhuǎn)錄本差異顯著，部分基因具有高表達差異，為上饒梨品種資源鑒定和品種選育提供了理論基礎(chǔ)［37］。Minamikawa等也通過GWAS鑒定到與果實質(zhì)量、酸含量、果實表皮顏色、霉心病、采前果實落果等性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點，對于探尋位點上控制上述性狀的關(guān)鍵基因提供了參考［38］。

綜上所述，全基因組關(guān)聯(lián)分析在有效鑒定果實發(fā)育中重要品質(zhì)性狀的遺傳位點、挖掘調(diào)控果實發(fā)育過程相關(guān)基因等中發(fā)揮了重要作用，也為其他性狀的相關(guān)研究提供了參考和思路。

3.2 核果類果樹

核果類果樹包含桃、李、杏、櫻桃等?？v觀產(chǎn)業(yè)發(fā)展，傳統(tǒng)桃、李、杏、櫻桃品種普遍因果肉軟、不耐運貯、貨架期短及綜合品質(zhì)差等因素而面臨淘汰，產(chǎn)業(yè)亟需品質(zhì)好、硬度高的優(yōu)良品種［39］。此外，李痘病和褐腐病是危害核果類果樹的主要病害，李痘病甚至?xí)斐蓺錃@，褐腐病主要危害果實，嚴重時造成絕產(chǎn)，所以加強種質(zhì)資源發(fā)掘利用、研究果實品質(zhì)性狀遺傳基礎(chǔ)、開發(fā)與性狀關(guān)聯(lián)的標記開發(fā)等，對于核果類果樹品質(zhì)及抗性選育具有重要意義。

研究人員利用由野生品種、地方品種、育成品種組成的129份桃種質(zhì)進行高通量測序，并對果肉質(zhì)地、果實特性、種子特性等進行GWAS，篩選得到的關(guān)于果肉質(zhì)地、果實形狀和果肉黏度等性狀的峰值信號與連鎖分析結(jié)果相一致，并發(fā)現(xiàn)在桃的馴化和改良過程中，一些與果實重量和可溶性固形物含量相關(guān)的基因組區(qū)域與預(yù)測的選擇性清除相重疊［40］。對于櫻桃而言，果皮顏色豐富，可分為黃色、紅黃色、紅色、紫紅色、紅紫色、紫色櫻桃，櫻桃果皮顏色呈紅色與花青苷的含量與組成有關(guān)［41］。為了提高甜櫻桃標記密度，以235份甜櫻桃種質(zhì)為試驗材料進行GWAS，發(fā)現(xiàn)櫻桃果實顏色和果肉顏色相關(guān)的候選基因MYB10.1存在單核苷酸缺失，位于chr3_23995550位點上，與最顯著位點chr3_23939472相距約55 kb，對黃色櫻桃果實進行測序后，發(fā)現(xiàn)3號染色體上存在一段90 kb的缺失與果實顏色有關(guān)，其中包括5個MYB10轉(zhuǎn)錄因子，這些結(jié)果對于了解櫻桃的遺傳機制和DNA輔助育種具有重要意義［42］。

李痘病毒（plum pox virus，PPV），別名莎卡（sharka），是李屬（Prunus L.）植物中危害最大的病毒之一。為進一步了解杏樹抗PPV的遺傳特性，Mariette等利用包括22份抗性材料在內(nèi)的72份杏育種資源進行全基因組SNP分型，通過對56 708個SNP進行GWAS，共鑒定到38個顯著性SNP，其中有34個SNP位點的候選基因與植物-病毒的相互作用有關(guān)，基因pp022195編碼BTB/POZ-MATH-TRAF樣蛋白，ppa012234m推測編碼絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）雙特異性（絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸）磷酸酶［43］。這些候選蛋白表明植物降解途徑存在與杏抗PPV相關(guān)的潛在抗病毒機制［44-45］。褐腐?。∕onilinia spp.）是一種核果病害，會導(dǎo)致果實腐爛，造成產(chǎn)量嚴重損失。為了確定與褐腐病相關(guān)的基因組區(qū)域，研究人員選用了26個具有Bolinha品種抗性的桃栽培品種及其子代作為試驗材料，在2年中對損傷和非損傷果實的褐腐病嚴重程度指數(shù)進行GWAS，鑒定出了4個與果肉和10個與果皮耐腐相關(guān)的SNP位點，確定了25個與抗病性相關(guān)的候選基因，該報道研究結(jié)果有助于深入了解褐腐病的遺傳機制，為DNA輔助育種提供了重要基礎(chǔ)［46］。

3.3 柑橘類果樹

相比較于其他果樹，柑橘已進入分子育種時代，國際上已經(jīng)公布14個柑橘基因組，進入功能基因組和泛基因組時代［47］。目前針對柑橘的農(nóng)藝性狀已經(jīng)展開多項全基因組關(guān)聯(lián)分析研究，獲得了與果實重量、果皮顏色、果肉硬度、花藥顏色等多種表型相關(guān)的顯著性位點。國內(nèi)外均有相關(guān)報道，根據(jù)Minamikawa等的研究，基于111個柑橘品種組成的親本群體和676個F1代個體組成的育種群體，獲得 1 841 個SNP的基因分型，對包括果實重量、果皮顏色、果實硬度和種子數(shù)量等的17個農(nóng)藝性狀進行GWAS，發(fā)現(xiàn)最顯著的SNP位于8號染色體，并與果實重量性狀相關(guān)聯(lián)，且該SNP位于QTL作圖研究中的FW8區(qū)域內(nèi)［48］。Imai等對110份柑橘材料的8種果實品質(zhì)性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在2 309個SNP中鑒定到7個顯著相關(guān)的QTL區(qū)域，包含與果實重量相關(guān)的QTL 4個，與果皮顏色、果肉硬度和囊硬度相關(guān)的QTL各1個［49］。孫珍珠利用240份寬皮柑橘與112 768個SNPs進行GWAS，以果形指數(shù)、果皮光滑度、花藥顏色等10個重要性狀為表型指標，共鑒定到35個顯著性SNP標記，其中與花藥顏色性狀相關(guān)的顯著性位點最多，共10個。此外，還找到了55個候選基因，分布在NW006262339.1和NW006262022.1等2條染色體上。這些QTL的發(fā)現(xiàn)和候選基因的發(fā)掘有望應(yīng)用于柑橘雜交種的培育中［50］。

3.4 漿果類果樹

分析文獻報道發(fā)現(xiàn)，漿果類果樹的全基因組關(guān)聯(lián)分析主要集中于葡萄的研究中，其他漿果類果樹的GWAS處于起步階段。鮮食葡萄育種的目標主要包括有香氣、自然大粒、耐貯運［51］，因而育種家在品種選育過程中更多地關(guān)注果實形態(tài)、果實重量、果實開裂程度等果實重要農(nóng)藝性狀。研究表明漿果果形性狀可能受多基因協(xié)同調(diào)節(jié)，基因VIT_12s0134g00230和VIT_02s0025g01360通過調(diào)節(jié)植物激素影響果實形態(tài)，泛素連接酶基因VIT_03s0088g01090和VIT_10s0003g04300與多種漿果形狀相關(guān)［52］。Guo等對179份葡萄種質(zhì)進行了全基因組測序，并將32 311個SNP與果實發(fā)育期、果實重量、果實形狀等8個性狀進行GWAS，篩選出多個顯著性標記。其中，在2號染色體上檢測到與葡萄果皮顏色相關(guān)的mybA轉(zhuǎn)錄因子，以及在16號染色體上檢測到2個與果實發(fā)育期相關(guān)的顯著性標記［15］。這些與漿果性狀密切相關(guān)的標記有助于葡萄育種。裂果是果實生長發(fā)育過程中常見的現(xiàn)象，嚴重影響果實產(chǎn)量和品質(zhì)。Zhang等通過2019年和2020年連續(xù)調(diào)查，對漿果開裂率、漿果開裂指數(shù)和漿果開裂類型進行關(guān)聯(lián)分析，鑒定到5個與漿果開裂指數(shù)相關(guān)的SNP，2個與漿果開裂類型相關(guān)的SNP，這些位點分布于4條染色體上，與10個候選裂果基因相關(guān)［53］。

藍莓和樹莓作為新興水果，相較于其他果樹歷史較短，參考基因組公布時間也比較晚，全基因組關(guān)聯(lián)分析相關(guān)研究仍處于起步階段。在南高叢藍莓品種中，F(xiàn)erro等利用源自92個南高叢組合的886份雜交后代為試驗材料，以10種脂肪酸衍生物、5種萜類化合物、2種苯類化合物為表性指標，利用GWAS分析成功鑒定到藍莓上有519個顯著性SNPs與屬于不同代謝途徑的11個揮發(fā)性有機化合物（volatile organic compounds，VOCs）相關(guān)。他們證明了VOCs受幾個主要的基因組區(qū)域控制，其中一些區(qū)域含有生物合成酶編碼基因，部分VOCs調(diào)節(jié)消費者偏好，為育種提供了方向［54］。為簡化生產(chǎn)管理難度，樹莓品種的無刺性狀也備受關(guān)注。Khadgi和Weber以92個樹莓樣本為材料進行測序，鑒定了4個極顯著SNP，其中SNP 4_35148226被鑒定為對無刺性狀有積極貢獻，為研究樹莓無刺性狀基因組區(qū)域奠定了基礎(chǔ)［55］。

草莓枯萎?。‵usarium wilt）是一種由真菌引起的突然傳播性疾病，嚴重影響全球草莓生產(chǎn)。Pincot等通過對565份重要草莓種質(zhì)的14 408個SNP進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在2號染色體的2.3 Mb區(qū)間內(nèi)檢測到與草莓枯萎病基因Fw1連鎖不平衡的14個SNP，最顯著SNP解釋了85%的表型變異，預(yù)測了97%的抗性，廣義遺傳力為0.96［56］。

綜上，研究發(fā)現(xiàn)的SNP位點有望在品種改良中發(fā)揮重要作用，為推進通過分子標記輔助育種和基因選擇來提高核果類果樹的品質(zhì)、抗病性等奠定了基礎(chǔ)。

3.5 其他經(jīng)濟類果樹

除上述大宗類果樹外，在甜瓜、棗、橄欖等經(jīng)濟類果樹中也逐步開展了全基因組關(guān)聯(lián)分析研究。其中在甜瓜中，研究者基于48個商業(yè)東方甜瓜品種的葉片、葉柄、花序、果實等48個表型進行了GWAS，新發(fā)現(xiàn)了2個分別位于1號染色體和8號染色體上的OM1_30331998和OM8_81597532個SNP位點與性別表達相關(guān)，并預(yù)測到4個潛在候選基因MELO3C015898、MELO3C015904、MELO3C024563和MELO3C024565與東方甜瓜的性別表達相關(guān)［57］，這些結(jié)果為研究甜瓜性別表達的分子遺傳機制提供了基礎(chǔ)。在棗中，研究人員基于180份中國棗的9個品質(zhì)性狀開展關(guān)聯(lián)分析，成功鑒定出45個與果實大小、果核大小和果實開裂相關(guān)的SNP標記，并通過基因功能注釋，鑒定出了21個候選基因，這些基因參與細胞擴增、非生物脅迫反應(yīng)、激素信號和生長發(fā)育等過程［58］。在橄欖中，Kaya等對來自美國和土耳其共183份橄欖材料，利用GWAS技術(shù)探究了葉片長度、葉片寬度、果實重量、果核重量和果肉果核比5個性狀與SNP的相關(guān)性，共發(fā)現(xiàn)52個顯著性標記與葉片長度、果實重量、果核重量和果肉果核比相關(guān)聯(lián)，預(yù)測到19個候選基因，大部分的基因注釋是參與生理發(fā)育過程的蛋白質(zhì)［59］。

綜上，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，可以找到與目標性狀密切相關(guān)的位點，挖掘基因功能，從而在解析果樹品質(zhì)形成機制、遺傳馴化規(guī)律、病害發(fā)生機理及鑒定種質(zhì)資源、分析基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等方面發(fā)揮重要作用。上述研究為理解核果類果樹李痘病、褐腐病等重要病害的遺傳機制及品質(zhì)等農(nóng)藝性狀候選基因的篩選研究提供了重要基礎(chǔ)，為推動分子標記輔助選擇（marker-assisted selection，MAS）育種的進程提供了重要參考。

4 GWAS的發(fā)展應(yīng)用

GWAS作為定位性狀相關(guān)位點、基因的有效工具，在植物中最早被應(yīng)用于糖料作物海甜菜的研究［60］，距今已有20多年，隨著對植物基因組認識的不斷深入，GWAS相關(guān)的衍生技術(shù)也已被廣泛應(yīng)用，為研究提供了更多的思路和選擇。目前在植物中應(yīng)用比較廣泛的GWAS衍生技術(shù)主要集中于對基因型數(shù)據(jù)進行改變，以及關(guān)聯(lián)分析和其他方法的結(jié)合運用2方面，從而更好地研究性狀的遺傳變異趨勢，彌補GWAS的不足。以下綜述結(jié)構(gòu)變異（structural variant，SV）、轉(zhuǎn)座子（transposable element，TE）及轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析（TWAS）與GWAS聯(lián)合運用的研究進展。

結(jié)構(gòu)變異（SV）包括插入、缺失、重復(fù)和倒位［61］，最初被定義為超過1 kb大小的插入、缺失和反轉(zhuǎn)，但隨著人類基因組測序的常規(guī)化，結(jié)構(gòu)變異已經(jīng)包括長度大于50 bp的事件［62］。隨著泛基因組研究的增多，基于SV開展GWAS，已成功應(yīng)用于大豆［63］、玉米［65］、油菜［66］、桃［67-69］、水稻［70-71］、番茄［72］等植物性狀的研究中，證明與傳統(tǒng)的SNP相比，SV具有更大的表型效應(yīng)，基因或調(diào)控序列中出現(xiàn)的SV基因可能會影響表達，進而影響農(nóng)藝性狀的變化。

轉(zhuǎn)座子（TE）活性通過轉(zhuǎn)位、插入、切除、染色體斷裂和異位重組產(chǎn)生基因和基因組結(jié)構(gòu)的變化，通常伴隨著基因活性的改變［73］。有研究證明，使用TE標記進行GWAS比使用SNP標記連鎖不平衡的假陽性低，基因組掃描顯示了與農(nóng)藝性狀相關(guān)的TE陽性選擇［74］。在番茄中用TE插入多態(tài)性（TE insertions polymorphisms，TIP）進行關(guān)聯(lián)分析，確定了至少40個與主要農(nóng)藝性狀或次級代謝產(chǎn)物的極端變異密切相關(guān)的TIP，大部分TE插入都是低頻變體，很少被SNP標記［75］。玉米ZmCCT基因編碼含有CCT結(jié)構(gòu)域的光周期相關(guān)蛋白質(zhì)，通過GWAS在啟動子中檢測到CACAT樣轉(zhuǎn)座子，顯著縮短開花時間，TE插入發(fā)生在馴化之后，在相關(guān)的連鎖不平衡區(qū)塊內(nèi)產(chǎn)生了強烈的選擇性清除［76］。

全轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析（transcriptome-wide association study，TWAS）是基于GWAS的統(tǒng)計分析，將基因表達量與表型性狀相關(guān)聯(lián)，識別與復(fù)雜性狀相關(guān)聯(lián)的順式調(diào)節(jié)表達基因［77］，補充研究GWAS定位到的基因與關(guān)聯(lián)性狀背后的生物學(xué)機制［78］。GWAS+TWAS聯(lián)合運用的方法已經(jīng)在多種植物中得到應(yīng)用，包括玉米［79-80］、棉花［81］、水稻［82］、油菜［83-84］等，首先通過GWAS與功能基因組學(xué)相結(jié)合鑒定調(diào)節(jié)基因，其次利用TWAS研究調(diào)節(jié)基因的表達量與復(fù)雜性狀之間的關(guān)聯(lián)，對鑒定到的基因進行貢獻率排序，從而更全面地了解基因調(diào)控機制和復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)［85］。

綜上，利用SV、TE開展關(guān)聯(lián)分析以及GWAS+TWAS等衍生應(yīng)用在擴大表型效應(yīng)、降低連鎖不平衡的假陽性、關(guān)聯(lián)基因表達量與復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)等方面具有優(yōu)勢，彌補了GWAS單獨分析的不足。

5 展望

GWAS是一種挖掘功能基因/位點的有效研究手段，其優(yōu)勢在于不需要任何先驗信息來衡量遺傳變異和表型多樣性之間的關(guān)聯(lián)便可以挖掘種質(zhì)資源中尚未發(fā)現(xiàn)的有價值的遺傳變異，為今后的育種工作提供新的遺傳變異，為實現(xiàn)品種改良，開發(fā)具有理想性狀的新品種奠定了前期基礎(chǔ)。

縱觀水稻、玉米和大豆等大田作物，除了鑒定顯著性位點，更多的是關(guān)注性狀的遺傳調(diào)控機制，挖掘功能基因所處的信號調(diào)節(jié)通路。如利用大豆GWAS得到的顯著性關(guān)聯(lián)區(qū)域構(gòu)建遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)有部分性狀可能共同遺傳，受同一個顯著性區(qū)域調(diào)控，為一因多效作用的結(jié)果［86］；在水稻研究中發(fā)現(xiàn)，OsGSK2基因是參與油菜素甾體信號（brassinosteroids，BR）傳導(dǎo)的保守激酶，通過協(xié)調(diào)獨腳金內(nèi)酯和油菜素甾醇調(diào)節(jié)中胚軸長［87］；MRG702基因、粒寬基因GW5在秈稻、粳稻2個栽培稻群體中受選擇，參與BR信號通路的調(diào)控［88］；對8個植物代表性性狀進行PCA，利用PC1作為因變量進行GWAS研究，發(fā)現(xiàn)SPINDLY基因被鑒定為通過抑制赤霉素（GA）信號傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)水稻結(jié)構(gòu)［89］。與之相比在果樹中的研究應(yīng)用還相對滯后，可借鑒、參考其思路和方法。

果樹開展GWAS研究的瓶頸因素包括以下內(nèi)容：（1）樣本數(shù)量和種質(zhì)資源：GWAS研究需要大量的樣本和種質(zhì)資源，而果樹因保存資源受試驗地面積影響，多數(shù)野生資源、地方品種以原生態(tài)就地保存為主，分布廣泛，集中獲取難度大。（2）基因組數(shù)據(jù)：GWAS研究需要高質(zhì)量完整的基因組數(shù)據(jù)進行分析，但是果樹基因組數(shù)據(jù)的獲取、分析和注釋仍存在困難，這也制約了GWAS研究的深入開展。（3）環(huán)境因素的影響：果樹對于環(huán)境的適應(yīng)性很強，而環(huán)境因素對果樹性狀的影響比其他作物更為復(fù)雜多變，環(huán)境因素可能會掩蓋或干擾GWAS的結(jié)果。（4）遺傳背景和多倍體物種分析：果樹多數(shù)為多倍體物種，造成基因型分析和遺傳背景建立存在難度，同時多倍體物種還需要考慮親代效應(yīng)、雜種優(yōu)勢、雜合子喪失等問題。這些因素都增加了果樹GWAS研究的復(fù)雜性。針對這些問題，需要通過多種手段解決，如建設(shè)多樣化的果樹種質(zhì)資源庫，改進數(shù)據(jù)測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，開展多個作物種類的GWAS研究以提高GWAS的可靠性和推廣應(yīng)用。

綜上所述，隨著蘋果［90］、桃［91］、梨［92］、藍莓［93］等果樹基因組的公布，在果實品質(zhì)性狀評估、抗性基因鑒定等方面發(fā)揮了重要作用。此外，果樹上GWAS研究目前相對集中在核果類和仁果類果樹中，而對于樹莓、藍莓等樹種的GWAS研究領(lǐng)域仍有大量空白需要填補。因此，在今后的研究中，開展結(jié)構(gòu)變異、轉(zhuǎn)座子層面的關(guān)聯(lián)分析，以及將GWAS研究與QTL定位、轉(zhuǎn)錄組、基因選擇、基因編輯、功能基因解析等多種方法結(jié)合在一起，將更有利于實現(xiàn)基因組學(xué)輔助育種和基于基因組學(xué)的技術(shù)對果樹進行遺傳改良。

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