連作對(duì)北沙參根系土壤中細(xì)菌群落的影響

摘要：研究北沙參連作過(guò)程中根際土壤細(xì)菌群落組成成分、多樣性和結(jié)構(gòu)的差異，以探究北沙參連作障礙發(fā)生機(jī)制?；贗lluminaMiseq高通量測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA序列V3～V4區(qū)的高通量測(cè)序，對(duì)北沙參栽培過(guò)程根際土壤細(xì)菌群落組成成分、結(jié)構(gòu)差異等進(jìn)行分析和表型預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，門(mén)水平上優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的細(xì)菌在不同茬口的根際土壤中相對(duì)豐度差異較大；不同茬口的根際土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度在屬分類水平上優(yōu)勢(shì)菌株不同；細(xì)菌表型預(yù)測(cè)分析表明，革蘭氏陰性、致病潛力等在重茬中的相對(duì)豐度要高于對(duì)照和初茬。 北沙參連作過(guò)程中根際土壤細(xì)菌群落組成成分、結(jié)構(gòu)相似性及多樣性呈漸次變化趨勢(shì)，根系土壤的細(xì)菌物種連續(xù)積累和消減，形成特定的細(xì)菌群落，是形成北沙參連作障礙的主要原因之一。

關(guān)鍵詞：北沙參；根系土壤；細(xì)菌群落；高通量測(cè)序；多樣性

中圖分類號(hào)：S567.5₊30.61；S344.4" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）19-0219-13

收稿日期：2024-06-20

基金項(xiàng)目：河北省省級(jí)科技計(jì)劃（編號(hào)：H2024423018、22326418D）；河北省教育廳在讀研究生創(chuàng)新能力培養(yǎng)資助項(xiàng)目（編號(hào)：XCXZZSS2023011）；河北省二期現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號(hào)：HBCT2018060205）；河北中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：202314432183X、s202414432021、s202414432050）；河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃（編號(hào)：2023351）。

作者簡(jiǎn)介：趙靖僑（1997—），女，河北邢臺(tái)人，碩士研究生，主要從事中藥資源與開(kāi)發(fā)研究。 E-mail：yolospower@163.com。

通信作者：韓曉偉，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥資源與開(kāi)發(fā)研究。 E-mail：hanxiaowei2015@126.com。

北沙參為傘形科珊瑚菜（Glehnia littoralis Fr. Schmidtex Miq）的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》^［1］，具有養(yǎng)陰清肺，益胃生津等功效，用于治療肺熱燥咳、勞嗽痰血、胃陰不足、熱病津傷、咽干口渴等疾病^［2］ 。近年來(lái)，北沙參的市場(chǎng)需求增加，年需求量在5 000 t左右，現(xiàn)市場(chǎng)上的野生北沙參已經(jīng)不能滿足人們的需求，市場(chǎng)上流通的主要是栽培品種^［3］。但是，北沙參在栽培過(guò)程中存在明顯的連作障礙，造成產(chǎn)量品質(zhì)嚴(yán)重下降，這限制了中藥資源的可持續(xù)生產(chǎn)以及北沙參產(chǎn)區(qū)區(qū)域經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，被認(rèn)為是土壤質(zhì)量不可缺少的組成部分，兩者功能是相輔相成、息息相關(guān)的，并且跟植物之間有著緊密的聯(lián)系，因此微生物群落的組成及其多樣性是衡量土壤性質(zhì)和功能的一個(gè)重要指標(biāo)。連作障礙形成及加重的原因極其復(fù)雜。根際作為植物-土壤-微生物三者緊密結(jié)合、相互交流的場(chǎng)所對(duì)植物健康生長(zhǎng)具有重要意義^［4］ 。植物可以通過(guò)根系分泌某些化合物來(lái)吸引某些特定微生物類群^［5］，反之，微生物群落的數(shù)量和多樣性的改變，也會(huì)影響土壤的微生態(tài)功能^［6］。作物連作打破了根際土壤微生物生態(tài)平衡，進(jìn)而導(dǎo)致有益微生物減少和病原微生物的積累。藥用植物生產(chǎn)中普遍存在連作障礙^［7］，這不僅降低了藥用植物的產(chǎn)量和品質(zhì)，還影響臨床用藥安全^［8］。藥用植物連作障礙的原因主要有土壤養(yǎng)分失調(diào)和理化性質(zhì)劣變、土壤傳染性病蟲(chóng)害加重、根系分泌物和殘茬分解物影響等^［9］，因此研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)于闡明藥用植物連作障礙有重要作用。

高通量測(cè)序技術(shù)是近些年來(lái)基因組學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的測(cè)序技術(shù)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，與植物、動(dòng)物和人類相關(guān)的微生物的大規(guī)模測(cè)序研究數(shù)量也在增加，能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)對(duì)幾百萬(wàn)DNA分子的測(cè)序，達(dá)到鑒定微生物的單一基因或全基因組的目的。IlluminaMiseq憑借測(cè)序快、通量高和可信度高等優(yōu)勢(shì)，在根際土壤微生物區(qū)系研究中得到廣泛應(yīng)用^［10-14］。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)北沙參不同茬口土壤中細(xì)菌群落的組成成分、多樣性和結(jié)構(gòu)差異等進(jìn)行研究，旨在探索不同種植模式對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響，以期為揭示連作障礙的微生物學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為克服連作障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤和土樣采集、處理

本試驗(yàn)于2019年9月21日進(jìn)行，不同茬口的北沙參土壤樣品采集于河北省石家莊市鹿泉區(qū)河北中醫(yī)學(xué)院藥園。對(duì)照土壤為藥園中3年未種植植物的土壤，初茬（FS）土樣為對(duì)照樣地上種植北沙參后的土壤，重茬（CS）土樣為初茬（FS）北沙參收獲后，再次種植北沙參后的土壤。

每個(gè)樣地隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)的土壤樣品，將樣地北沙參表面的土層處理干凈后，采集0～20 cm的根際土樣。采集15個(gè)樣地土樣［對(duì)照（CK）5個(gè)樣地，初茬（FS）5個(gè)樣地，重茬（CS）5個(gè)樣地］，將采集的每個(gè)樣地的5個(gè)點(diǎn)的土壤樣品混合，裝入自封袋做好標(biāo)記，并帶回實(shí)驗(yàn)室處理。將采集來(lái)的土壤樣品，稱取大約200 g新鮮土樣經(jīng)液氮處理后，置于 -80 ℃ 冰箱中保存，用于土壤微生物群落檢測(cè)。

1.2 土壤微生物種類和數(shù)量的測(cè)定

土壤微生物種類和數(shù)量的測(cè)定由杭州聯(lián)川生物技術(shù)公司完成。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

利用 QIIME2 分析軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，首先調(diào)用 qiime cutadapt trim-paired 切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列；然后通過(guò) qiime dada2 denoise-paired 調(diào)用 DADA2 進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體獲得 ASVs 。序列長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)使用 R 語(yǔ)言腳本，對(duì)全部樣本中所包含的高質(zhì)量序列的長(zhǎng)度分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用 BROCC 算法（https：//github.com/kylebittinger/q2-brocc#the-brocc-algorithm）：首先使用 BLASTn 或 BALSTx，將序列與 nt 或 nr 數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列進(jìn)行比對(duì)；再調(diào)用 brocc.py 腳本，依據(jù)推薦的參數(shù)獲取注釋信息。數(shù)據(jù)采用 Excel 2020 和杭州聯(lián)川生物技術(shù)公司云平臺(tái)工具 （ https：//www. omicstudio. cn/tool） 進(jìn)行相關(guān)的數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)分析

本研究基于 Illumina 高通量測(cè)序平臺(tái)，對(duì)不同茬口北沙參土壤進(jìn)行細(xì)菌 16S rRNA 序列V3～V4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序分析，結(jié)果見(jiàn)表1，15個(gè)土壤樣本共獲得1 274 410條原始序列，原始數(shù)據(jù)長(zhǎng)度均大于40.48 M，過(guò)濾和去除出現(xiàn)樣本數(shù)較少和未注釋物種的序列后，共獲得100 8384條有效序列，預(yù)處理后有效數(shù)據(jù)長(zhǎng)度在26.25 M～30.70 M之間，有效數(shù)據(jù)與原始數(shù)據(jù)比值均在73.25%以上，有效數(shù)據(jù)質(zhì)量≥20%的數(shù)據(jù)比例在95.49%～98.28%，有效率數(shù)據(jù)質(zhì)量≥30%的數(shù)據(jù)比例在87.85%～94.49%，有效數(shù)據(jù)中GC含量最大為58.07%，樣本細(xì)菌基因序列被檢出的概率高，能較真實(shí)地反映樣本的細(xì)菌群落，測(cè)序深度滿足需求。

2.2 北沙參連作對(duì)土壤細(xì)菌物種群落總體多樣性的影響

微生物群落的總體多樣性見(jiàn)圖1。不同年限 Chao1、 Good-Coverage、 Observed_otus、香農(nóng)（Shannon）和Simpson指數(shù)存在差異，但是差異不顯著。 Shannon指數(shù)可以同時(shí)反映群落豐富度以及均勻度，CS處理的分布較為分散，CS和FS處理主要分布于104～112范圍內(nèi)，CK主要分布在104～108范圍內(nèi)，其中FS處理最大，即為FS＞CS＞CK，但是其P＞0.05，因此不同年限下3種根系土壤的豐富度以及均勻度差異不顯著。Simpson指數(shù)可以指示優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)豐度高低，3種年限下根系土壤的Simpson P值為0.16，故不同年限根系土壤的優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)豐度差異不顯著，CK在0.998 50～0.999 000之間分布較為集中，而CS和FS處理在0.998 75～1.000 00之間分布較為集中，在CK達(dá)到最低值，CS處理分布較為分散。Good-Coverage 指數(shù)是指?jìng)€(gè)樣本文庫(kù)的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本序列被測(cè)出的概率越高，而沒(méi)有被測(cè)出的概率就越低。圖1中 Good-Coverage 結(jié)果表明，隨著茬口的增加其覆蓋率升高，即 CS＞FS＞CK。Chao1 指數(shù)和細(xì)菌測(cè)序深度用來(lái)估計(jì)群落中實(shí)際存在的物種數(shù)，CS處理的分布較為分散，CK根系土壤樣本的Chao1 指數(shù)和 Observed_otus 指數(shù)與FS、CS處理相比最小，說(shuō)明連作影響細(xì)菌的豐富度和多樣性，且其影響程度在不同茬口間有差異，但是差異不顯著。

2.3 北沙參連作對(duì)土壤細(xì)菌群落種類組成的影響

基于門(mén)的分類水平下，不同樣本的優(yōu)勢(shì)物種組成和比例差異明顯，3組土壤種細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相近，但細(xì)菌種群所占豐度比例相差較大。不同茬口北沙參土壤細(xì)菌群落組成在門(mén)水平上的分類見(jiàn)圖2-A，各組樣本中的主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)有：變形菌門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteriota）、放線菌門(mén)（Actinobacteriota）、芽單胞桿菌門(mén)（Gemmatimonadota）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetota），其中變形菌門(mén)與北沙參茬口呈正相關(guān)，酸桿菌門(mén)與北沙參茬口呈負(fù)相關(guān)。3組樣本中其他主要優(yōu)勢(shì)群落依次為綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、疣微菌門(mén)（Verrucomiceobia）、棒狀菌門(mén)（Rokubacteria）、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）、匿桿菌門(mén)（Latescibacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、未分類的（unclassified）。其中疣微菌門(mén)（Verrucomiceobia）、未分類的（unclassified）與北沙參茬口呈正相關(guān)，綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、棒狀菌門(mén)（Rokubacteria）在CK土壤中相對(duì)豐度為8.09%和3.56%，隨著種植年限的增加逐漸降低，在重茬（CS）北沙參根際土壤中相對(duì)豐度為4.66%和2.10%。擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）、匿桿菌門(mén)（Latescibacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）在FS北沙參根際土壤中相對(duì)豐度較高（4.74%、1.74%、0.15%和0.73%），其他茬口均低于FS。

對(duì)于不同茬口北沙參根際土壤細(xì)菌在屬分類水平進(jìn)行群落組成和聚類分析（圖2-B）。其中WD2101_soil_group_unclassified、Pedosphaeraceae_unclassified、Subgroup_10、海無(wú)柄孢囊黏細(xì)菌屬（Haliangium）、SC-I-84_unclassified、低豐度菌屬（others）這6個(gè)屬下的細(xì)菌與北沙參茬口呈正相關(guān)，在重茬（CS處理）北沙參根際土壤中占比最高（依次為2.771 669 6%、1.418 961 6%、0.997 907 4%、1.152 322 2%、0.876 416 4%、51.123 001 4%），而Subgroup_6_unclassified、Gemmatimonadaceae_unclassified、MB-A2-108_unclassified、RB41、KD4-96_unclassified、Actinobacteria_unclassified、Gaiellales_unclassified、Gaiella、67-14_unclassified、Deltaproteobacteria_unclassified、P2-11E_unclassified，隨著種植年限的增加相對(duì)豐度不斷減少，在CK土壤中占比最高（13.72%、3.30%、3.82%、2.68%、2.36%、1.74%、2.19%、1.71%、0.88%、1.58%）；芽單胞桿菌屬（Gemmatimonas）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、TRA3-20_unclassified、Ellin6067、未分類的（unclassified）在FS處理中北沙參根際土壤中豐度占比最高（依次為2.31%、1.64%、2.20%、0.93%、1.15%、0.88%），這6個(gè)屬隨著茬口次數(shù)的增加先升高再降低，在FS處理的根際土壤中達(dá)到最大值。

2.4 北沙參連作對(duì)土壤細(xì)菌物種群落結(jié)構(gòu)的影響

PCoA分析中，樣品的空間距離越接近，表示樣品的物種組成結(jié)構(gòu)越相似。對(duì)FS、CS處理和CK樣品進(jìn)行PCoA分析（圖3-A），PC1的貢獻(xiàn)率為12.58%，PC2的貢獻(xiàn)率為9.62%，2個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為22.20%，可以表征所有的變量特征。結(jié)果顯示，CK的5個(gè)樣本、FS處理的5個(gè)樣本、CS處理的5個(gè)樣本明顯分開(kāi)，說(shuō)明3個(gè)處理組樣品的物種組成結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯差異，方差分析可用于組件群落結(jié)構(gòu)差異顯著性分析，P值小于0.001說(shuō)明組件呈現(xiàn)顯著性差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CS處理中的細(xì)菌在PC1和PC2都為最大值，F(xiàn)S處理在PC2上與CS處理相似。

為了進(jìn)一步研究不同茬口的細(xì)菌微生物群落的β-多樣性，基于Bary-Curtis距離，通過(guò)利用非度量型多維尺度分析（NMDS）方法對(duì)不同茬口樣CK、FS和CS處理土壤細(xì)菌微生物群落之間的差別進(jìn)行分析（圖3-B）。NMDS是一種將多維空間的研究對(duì)象（樣本或變量）簡(jiǎn)化到低維空間進(jìn)行定位、分析和歸類，同時(shí)又保留對(duì)象間原始關(guān)系的數(shù)據(jù)分析方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CK、FS和CS處理的細(xì)菌群落置信區(qū)間雖有部分重疊，但不同的細(xì)菌群落之間具有明顯的空間分布差異。CK無(wú)論是與FS處理，還是與CS處理在圖中距離比較遠(yuǎn)，說(shuō)明CK的根際土壤細(xì)菌群落與FS和CS處理的根際土壤細(xì)菌群落差異較大。結(jié)果表明，茬口次數(shù)對(duì)于根際細(xì)菌群落β-多樣性有影響。

為了探索土壤樣品中微生物群落的差異，基于ASV采用mothur生成維恩（Venn）圖。所有樣品共檢測(cè)到20 910個(gè)門(mén)類細(xì)菌ASV，其中CK、FS和CS處理分別為4 960、5 979、5 625個(gè)ASV（圖4-A）。細(xì)菌屬類共檢測(cè)到1 016個(gè)ASV，其中CK、FS和CS處理分別為67、103、133個(gè)ASV（圖4-B）。

2.5 北沙參連作對(duì)土壤細(xì)菌群落組成差異性的影響

使用自定義R腳本生成熱圖，熱圖顯示細(xì)菌的30個(gè)最具有優(yōu)勢(shì)的門(mén)類相對(duì)豐度。細(xì)菌門(mén)類的相對(duì)豐度在3個(gè)土壤樣品中的相對(duì)豐度不同，遍養(yǎng)菌門(mén)（Omnitrophicaeota）、迷蹤菌門(mén)（Elusimicrobi）、衣原體（Chlamydiae）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、匿桿菌門(mén)（Latescibacteria）及厚壁菌門(mén)（Firmicutes）在CS處理相對(duì)豐度較高（圖 5-A）。3種土壤中FS和CS處理中的疣微桿菌（Verrucomicrobia）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、髕骨細(xì)菌門(mén)（Patescibacteria）及FBP等細(xì)菌門(mén)類相對(duì)豐度較CK高（圖 5-A）。CK在棒狀菌門(mén)（Rokubacteria）、Entotheonellaeota、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、醋酸菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）相對(duì)豐度較高（圖 5-A）。

細(xì)菌屬的相對(duì)豐度在3個(gè)土壤樣品中的相對(duì)豐度不同，海無(wú)柄孢囊黏細(xì)菌屬（Haliangium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）等菌屬在初茬和重茬的相對(duì)豐度較高于CK（圖 5-B）。與此同時(shí)，一些未分類的菌屬在重茬中的相對(duì)豐度高于FS處理和CK。

TRA3-20-unclassified、Actinobacteria-unclassified、Gemmatimonadaceae-unclassified、67-14-unclassified、MND1、Bacteriap25-unclassified、Gemmataceae-unclassified、Subgroup-6-unclassified、MB-A2-108-unclassified、Gaiellales-unclassified、Gaiella、P2-11E-unclassified、RB41、Deltaproteobacter-unclassified在CK相對(duì)豐度較高，在FS和CS處理中豐度相對(duì)較低。OM190_unclassified、WD2101_soil_group_unclassified、Pirellula、未分類的（unclassified）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、芽單胞菌屬（Gemmatimaonas）、鞘鞍醇單胞菌屬（Sphingomonas）、Subgroup_10、SC_I_84_unclassified、Pedosphaeraceae_unclassified、海無(wú)柄孢囊黏細(xì)菌屬（Haliangium）在CS處理相對(duì)豐度較高，而在CK中相對(duì)豐度較低（圖5-B）。

為進(jìn)一步探索不同茬口的北沙參細(xì)菌群落各組間的差異物種，運(yùn)用LEfse分析尋找不同組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的ASV。組間群落差異分析采用LEfse在線程序進(jìn)行，顯著差異的logarithmic LDA score設(shè)為2.0，繪制進(jìn)化分支圖，其中差異顯著的物種跟隨組別進(jìn)行著色，無(wú)顯著差異的物種則統(tǒng)一著色為黃色。使用LEfse進(jìn)行組間比較分析，分析不同處理土壤微生物群落在相對(duì)豐度上有顯著差異的物種（圖6）。在LDA score≥2.0的條件下，有242個(gè)細(xì)菌類群在北沙參連作系統(tǒng)中表現(xiàn)出顯著差異，其中CK有79個(gè)細(xì)菌類群，F(xiàn)S處理有69個(gè)細(xì)菌類群，CS處理有94個(gè)細(xì)菌類群。CK中差異顯著的細(xì)菌門(mén)有4個(gè)，分別是變形菌門(mén)（Proteobacteria）、疣微桿菌門(mén)（Verrucomiceobia）、藍(lán)藻門(mén)（Cyanobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）的LDA值最高。FS處理中差異顯著的細(xì)菌門(mén)有2個(gè)，分別是芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），其中芽單胞桿菌門(mén)（Gemmatimonadetes）LDA值最高。CS中差異顯著的細(xì)菌門(mén)有5個(gè)，分別是酸桿菌門(mén)（Acidobacteriota）、放線菌門(mén)（Actinobacteriota）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、棒狀菌門(mén)（Rokubacteria）、匿桿菌門(mén)（Latescibacteria），其中放線菌門(mén)（Actinobacteriota）的LDA值最高。研究表明，同一取樣點(diǎn)CK、FS和CS處理土壤細(xì)菌組成有明顯的差異，在取樣點(diǎn)中，與FS和CS處理樣本中細(xì)菌群落相比，CK樣本細(xì)菌明顯的優(yōu)勢(shì)群落為放線菌門(mén)。

2.6 細(xì)菌表型預(yù)測(cè)

微生物群落及功能對(duì)北沙參品質(zhì)有著重要影響，為探究細(xì)菌群落如何適應(yīng)連作土壤中環(huán)境變化以及不同茬口細(xì)菌特性，本研究進(jìn)一步對(duì)3種茬口樣品細(xì)菌類群的表型進(jìn)行預(yù)測(cè)，將ASV矩陣與樣本的分類信息上傳至BugBase網(wǎng)站進(jìn)行表型預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7可知，3個(gè)茬口的北沙參根際土壤在厭氧、好氧、移動(dòng)元件含量、兼性厭氧、生物膜形成、氧脅迫耐受、革蘭氏陽(yáng)性、革蘭氏陰性、致病潛力9種表型的相對(duì)豐度差異顯著（P＜0.05）。表型為厭氧、移動(dòng)元件、兼性厭氧、氧脅迫、革蘭氏陰性、致病潛力在CS中的相對(duì)豐度要高于CK和FS處理，變化規(guī)律多為茬口增加伴隨其表型的相對(duì)豐度增加，但是厭氧表型的相對(duì)豐度在FS處理中的相對(duì)豐度最低。好氧、生物膜、革蘭氏陽(yáng)性3種表型在CK的相對(duì)豐度最高，其中好氧表型在CK和FS處理的相對(duì)豐度區(qū)別預(yù)測(cè)表示不明顯，其他表型的相對(duì)豐度均隨著茬口次數(shù)的增加而降低。

3 討論與結(jié)論

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變受種植作物影響。連作后，由于根系分泌物積累，土壤微生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變，細(xì)菌和真菌組成和豐度均有差異^［15-16］。北沙參栽培過(guò)程中根際土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)之間的差異研究表明，變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、浮霉菌門(mén)等5門(mén)細(xì)菌為北沙參生長(zhǎng)根際環(huán)境優(yōu)勢(shì)菌群細(xì)菌^［17］。其中，變形菌門(mén)與北沙參種植年限呈正相關(guān)，在北沙參重茬（CS）根際土壤豐度高達(dá)32.74%；有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，將黃瓜自毒物質(zhì)——香豆酸外源添加至土壤中，會(huì)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響，而且導(dǎo)致變形菌門(mén)等細(xì)菌大量增加及某些病原菌大量繁殖增長(zhǎng)^［18］。CS處理的根際土壤細(xì)菌門(mén)的低豐度微生物群相對(duì)豐度最高為0.013%，這里可能存在某些未知病原菌大量繁殖。同時(shí)，變形菌門(mén)是鹽堿化土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群^［19］。研究表明，變形菌門(mén)是根際微生物的主要優(yōu)勢(shì)門(mén)^［20］。隨著北沙參茬口次數(shù)增多，變形菌門(mén)的相對(duì)豐度逐漸增多，且3個(gè)茬口的相對(duì)豐度占比差異明顯。其中CK的變形菌門(mén)相對(duì)豐度占比最少，多樣性中CK細(xì)菌群落的多樣性也是最低。是由于變形菌門(mén)細(xì)菌在不同環(huán)境中廣泛分布，適應(yīng)能力強(qiáng)，是堿性土壤的主要優(yōu)勢(shì)群落，廣泛存在于以鹽堿土壤為主的礦區(qū)土壤中^［21］。酸桿菌門(mén)是新近被分出的一門(mén)細(xì)菌，屬于嗜酸菌，在自然界的各種環(huán)境中都廣泛存在，該類菌可在一些特殊的生境中生存，包括酸雨灌溉、重金屬污染的土壤及其他一些極端環(huán)境^［22］，但在生態(tài)系統(tǒng)中的具體作用尚未得到很好的研究結(jié)論。本研究中酸桿菌門(mén)與北沙參種植年限呈負(fù)相關(guān)，在CK土壤中豐度為22.29%，而CS根際土壤中豐度為18.15%。對(duì)于變形菌門(mén)和酸桿菌門(mén)群落在不同茬口中的變化推測(cè)可能與土壤的理化性質(zhì)pH值有關(guān)，這與北沙參連作后土壤堿性增強(qiáng)的結(jié)果^［23］是一致的。放線菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，大部分屬于腐生菌，有研究表明，放線菌門(mén)的部分細(xì)菌種群能夠產(chǎn)生分解木質(zhì)素的酶，具有分解木質(zhì)素和纖維素的能力，起到分解植物有機(jī)殘?bào)w的作用^［24］。同時(shí)放線菌還具有解磷作用，其相對(duì)豐度對(duì)于土壤磷含量具有一定的指示作用^［25］，研究中發(fā)現(xiàn)放線菌門(mén)與酸桿菌門(mén)的結(jié)果一致，表現(xiàn)出與北沙參種植年限呈負(fù)相關(guān)，在CK根際土壤豐度為18.04%，F(xiàn)S處理根際土壤豐度為15.02%，CS處理根際土壤豐度為13.09%。芽單胞菌門(mén)對(duì)于維持土壤正常微生態(tài)有重要作用，通過(guò)使重金屬發(fā)生氧化還原反應(yīng)改變化合價(jià)，高毒性變成低毒性^［26］，從而使土壤得到凈化，為打造綠色環(huán)境奠定基礎(chǔ)。芽單胞菌門(mén)作為有益菌，其數(shù)量隨著連茬次數(shù)增加在不斷減少，說(shuō)明連作會(huì)導(dǎo)致土壤微生態(tài)不平衡。芽單胞菌門(mén)的相對(duì)豐度在CS根際土壤中占比最小，為6.85%。本研究通過(guò)對(duì)不同茬口的北沙參根際土壤細(xì)菌群落發(fā)現(xiàn)，α-多樣性指數(shù)隨著茬口次數(shù)的增加而變化，PCoA分析和NMDS分析也表明茬口次數(shù)對(duì)細(xì)菌群落組成有顯著影響。在細(xì)菌屬的相對(duì)豐度中Subgroup_6_unclassified與北沙參種植年限呈負(fù)相關(guān)，CK的根際土壤相對(duì)豐度為13.71%，CS根際土壤豐度為10.02%，這與棉花的研究結(jié)果^［27］相反。同時(shí)隨著茬口次數(shù)的增多一些未知菌屬也增多，結(jié)果中的others在CK的根際土壤中的豐度為40.23%，F(xiàn)S的根際土壤的豐度為50.56%，CS根際土壤的豐度為51.12%，未知物種的屬增多可能是某些病原菌大量繁殖^［11］。變形菌門(mén)下的海無(wú)柄孢囊黏細(xì)菌屬（Haliangium）尤其值得關(guān)注。已有研究從海無(wú)柄孢囊黏細(xì)菌屬中分離出抗植物病原真菌物質(zhì)，說(shuō)明海無(wú)柄孢囊黏細(xì)菌屬具有潛在的生防作用^［28］。

細(xì)菌群落不同茬口間差異分析表明，不同茬口是影響根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素^［29］，其中隨著茬口次數(shù)的增加，不同組別細(xì)菌組成存在相似之處，且不同茬口之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異漸次增大^［30］。潘志針等通過(guò)對(duì)堆肥前后土壤細(xì)菌群落進(jìn)行BugBase表型預(yù)測(cè)，得出其在代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息方面功能活躍^［31］。本研究采用BugBase方法對(duì)菌群表型進(jìn)行預(yù)測(cè)，CS處理北沙參根際土壤與CK土壤在表型為移動(dòng)原件含量、兼性厭氧、氧脅迫、革蘭氏陰性、致病潛力的相對(duì)豐度要高。本研究利用BugBase來(lái)預(yù)測(cè)潛在的表型發(fā)現(xiàn)，茬口次數(shù)越多土壤兼性厭氧型菌群越多，有研究表明這些菌群較多涉及變形菌門(mén)一類^［32］，這與本研究結(jié)果相似，CS土壤根際土壤中的變形菌門(mén)隨著茬口次數(shù)增多相對(duì)豐度增大。同時(shí)，變形菌門(mén)包括多種代謝物種，其中大多數(shù)是兼性或?qū)Ｐ詤捬跫爱愌跎?，依靠光合作用的能量自給自足。而生物膜形成菌群豐度則隨著年限的增加先降低后增加，也歸因于變形菌門(mén)的貢獻(xiàn)，因?yàn)樽冃尉T(mén)大多數(shù)具有脂多糖組成的外膜。細(xì)菌生物膜的形成可以作為一種保護(hù)性機(jī)制，所以生長(zhǎng)在這些基質(zhì)封閉聚集物中的微生物對(duì)環(huán)境改變和宿主防御具有更強(qiáng)的耐受性。這說(shuō)明茬口次數(shù)越多，含有生物膜形成基因的菌門(mén)豐度會(huì)逐漸提高，其中包括變形菌門(mén)，該類包含致病性菌較多，會(huì)對(duì)北沙參健康生長(zhǎng)產(chǎn)生潛在不利影響。隨著茬口次數(shù)增加革蘭氏陰性菌升高，革蘭氏陽(yáng)性菌降低。研究表明，酸桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)類屬于革蘭氏陰性菌，但一般不表達(dá)致病性。而所有的變形菌門(mén)不僅隸屬于革蘭氏陰性菌，且是細(xì)菌中最大的一門(mén)，按照rRNA序列被分為α、β、γ、δ和ε這5綱。β-變形菌包括很多好氧或兼性細(xì)菌，通常其降解能力可變，致病菌種較多，就大大增加了相關(guān)的各種病菌發(fā)生的復(fù)雜性。根據(jù)CS根際土壤中變形菌門(mén)相對(duì)豐度最高這一結(jié)果，預(yù)測(cè)隨著連作次數(shù)增多β-變形菌含致病菌種會(huì)增多，進(jìn)而導(dǎo)致變形菌門(mén)相對(duì)豐度變大。耐受菌大部分屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，而致病菌多屬于革蘭氏陰性菌，一般認(rèn)為酸桿菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)不具有致病性，所以推測(cè)北沙參潛在致病菌來(lái)源于變形菌門(mén)。研究表明，土壤中致病菌豐度較高導(dǎo)致作物發(fā)病，分泌的有毒有害物質(zhì)會(huì)造成植株矮黃、生長(zhǎng)不良、根系分叉多等不良影響，最終導(dǎo)致作物減產(chǎn)^［33］。

本研究通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序研究了北沙參連作土壤細(xì)菌組成成分、多樣性和群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，北沙參連作顯著影響了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性隨茬口次數(shù)增多而增多；變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和放線菌門(mén)是北沙參種植土壤中的主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，連作對(duì)3種菌門(mén)影響顯著。北沙參連作對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，但對(duì)細(xì)菌主要種類的影響規(guī)律與其他作物研究結(jié)果有所區(qū)別，因此，需要進(jìn)一步從更長(zhǎng)連作周期和多樣本開(kāi)展北沙參連作對(duì)土壤微生物群落及北沙參生長(zhǎng)發(fā)育影響的研究，以探明北沙參連作障礙發(fā)生機(jī)制。

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