甘肅臨洮縣馬鈴薯瘡痂病致病鏈霉菌的分離鑒定及致病性

摘要：為給甘肅馬鈴薯瘡痂病病的診斷和防治提供研究依據(jù)，從甘肅臨洮縣采集馬鈴薯種植區(qū)病薯根際土壤，利用稀釋涂布分離法分離馬鈴薯瘡痂病病原菌菌株，并檢測(cè)致病基因txtAB、nec1、tomA，結(jié)合小蘿卜幼苗法和小薯片法測(cè)定菌株的致病性；通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特性及16S rDNA序列進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，菌株DW1、DW2、DY4、DY6菌株含有致病基因；其中菌株DW1、DW2、DY4能使小薯片表面變褐，壞死；DW2、DY4、DY6能明顯抑制蘿卜幼苗生長(zhǎng)。其中，菌株DY4同時(shí)具有nec1、tomA等2種致病基因，其余菌株只具有nec1致病基因。經(jīng)16S rDNA 序列分析，菌株DW1為Streptomyces nigra，菌株DW2為S.albogriseolus，菌株DY4為S.scabiei，菌株DY6為S.europaeiscabiei。其中，菌株S.nigra、S.albogriseolus，均為首次報(bào)道具有馬鈴薯瘡痂病致病性的鏈霉菌。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯瘡痂病病原菌；分離鑒定；致病基因；致病性；生物學(xué)特性

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.32" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）19-0158-07

收稿日期：2023-10-26

基金項(xiàng)目：新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新重點(diǎn)培育專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：Xjkcpy-202203）；新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目任務(wù)專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：2022B02044-2）。

作者簡(jiǎn)介：郭 瑞（1999—），女，甘肅酒泉人，碩士研究生，從事馬鈴薯瘡痂病致病鏈霉菌分離鑒定及代謝產(chǎn)物活性研究。E-mail：1522017534@qq.com。

通信作者：宋素琴，研究員，從事微生物活性產(chǎn)物及作物病害研究，E-mail：suqin_song@163.com；許建軍，博士，教授，從事為農(nóng)作物及林果病害蟲(chóng)綜合防控研究，E-mail：xjj72@163.com。

馬鈴薯瘡痂?。╬otato common scab）是由放線菌目鏈霉菌屬的致病鏈霉菌（Streptomyces spp.）通過(guò)皮孔或馬鈴薯表面開(kāi)放性傷口侵染馬鈴薯塊莖引起的土傳病害。馬鈴薯被侵染后，塊莖表面形成木質(zhì)化痂狀病斑；發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，影響馬鈴薯外觀，降低薯塊質(zhì)量和商品價(jià)值^［1-2］。隨著馬鈴薯種植面積的逐年增加，馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生也日益增多，已成為馬鈴薯瘡痂病的主要病害之一。甘肅省作為我國(guó)馬鈴薯主要種植區(qū)之一，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)也在全省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)占據(jù)主要地位；馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生率達(dá)到30%，嚴(yán)重危害馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展^［3-4］。

目前，全球已報(bào)道30多種馬鈴薯瘡痂病致病菌種類(lèi)，主要致病菌有酸性鏈霉菌（S .acidiscabies）、歐式鏈霉菌（S.europaeiscabiei）、瘡痂鏈霉菌（S.scabies）、加利利鏈霉菌（S.galilaeus）^［5-7］。其中，我國(guó)已報(bào)道的致病瘡痂鏈霉菌病原共有18種，常見(jiàn)的3種病原為瘡痂鏈霉菌、酸性鏈霉菌、腫痂鏈霉菌（S.turgidiscabies）^［8］。在致病鏈霉菌中，相關(guān)致病基因聚集在染色體同一區(qū)域，該區(qū)域被稱(chēng)為致病島（pathogenicity island，PAI），PAI由2個(gè)部分組成，第一部分是毒素合成基因，包括txtA、txtB、txtC等；第二部分包括nec1誘導(dǎo)壞死蛋白基因、tomA致病性因子基因和多種與毒力相關(guān)基因^［9］。由于致病島可以水平轉(zhuǎn)移到鏈霉菌屬的其他種中，從而不斷產(chǎn)生新的致病種^［10］，為馬鈴薯瘡痂病的防治增添了難度。甘肅省臨洮縣地處隴西盆地西緣，臨洮縣地形南北狹長(zhǎng)，地勢(shì)由東南向西北傾斜，境內(nèi)以黃土地貌為主，屬溫帶大陸性氣候。目前，在甘肅省馬鈴薯種植區(qū)中已分離鑒定馬鈴薯瘡痂病的病原菌為瘡痂鏈霉菌、加利利鏈霉菌等（表1）^［11-14］。本試驗(yàn)臨洮縣馬鈴薯瘡痂病致病鏈霉菌進(jìn)行分離鑒定及生物學(xué)特性研究，為豐富我國(guó)馬鈴薯瘡痂病原菌種類(lèi)及該病害防治研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試馬鈴薯瘡痂病病薯塊莖和根際土壤于2022年8月采自甘肅臨洮縣。對(duì)照菌株S.scabies YN由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。本試驗(yàn)于2023年3月在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所進(jìn)行。

分離培養(yǎng)基為燕麥麩皮固體培養(yǎng)基（OMA）：燕麥麩皮20 g、瓊脂15 g和去離子水1 L；高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基（G1）：可溶性淀粉20.0 g，K₂HPO₃ 0.5 g，KNO₃ 1.0 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，瓊脂粉20.0 g，去離子水 1 000 mL；ISP2固體培養(yǎng)基：酵母浸粉4.0 g，麥芽浸粉10.0 g，葡萄糖4.0 g，瓊脂粉20 g，去離子水 1 000 mL；ISP4固體培養(yǎng)基：可溶性淀粉10.0 g，K₂HPO₃ 1.0 g，MgSO₄·7H₂O 1.0 g，NaCl 1.0 g，（NH₄）₂SO₄ 2.0 g，CaSO₄ 2.0 g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.001 g，MnCl₂ 0.001 g，ZnSO₄·7H₂O 0.001 g瓊脂粉 15.0 g，去離子水1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離純化

將采集的馬鈴薯瘡痂病發(fā)病地塊土壤于自然條件下風(fēng)干，用無(wú)菌研缽研細(xì)，利用稀釋涂布法稱(chēng)取1 g根際土壤，加9 mL無(wú)菌水，渦旋混勻，靜置30 min后進(jìn)行10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍梯度稀釋。取80 μL混懸液，分別涂布于OMA、G1、ISP2及ISP4培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d。挑取單菌落在高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基上純化并編號(hào)，純化菌株轉(zhuǎn)接斜面置于４ ℃冰箱保存。

1.2.2 病原菌的致病基因測(cè)定

據(jù)報(bào)道，馬鈴薯瘡痂病致病菌都含有致病基因，包括Thaxtomins毒素合成基因txtAB、壞死基因nec1以及番茄紅素酶tomA，病原菌是否含有致病基因是檢測(cè)該菌是否具有致病性的指標(biāo)^［14］。用PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)鏈霉菌中是否含有3種致病基因。以對(duì)照菌株S. scabies YN為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)txtAB、nec1、tomA基因進(jìn)行檢測(cè)。致病基因檢測(cè)PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2，引物序列如表3所示，擴(kuò)增條件如表4所示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)^［15］。

1.2.3 病原菌的致病性測(cè)定

利用小薯片法、蘿卜幼苗法^［19-20］測(cè)定含有致病基因的鏈霉菌株的致病性。

1.2.3.1 小薯片法 將分離得到的含有致病基因的菌株接種至G1平板中，30 ℃培養(yǎng)7 d；選擇健康的馬鈴薯和青蘿卜，使用75%乙醇進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌水沖洗干凈；之后用無(wú)菌打孔器在塊莖上打孔，無(wú)菌手術(shù)刀切成厚度一致的薯片，放置于含有滅菌濾紙片的培養(yǎng)皿中放入4片/皿；用打孔器在致病基因菌株平板中打孔，將菌餅倒置放置在小薯片中央，以未接菌的培養(yǎng)基為對(duì)照；30 ℃恒溫培養(yǎng) 7 d，觀察小薯片是否褐變壞死。

1.2.3.2 蘿卜幼苗法 將含有致病基因的菌株接種至放線菌液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng) 7 d；用75%無(wú)水乙醇對(duì)蘿卜種子表面消毒，再用無(wú)菌水連續(xù)沖洗3次，晾干；將晾干的種子放置于含有濕潤(rùn)無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行催芽；選取長(zhǎng)勢(shì)一致的種子分裝到含有1%水瓊脂的試管中，放入 3 粒/支；將培養(yǎng)好的菌液200 μL 接種至試管中，以接種無(wú)菌液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次；將試管放置于光照培養(yǎng)箱間歇培養(yǎng)，7 d后觀察并測(cè)量蘿卜幼苗根長(zhǎng)。

1.2.4 病原菌的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性

病原菌形態(tài)特征觀察：挑取G1平板上生長(zhǎng)7 d的鏈霉菌單菌落并置于載玻片上，40倍目光學(xué)顯微鏡下觀察鏈霉菌孢子形態(tài)特征。根據(jù)國(guó)際鏈霉菌計(jì)劃（ISP）方法，進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.5 16S rDNA序列分析

菌株基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)［21］中的方法進(jìn)行。采用16S rDNA通用引物（通用引物27F、1492R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為 30 μL：15 μL Mix，2 μL模板，ddH₂O 11 μL，上下游引物各1 μL，PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)定。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上比對(duì)，利用MTGA 11.0構(gòu)建發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯瘡痂病病原菌的分離

馬鈴薯根際土壤中共分離純化得到23株放線菌，對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行初步歸類(lèi)并編號(hào)。

2.2 馬鈴薯瘡痂病病原的致病性測(cè)定

2.2.1 病原菌的致病基因PCR檢測(cè)

根據(jù)致病基因測(cè)定方法，對(duì)篩選得到的鏈霉菌進(jìn)行致病基因檢測(cè)，結(jié)果（圖1）表明，4株鏈霉菌具有致病基因，其中1株具有tomA基因，3株具有nec1基因，DY4同時(shí)具有tomA和nec1等2種致病基因。

2.2.2 病原菌的致病性檢測(cè)

蘿卜幼苗法表明，DW2、DY4、DY6均可以抑制蘿卜幼苗的生長(zhǎng)，抑制率達(dá)到69.76%、57.58%、63.46%（表5、圖2）。與空白對(duì)照相比，含有致病基因菌懸液處理的蘿卜幼苗根系長(zhǎng)度明顯縮短，并且出現(xiàn)小部分的皺縮壞死。

同時(shí)，采用小薯片法和蘿卜片法對(duì)含有致病基因的6株菌株進(jìn)行致病性測(cè)定（圖3），處理7 d后觀察到小薯片、蘿卜片。結(jié)果表明，DW1、DW2、DY4菌株處理的小薯片變軟，表面出現(xiàn)褐色病斑并且有明顯凹陷，與陽(yáng)性對(duì)照表現(xiàn)相似；DW2、DY4、DY6菌株處理的小蘿卜片表明出現(xiàn)黑色病斑，小蘿卜片出現(xiàn)變干壞死，與陽(yáng)性對(duì)照表現(xiàn)相似；而對(duì)照的小薯片和蘿卜片無(wú)變化（圖3）。

2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)描述

菌株DW1、DW2、DY4、DY6在G1平板上形態(tài)特征如圖4所示。DW1菌落呈灰白色，邊緣稍有褶皺突起，呈同心圓狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，孢子呈灰白色，孢子鏈呈直柔曲狀（圖4-A）；DW2菌落呈灰白色，中心凸起，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，孢子呈灰色，孢子鏈呈波曲狀（圖4-B）；DY4菌落呈黃色，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，孢子呈白色，孢子鏈較直（圖4-C）；DY6菌落呈淡黃色，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，孢子呈白色，孢子鏈簇生分支（圖4-D）。

2.3.2 病原菌生物學(xué)特性的測(cè)定

對(duì)分離得到的含有致病基因的菌株進(jìn)行生物學(xué)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。所有菌株均能以D-葡萄糖、D-甘露醇、蔗糖、α-乳糖、棉子糖、肌醇為單一碳源，但DY4、DY6不能利用木糖；菌株DW1、DW2以賴(lài)氨酸、脯氨酸、組氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、天門(mén)冬酰胺、L-賴(lài)氨酸為單一氮源，菌株DY6不能利用甲硫氨酸和組氨酸；所有菌株在10％ NaCl培養(yǎng)基中均無(wú)法生長(zhǎng)；DY6可以產(chǎn)生H₂S；DY4、DY6可以產(chǎn)生黑色素；DW1、DW2、DY6可以產(chǎn)生纖維素酶；DW1、DW2、DY4可以產(chǎn)生脂肪酶；4株菌株對(duì)結(jié)晶紫、0.1%苯酚敏感，均可耐受10 IU/mL青霉素，DY4菌株對(duì)鏈霉素敏感。

2.3.3 病原菌的16S rDNA序列分析

對(duì)分離到的、含致病基因的菌株進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，使用細(xì)菌通用引物27F、1492R得到1 500 bp基因片段（圖5），送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序；將16S rDNA序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖6）。結(jié)果表明，菌株DW1與灰黑鏈霉菌（S.nigra）（MG572975.1：106-1366）的親緣關(guān)系最近，相似率為100%；菌株DW2與S.albogriseolus（MT229141.1：55-1388）的親緣關(guān)系最近，相似率為100%；菌株DY4與瘡痂鏈霉菌（S.scabiei）（OM909117.1：20-1372）的親緣關(guān)系最近，相似率為99.93%，菌株DY6與歐式鏈霉菌（S.europaeiscabiei）（OK448161.1：21-1377）的親緣關(guān)系最近，相似率為100%。

3 討論

瘡痂鏈霉菌通過(guò)侵染使馬鈴薯塊莖表面出現(xiàn)褐色痂狀病斑，通過(guò)土壤和種薯傳播及感病馬鈴薯跨區(qū)域售賣(mài)而廣泛傳播。馬鈴薯瘡痂病原菌的致病基因主要集中在其致病島（PAI）上^［16］，致病基因島可以在不同鏈霉菌中轉(zhuǎn)移^［21-22］，從而不斷產(chǎn)生新的致病鏈霉菌，因此不斷有馬鈴薯瘡痂病新致病菌出現(xiàn)，為進(jìn)行馬鈴薯瘡痂病致病菌、致病基因及防治的研究提供依據(jù)。

本研究對(duì)甘肅省臨洮馬鈴薯種植區(qū)瘡痂病致病鏈霉菌進(jìn)行分離篩選并進(jìn)行生物學(xué)特性和16S rDNA序列分析，結(jié)果分離篩選得到4株致病菌株，并鑒定為S.nigra、S.albogriseolus、S.scabiei、S.europaeiscabiei，其中S.nigra、S.albogriseolus為首次報(bào)道含有馬鈴薯瘡痂病致病基因的鏈霉菌。S.scabiei含有tomA和nec1等2種致病基因，其他3株菌只含有tomA基因，這驗(yàn)證了致病島可以在鏈霉菌之間轉(zhuǎn)移^{［11，23-24］}；4株菌株均具有致病性，使小薯片或小蘿卜片產(chǎn)生明顯的病斑，或具有小蘿卜幼苗抑制作用，這證明即使不含有全部3個(gè)致病基因，也具有致病性，這與之前報(bào)道的內(nèi)容^{［18，24］}相符。PAI可轉(zhuǎn)移這一特性加大了馬鈴薯瘡痂病的防治難度，同時(shí)馬鈴薯瘡痂病新致病鏈霉菌的發(fā)現(xiàn)為不同地區(qū)馬鈴薯瘡痂病的系統(tǒng)研究及其防治提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究對(duì)甘肅臨洮縣馬鈴薯種植地根際土壤進(jìn)行分離，并通過(guò)致病基因PCR以及致病性試驗(yàn)篩選得到4株具有致病性的鏈霉菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)及 16S rDNA 序列同源性分析，初步鑒定4株菌株為S.nigra、S.albogriseolus、S.scabiei和S.europaeiscabiei，其中S.nigra、S.albogriseolus為首次報(bào)道的馬鈴薯瘡痂病致病鏈霉菌；S.scabiei DY4菌株含有tomA和nec1等2種致病基因，可以使小薯片出現(xiàn)黑色病斑，小蘿卜片變干壞死，同時(shí)對(duì)小蘿卜幼苗具有明顯的抑制作用；其他3株菌只含有nec1致病基因，且菌株S.albogriseolus DW2對(duì)小蘿卜幼苗的抑制效果最明顯，抑制率達(dá)到69.76%。生物學(xué)特性顯示，菌株S.nigra DW1、S.albogriseolus DW2能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、蔗糖等6種碳源，菌株S.scabiei DY4、S.europaeiscabiei DY6不能利用木糖；除菌株S.europaeiscabiei DY6外，其他菌株均可以利用賴(lài)氨酸、脯氨酸、組氨酸等6種氮源，菌株S.europaeiscabiei DY6不能利用甲硫氨酸和組氨酸，但可以產(chǎn)生H₂S；所有菌株在含10％的NaCl培養(yǎng)基中均無(wú)法生長(zhǎng)；S.scabiei DY4、S.europaeiscabiei DY6可以產(chǎn)生黑色素；S.nigra DW1、S.albogriseolus DW2、S.europaeiscabiei DY6可以產(chǎn)生纖維素酶；S.nigra DW1、S.albogriseolus DW2、S.scabiei DY4可以產(chǎn)生脂肪酶；4株菌株對(duì)結(jié)晶紫、0.1%苯酚敏感，均可耐受10 IU/mL青霉素。

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