加州鱸維氏氣單胞菌拮抗菌的篩選

基金項(xiàng)目 湖北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目[（2023）-2]。

作者簡(jiǎn)介 安相茹（1998—），女，河南洛陽(yáng)人，碩士研究生，從事漁業(yè)發(fā)展研究。

通信作者 蘇應(yīng)兵（1978—），男，湖北荊州人，碩士，副教授，從事水產(chǎn)動(dòng)物病害防治研究。

收稿日期 2024-03-13

摘要 為篩選出對(duì)維氏氣單胞菌（Aeromonas Veronii）有拮抗效果的最優(yōu)菌株，本試驗(yàn)從湖北荊州太湖加州鱸池塘底泥中分離獲得一株細(xì)菌C2-1，對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序，并研究其生防作用機(jī)制。結(jié)果表明，細(xì)菌C2-1為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），具有廣譜抑菌性，對(duì)希瓦氏菌（Shiva's bacteria）、溶血鏈球菌（Streptococcus hemolysis）等多種水產(chǎn)病原菌的抑菌直徑達(dá)18.57～25.28 mm。菌株C2-1具有較高的酸堿穩(wěn)定性且對(duì)溫度適應(yīng)范圍較為廣泛。掃描電子顯微鏡鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)菌C2-1的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)維氏氣單胞菌具有破壞效果。液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）分析該細(xì)菌包含多種不同的脂肽類活性物質(zhì)，如伊枯草菌素等。研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌C2-1是防治維氏氣單胞菌的潛力菌株，對(duì)維氏氣單胞菌具有較好的抑制作用，且應(yīng)用前景良好。

關(guān)鍵詞 維氏氣單胞菌；貝萊斯芽孢桿菌；加州鱸；生物防治

中圖分類號(hào) S947.9"" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-7731（2024）13-0042-07

Screening of antagonistic bacteria against Aeromonas veronii in Micropterus salmoides

AN Xiangru1""" SU Yingbing1""" ZHOU Yi2

（1College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou 434000， China;

2College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou 434000， China）

Abstract In order to select the best antagonistic strain against Aeromonas Veronii， a strain of bacteria C2-1 was isolated from the bottom mud of perch ponds in Tai Lake， Jingzhou， and whole genome sequencing， the biological control mechanism was studied. The results showed that the bacterial C2-1 was found to be Bacillus velezensis， with broad-spectrum antibacterial activity. Its antibacterial diameter against various aquatic pathogens such as Shiva's bacteria and Streptococcus hemolysis ranged from 18.57 to 25.28 mm. The antibacterial substances of strain C2-1 had high acid-base stability and a wide range of temperature adaptation. Electron microscopy revealed that the fermentation products of bacterial C2-1 had a destructive effect on Aeromonas veronii. LC-MS analysis showed that the bacterium contains various lipopeptide active substances， such as imidacloprid. It was found that Bacillus velezensis C2-1 was a potential strain for the control of Aeromonas veronii and had good inhibition effect on Aeromonas veronii.

Keywords Aeromonas veronii; Bacillus velezensis; Micropterus salmoides; biological control

水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量每年穩(wěn)步增長(zhǎng)，捕撈生產(chǎn)量保持相對(duì)穩(wěn)定[1]，并能在有限的空間內(nèi)生產(chǎn)大量產(chǎn)品，克服了捕獲野生物種的相關(guān)限制[2]。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要組成部分[3-4]，在一定程度上滿足了人們對(duì)海產(chǎn)品可食用蛋白質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)素日益增長(zhǎng)的需求。海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖在經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[5]。水產(chǎn)養(yǎng)殖是較大的動(dòng)物生產(chǎn)部門之一，消費(fèi)魚類中超過50%的魚來(lái)自水產(chǎn)養(yǎng)殖[6]。為了滿足日益增長(zhǎng)的消費(fèi)需求，水產(chǎn)養(yǎng)殖逐漸向集約化養(yǎng)殖轉(zhuǎn)變，這在一定程度上可能增加漁業(yè)傳染病傳播風(fēng)險(xiǎn)[7]。部分水產(chǎn)養(yǎng)殖中可能存在過量使用抗生素防治水產(chǎn)疾病的現(xiàn)象，如在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境和產(chǎn)品中能檢測(cè)到部分抗藥性基因（ARGs）和抗藥性細(xì)菌[8-9]，抗生素的使用對(duì)水生微生物種群產(chǎn)生較大選擇壓力[10]，可能對(duì)動(dòng)物和人類健康以及生態(tài)安全造成風(fēng)險(xiǎn)[11]。

加州鱸（Micropterus salmoides）是重要的食用魚類之一，其肉味鮮美，肉質(zhì)細(xì)嫩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。為滿足市場(chǎng)需求，加州鱸的人工養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，規(guī)?；B(yǎng)殖在一定程度上增加了加州鱸細(xì)菌性疾病的發(fā)生概率。常見病原體有維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophial）和溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）等。為了控制水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)所面臨的疾病，采取了各種措施。其中，芽孢桿菌是應(yīng)用較廣泛的益生菌之一，被認(rèn)為是部分魚類腸道微生物區(qū)系中的天然成員。芽孢桿菌廣泛存在于陸地環(huán)境、水生環(huán)境和大氣環(huán)境中。貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是革蘭氏陽(yáng)性好氧菌，菌體呈桿狀，能形成芽孢，廣泛分布于自然界的水體、泥土和動(dòng)物腸道[12]；與普通生防芽孢桿菌相似，貝萊斯芽孢桿菌具有溶菌、拮抗和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性等作用[13]。張德鋒等[12]、Zhang等[14]認(rèn)為，通過拮抗、競(jìng)爭(zhēng)作用和誘導(dǎo)系統(tǒng)耐藥來(lái)抑制病原菌，其中拮抗活性主要依賴于其產(chǎn)生的各種次生代謝物[15]，包括脂肽、聚酮和細(xì)菌素等，對(duì)水生動(dòng)物疾病表現(xiàn)出良好的生物防治效果。貝萊斯芽孢桿菌表現(xiàn)出廣譜抗菌活性，是各種動(dòng)植物疾病的重要生防劑[16]。例如，貝萊斯芽孢桿菌對(duì)馬鈴薯赤霉病[17]、蓮根腐病[18]和小麥赤霉病[19]等植物病害，以及對(duì)嗜水氣單胞菌引起的鯽魚[20]、無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）引起的尼羅羅非魚[21]、哈維弧菌（Vibrio harveyi）引起的雜交石斑魚[22]和嗜水氣單胞菌引起的草魚[23]等感染，均有明顯生防效果。其中，貝萊斯芽孢桿菌FZB42菌株主要用于防治根際細(xì)菌和促進(jìn)植物生長(zhǎng)[16]。

本試驗(yàn)從太湖鱸養(yǎng)殖池塘底泥中共分離出8株生防菌分離物，篩選出對(duì)維氏氣單胞菌表現(xiàn)抑菌活性的菌株C2-1，對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序，并研究其生防作用機(jī)制，為防治水生動(dòng)物疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株" 病原菌來(lái)自長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院已分離鑒定的維氏氣單胞菌（登錄號(hào)QQ781151），拮抗菌從湖北荊州太湖加州鱸養(yǎng)殖池塘底泥中分離。

1.1.2 培養(yǎng)基" 采用LB液體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑及儀器" PCR產(chǎn)物純化試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自深圳華大基因股份有限公司；掃描電子顯微鏡（VEGA3 SBU），超高效液相色譜儀購(gòu)自Eppendorf AG；電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗菌的初篩和復(fù)篩" 采用打孔法進(jìn)行初篩，將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的維氏氣單胞菌無(wú)菌濾液80 μL涂于LB固體培養(yǎng)基上，干燥后用打孔器在同一平皿上等距離打4個(gè)孔，吸取從底泥中分離的菌株菌液50 μL加入孔中，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，記錄抑菌直徑，同時(shí)對(duì)有抑菌圈的分離菌株采用初篩的方法進(jìn)行復(fù)篩；拮抗菌的抑菌譜，同樣以初篩的方法處理所有的病原菌。

1.2.2 拮抗菌株的形態(tài)觀察和分子鑒定" （1）形態(tài)觀察。將菌株C2-1劃線于LB瓊脂平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察其形態(tài)、濕潤(rùn)度等，并挑取單菌落，經(jīng)革蘭氏染色后使用顯微鏡觀察菌體。（2）分子鑒定。按照Omega細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的步驟操作。將獲得的拮抗菌DNA作為模板，采用27F和1492R引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物測(cè)序后使用BLAST進(jìn)行比對(duì)分析，利用MEGAX構(gòu)建發(fā)育樹。

1.2.3 拮抗菌株對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用觀察" 通過掃描電子顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)。樣品制備方法參考李川北等[24]的方法。

1.2.4 拮抗菌發(fā)酵液耐酸堿性及最適溫度測(cè)定" （1）菌株C2-1耐酸堿性測(cè)定。將拮抗菌在28 °C、130 r/min下培養(yǎng)2 d，收集上清液并于4 °C、10 000 r/min下離心20 min。離心后取上清液，經(jīng)微孔過濾器（0.22 μm孔徑）過濾獲得C2-1無(wú)菌濾液，取無(wú)菌濾液按不同pH梯度處理1 h后，調(diào)整pH值為7.0，測(cè)定發(fā)酵上清液的拮抗活性。

（2）菌株C2-1最適溫度測(cè)定。將拮抗菌按（1）中方法處理后，取無(wú)菌濾液分別于30、40、60、80、90和100 ℃恒溫水浴1 h后，測(cè)定無(wú)菌濾液的拮抗活性。

1.2.5 菌株C2-1抑菌物質(zhì)提取及抑菌活性測(cè)定" 抑菌物質(zhì)提取和色譜分析參考鄭通文[15]的方法。

1.2.6 拮抗菌株對(duì)加州鱸的保護(hù)性評(píng)價(jià)" 拮抗菌株C2-1和病原菌維氏氣單胞菌分別設(shè)置106、107和108 CFU/mL濃度梯度。分為3個(gè)處理組，1個(gè)空白對(duì)照組。第一組腹腔注射100 μL（106、107和108 CFU/mL拮抗菌菌液）+100 μL（106、107和108 CFU/mL病原菌菌液）的混合液；第二組注射100 μL（106、107和108 CFU/mL 拮抗菌菌液）+100 μL（LB）；第三組注射100 μL（106、107和108 CFU/mL病原菌菌液）+100 μL（LB），連續(xù)7 d觀察并記錄加州鱸的狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離和篩選

通過對(duì)池塘底泥中的多株細(xì)菌進(jìn)行初次篩選和再次篩選，發(fā)現(xiàn)一株對(duì)維氏氣單胞菌具有明顯抑菌效果的菌株，命名為C2-1。圖1為C2-1株菌的初篩和復(fù)篩結(jié)果，其抑菌直徑分別為（24.32±0.40） mm和（25.28±0.56） mm。

2.2 菌株C2-1的抑菌譜

菌株C2-1對(duì)多種病原菌均有拮抗效果，C2-1對(duì)維氏氣單胞菌抑菌圈直徑達(dá)（25.28±0.56）mm，對(duì)愛德華氏菌（Edwardsiella）抑菌圈直徑達(dá)（20.11±0.17）mm，對(duì)希瓦氏菌（Shiva's bacteria）抑菌圈直徑達(dá)（21.53±0.21）mm，對(duì)溶血鏈球菌（Streptococcus hemolysis）抑菌圈直徑達(dá)（23.74±0.26）mm，對(duì)嗜水氣單胞菌抑菌圈直徑達(dá)（16.02±0.12）mm，對(duì)金葡萄球菌（Staphylococcus aureus）抑菌圈直徑達(dá)（18.57±0.15）mm。抑菌效果如表1所示。

2.3 菌株C2-1的形態(tài)觀察和分子鑒定

2.3.1 形態(tài)鑒定" C2-1菌株在LB培養(yǎng)基上的菌落較濕潤(rùn)，呈不透明且具有黏性（圖2A），其形狀接近圓形，表面粗糙并帶有凸起。顯微鏡下觀察菌株呈短桿狀（圖2B）。通過革蘭氏染色觀察，確認(rèn)該菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌。

2.3.2 分子鑒定" 將菌株C2-1測(cè)序序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株C2-1與貝萊斯芽孢桿菌相似性達(dá)到98.88%。通過構(gòu)建發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)C2-1與貝萊斯芽孢桿菌歸為一支（圖3），故將C2-1鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），登錄號(hào)為OR574410。

2.4 菌株C2-1對(duì)維氏氣單胞菌絲生長(zhǎng)抑制作用

通過掃描電鏡觀察菌絲特征（圖4）發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組菌絲體飽滿，而菌株C2-1處理組菌絲體側(cè)端呈現(xiàn)球狀褶皺，處理后菌絲扭曲且凹陷。

2.5 菌株C2-1耐酸堿性和最適溫度測(cè)定

溫度升高時(shí)，菌株C2-1發(fā)酵上清液的抑菌活性出現(xiàn)明顯變化。在60 ℃以下，抑菌活性保持較高水平，高于60 ℃時(shí)，抑菌活性有所下降。C2-1在pH中性情況下抑菌效果最佳，隨pH值的升高或降低其抑菌活性均下降。測(cè)定結(jié)果如表2所示。

2.6 菌株C2-1抑菌物質(zhì)的提取

液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析結(jié)果顯示，C2-1的抑菌物質(zhì)中包含多種有機(jī)化合物。匹配度高的有表面活性素、伊枯草菌素、草菌素、桿菌霉素、多黏菌素B1和多黏菌素B2等。由表3可知，表面活性素的質(zhì)荷比為1"036.674"3，其出峰時(shí)間位于26.93～26.95"min。伊枯草菌素的分子質(zhì)量的質(zhì)荷比為1"044.536"0，出峰時(shí)間位于21.80～21.81"min。草菌素的出峰時(shí)間在21.82～21.83"min，分子質(zhì)荷比為1"199.641"9；桿菌霉素的出峰時(shí)間在30.33～30.34"min，分子質(zhì)荷比為1"032.524"8；多黏菌素B1的出峰時(shí)間在28.60～28.76"min，分子質(zhì)荷比為1"203.757"2；多黏菌素B2的出峰時(shí)間在21.77～21.81"min，分子質(zhì)荷比為1"189.741"6。

2.7 菌株C2-1對(duì)加州鱸的保護(hù)性評(píng)價(jià)

2.7.1 菌株C2-1的拮抗性檢驗(yàn)" 腹腔注入100 μL（106、107和108 CFU/mL 的拮抗菌菌液）+100 μL（106、107和108 CFU/mL的維氏氣單胞菌液）的混合液，加州鱸死亡率分別為10％、20％和30%。注射100 μL（106、107和108 CFU/mL的拮抗菌菌液）+100 μL（LB）死亡率均為0。注射100 μL（106、107和108 CFU/mL的維氏氣單胞菌液）+100"μL（LB），死亡率均為100%。由表4可知，菌株C2-1對(duì)加州鱸有較好的保護(hù)作用。

2.7.2 病原菌鑒定" 解剖僅注射維氏氣單胞菌死亡的魚，從其肝臟、鰓等部位分離并純化得到的病原菌，提取病原菌DNA并測(cè)序，鑒定方法同1.2.2分子鑒定。鑒定結(jié)果顯示，病原菌與注射的維氏氣單胞菌（QQ781151）系列相似性達(dá)99.58%，即分離得到的病原菌為維氏氣單胞菌。

3 結(jié)論與討論

本研究從太湖鱸養(yǎng)殖池塘底泥中分離生防菌株，篩選得到一株對(duì)維氏氣單胞菌表現(xiàn)抑菌活性的菌株，命名為C2-1，其抑菌圈直徑達(dá)21.62～24.32 mm。菌株C2-1的抑菌物質(zhì)具有很高的酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性；掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌株C2-1的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)維氏氣單胞菌的膜結(jié)構(gòu)具有損壞效果；LC-MC分析表明菌株C2-1包含多種脂肽類化合物，如伊枯草菌素等。該研究結(jié)果與程心怡等[25]報(bào)道的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）J2-2的無(wú)菌濾液對(duì)維氏氣單胞菌的抑制作用結(jié)果相似。通過對(duì)菌株C2-1進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，該菌初步鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。掃描電鏡中拮抗菌株作用于病原菌體表面出現(xiàn)的溶解現(xiàn)象，推測(cè)是貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)如脂肽類抗生素等物質(zhì)引起[26-28]。

本試驗(yàn)從加州鱸池塘底泥中分離獲得C2-1菌株，經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，對(duì)維氏氣單胞菌有明顯抑菌作用，其直徑可達(dá)（25.28±0.56）mm，對(duì)希瓦氏菌、溶血鏈球菌等多種水產(chǎn)致病細(xì)菌也有較好的抑制效果。貝萊斯芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種脂肽類物質(zhì)，對(duì)魚類安全可靠，在加州鱸水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有較大的應(yīng)用潛力。

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（責(zé)編：何 艷）