超聲輔助復(fù)合酶法提取葉黃素及其抗氧化活性研究

摘要：文章旨在采用超聲輔助復(fù)合酶法優(yōu)化葉黃素提取工藝并考察其抗氧化活性。優(yōu)選黃玉米為原材料，主要選取酶添加量、酶解時間、酶解溫度、液料比、超聲時間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察其對黃玉米中葉黃素提取量的影響，并結(jié)合響應(yīng)面法分析優(yōu)化黃玉米中葉黃素的提取量，得出最佳工藝：酶添加量3.2%、酶解時間146 min、酶解溫度50 ℃、液料比50∶1 （mL/g）、超聲時間63 min，該條件下所得葉黃素提取量為（7 639.49±3.73） μg/g，與預(yù)測值7 641.64 μg/g接近。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，黃玉米葉黃素對DPPH·、ABTS＋·、O2-·、·OH均具有較好的清除能力，IC50值分別為0.022，0.124，1.447，1.374 mg/mL；同時具有較好的Fe3+還原能力，濃度為1.4 mg/mL時，鐵離子還原能力為1.806 mmol/L，為食品工業(yè)中葉黃素的生產(chǎn)加工及其功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供了參考。

關(guān)鍵詞：葉黃素；超聲波；復(fù)合酶法；響應(yīng)面優(yōu)化；抗氧化活性

中圖分類號：TS201.1""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號：1000-9973（2024）11-0187-08

Study on Extraction of Lutein by Ultrasonic-Assisted Compound Enzymatic

Method and Its Antioxidant Activity

MA Yong-qiang， NIU Ji-chao， YOU Ting-ting， YU Shi-you， LI Chen-chen，

WANG Xin-man， YA Han-qin， ZHAO Ruo-bing

（College of Food Engineering， Harbin University of Commerce， Harbin 150028， China）

Abstract： The aim of this paper is to optimize the extraction process of lutein by ultrasonic-assisted compound enzymatic method and investigate its antioxidant activity. Yellow corn is selected as the raw material. Single factor experiment is conducted on enzyme addition amount， enzymatic hydrolysis time， enzymatic hydrolysis temperature， liquid-solid ratio and ultrasonic time to explore their effects on the extraction amount of lutein from yellow corn.Response surface methodology is used to analyze and optimize the extraction amount of lutein from yellow corn. It is determined that the optimal process is the enzyme addition amount of 3.2%， enzymatic hydrolysis time of 146 min， enzymatic hydrolysis temperature of 50 ℃， liquid-solid ratio of 50∶1 （mL/g）， and ultrasonic time of 63 min. Under these conditions， the extraction amount of the obtained lutein is （7 639.49±3.73） μg/g， which is close to the predicted value of 7 641.64 μg/g. The results of in vitro antioxidant experiment show that lutein from yellow corn has good scavenging capacity on DPPH·， ABTS+·， O2-·，" ·OH. The IC50 values are 0.022， 0.124， 1.447， 1.374 mg/mL respectively. At the same time， it has good Fe3+ reducing power， with the iron ion reducing power of 1.806 mmol/L at the concentration of 1.4 mg/mL. This study has provided references for the production and processing of lutein， as well as the development of functional products of lutein in the food industry.

Key words： lutein; ultrasound; compound enzymatic method; response surface optimization; antioxidant activity

收稿日期：2024-05-21

基金項目：黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項目（GA20B301）

作者簡介：馬永強(qiáng)（1963—），男，教授，碩士，研究方向：食品化學(xué)。

*通信作者：尤婷婷（1989—），女，工程師，碩士，研究方向：食品生物化學(xué)。

玉米主要分為甜玉米、糯玉米、黃玉米，是種植最廣泛的禾本科玉蜀黍?qū)僦参镏弧?/p>

黃玉米味道略甘，除了含有淀粉和脂肪外，還含有多種氨基酸、微量元素和類胡蘿卜素（主要包括葉黃素、玉米黃質(zhì)等），具有多重營養(yǎng)保健功效[1]。葉黃素是一種由9個共軛雙鍵構(gòu)成的長鏈萜類化合物，早在1995年被美國FDA批準(zhǔn)作為食品補(bǔ)充劑用于食品和飲料。作為一種對人體健康有益的天然脂溶性色素，其在抗氧化[2]、保護(hù)視力[3-4]、改善認(rèn)知能力[5-6]、抗癌[7-8]等方面得到廣泛應(yīng)用。然而，葉黃素不能由人體直接合成，需要從外界食物中攝取。研究者們開發(fā)了許多方法提取葉黃素，如有機(jī)溶劑[9]、酶制劑[10]，也常利用食品加工高新技術(shù)輔助提取，如微波[11]、超聲波[12]、超臨界萃取[13]等。研究發(fā)現(xiàn)，酶法提取可促進(jìn)細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)的有效活性物質(zhì)快速釋放[14]，而超聲輔助提取所需時間較少且效率高，其超聲波高空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)能對原料進(jìn)行破碎，加速物質(zhì)溶出[15]。目前，尚沒有關(guān)于超聲輔助復(fù)合酶法提取葉黃素的相關(guān)研究，超聲輔助復(fù)合酶法同時具備兩種技術(shù)的優(yōu)勢，既快速、高效、環(huán)保，又能提高提取量。

本文采用超聲波輔助復(fù)合酶法，固定復(fù)合酶（木瓜蛋白酶、纖維素酶、果膠酶）比例為1∶1∶1提取黃玉米中的葉黃素，通過響應(yīng)面法設(shè)計優(yōu)化，并評估其對DPPH自由基、ABTS+自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基、鐵離子還原能力的抗氧化活性，為葉黃素提取加工及其功能活性的深入研究提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

黃玉米：由安徽渦陽縣惠鄉(xiāng)源特產(chǎn)門市部提供；葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥96%）：上海麥克林生化科技有限公司；果膠酶（食品級）：山東隆科特酶制劑有限公司；纖維素酶、木瓜蛋白酶（均為食品級）：南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 試劑

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、2，4，6-三（2-吡啶基）-1，3，5-三嗪（TPTZ）（均為國產(chǎn)分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、抗壞血酸、鄰苯三酚、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、醋酸鈉、三氯化鐵、鹽酸、乙酸乙酯（均為國產(chǎn)分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.3 主要儀器與設(shè)備

西廚750T型高速多功能粉碎機(jī) 永康市鉑歐五金制品有限公司；UV-5200紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FA224精密天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；YP100電子天平 上海光正醫(yī)療儀器有限公司；PHS-3E酸度計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 黃玉米中葉黃素的提取工藝

取干黃玉米粒經(jīng)粉碎機(jī)打磨成黃玉米粉，過120目篩，備用。固定復(fù)合酶比例（木瓜蛋白酶∶纖維素酶∶果膠酶為1∶1∶1），溶解，控制溫度，酶解數(shù)分鐘，滅酶（沸水浴加熱反應(yīng)）10 min，冷卻至室溫，加入助提取劑乙酸乙酯，固定超聲波功率（250 W）輔助提取后過濾，得到葉黃素粗提取液，將其稀釋并定容至一定體積，即為葉黃素提取液。

1.4.2 單因素實(shí)驗(yàn)

以酶添加量2%、酶解時間120 min、酶解溫度50 ℃、液料比20∶1 （mL/g）、超聲時間30 min和超聲功率250 W為固定參數(shù)，調(diào)整酶添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、酶解時間（60，90，120，150，180 min）、酶解溫度（35，40，45，50，55 ℃）、液料比（20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1， mL/g）、超聲時間（30，40，50，60，70 min），探究其對葉黃素提取量的影響。

1.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

選取酶添加量（A）、酶解時間（B）、液料比（C）和超聲時間（D）為4個自變量因素，以葉黃素提取量（μg/g）為響應(yīng)值，利用Box-Behnken優(yōu)化工藝條件。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

1.4.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確配制50 μg/mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用90%乙醇定容至25 mL棕色容量瓶中，于447 nm處測其吸光值。以葉黃素質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），447 nm處測定的吸光值為縱坐標(biāo)（Y），繪制葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.015 3X-0.008 4，R2=0.999 7。

1.4.5 葉黃素提取量測定

取1 mL提取液定容至10 mL容量瓶中，按照1.4.4中方法測定并根據(jù)式（1）計算葉黃素提取量。

Y=C×V×NM。（1）

式中：Y為葉黃素提取量（μg/g）；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的葉黃素質(zhì)量濃度（μg/mL）；V為葉黃素提取液體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)10；M為黃玉米粉質(zhì)量（g）。

1.4.6 黃玉米中葉黃素的抗氧化活性測定

1.4.6.1 DPPH自由基清除能力測定

參考郭磊等[16]的方法并略作修改。精密稱取DPPH粉末4 mg溶于100 mL容量瓶中，用90%乙醇定容。將10 mg/mL樣品溶液分別稀釋至0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL，各取3 mL于比色管中，加入3 mL DPPH溶液混勻，暗處放置30 min，以90%乙醇為參比，于517 nm處測其吸光值A(chǔ)1；樣品溶液與90%乙醇混合，測其吸光值A(chǔ)2；空白實(shí)驗(yàn)吸光值為A0；以相同濃度的VC溶液作為對照組，清除率按式（2）計算。

DPPH自由基清除率（%）=（1-A1-A2A0）×100%。（2）

1.4.6.2 ABTS+自由基清除能力測定

參考胡曉波[17]的方法并略作修改。將預(yù)先制備的ABTS母液用90%乙醇稀釋，調(diào)節(jié)734 nm處的吸光值至0.7±0.02，即為ABTS測定液，該測定液現(xiàn)配現(xiàn)用。將10 mg/mL樣品溶液分別稀釋至0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mg/mL，分別移取1.0 mL樣品稀釋液并加入4.0 mL ABTS測定液于比色管中混勻，暗處反應(yīng)10 min，以90%乙醇為參比，于734 nm處測定吸光值A(chǔ)1；用90%乙醇代替ABTS測定液，于734 nm處測定吸光值A(chǔ)2；用90%乙醇代替樣品液作為空白組，于734 nm處測定吸光值A(chǔ)0。以相同濃度的VC溶液作為對照組，ABTS+自由基清除率按式（3）計算。

ABTS+自由基清除率（%）=（1-A1-A2A0）×100%。（3）

1.4.6.3 超氧陰離子自由基清除能力測定

參考王靜杰等[18]的方法并略作修改。需先配制鄰苯三酚溶液（3 mmol/L）備用，將10 mg/mL樣品溶液分別稀釋至0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL，取1 mL樣品稀釋液分別加入4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）混勻，在25 ℃下反應(yīng)20 min，隨后加入0.1 mL鄰苯三酚溶液混勻，反應(yīng)5 min，立即加入HCl溶液（8 mmol/L）終止反應(yīng)，于320 nm處測定吸光值A(chǔ)1；用蒸餾水代替鄰苯三酚溶液，于320 nm處測定吸光值A(chǔ)2；用蒸餾水代替樣品液，于320 nm處測定吸光值A(chǔ)0。以相同濃度的VC溶液作為對照組，超氧陰離子自由基清除率按式（4）計算。

超氧陰離子自由基清除率（%）=（1-A1-A2A0）×100%。（4）

1.4.6.4 羥基自由基清除能力測定

參考孟繁玲等[19]的方法并略作修改。將10 mg/mL樣品溶液分別稀釋至0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mg/mL，取3 mL樣品稀釋液，依次加入10 mmol/L硫酸亞鐵溶液、10 mmol/L水楊酸溶液、100 mmol/L H2O2溶液各0.5 mL混勻，在37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)20 min，于510 nm處測定吸光值A(chǔ)1；用蒸餾水代替水楊酸溶液，于510 nm處測定吸光值A(chǔ)2；用蒸餾水代替樣品液，于510 nm處測定吸光值A(chǔ)0。以相同濃度的VC溶液作為對照組，羥基自由基清除率按式（5）計算。

羥基自由基清除率（%）=（1-A1-A2A0）×100%。（5）

1.4.6.5 鐵離子還原能力測定

參考Wang等[20]的方法并略作修改。將FRAP工作液于37 ℃恒溫水浴預(yù)熱，由0.3 mol/L pH 3.6的醋酸緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液（40 mmol/L HCl溶液定容）按10∶1∶1混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。分別取不同濃度的FeSO4稀釋液，加入FRAP工作液混合，于37 ℃恒溫水浴暗處反應(yīng)20 min。以濃度為橫坐標(biāo)（x），在波長593 nm處測定的吸光值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.978 6x+0.128 3，R2=0.997 8，線性范圍為0～1 mmol/L。分別加入1.0 mL不同濃度的樣品溶液與4.0 mL FRAP工作液混合，于37 ℃水浴暗處反應(yīng)20 min，于593 nm處測定吸光值A(chǔ)1；用無水乙醇代替樣品作為空白，于593 nm處測定吸光值A(chǔ)0；用醋酸緩沖液代替FRAP工作液，于593 nm處測定吸光值A(chǔ)2，將樣品的實(shí)際吸光值（即A1-A2-A0）換算為FeSO4的濃度值 （FRAP，mmol/L），以相同濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽性對照，同法測定其抗氧化活性。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Design-Expert V8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計；使用IBM SPSS Statistics 27.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析并計算IC50值；使用Origin 2022軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶添加量對葉黃素提取量的影響

木瓜蛋白酶、果膠酶活力的測定參考萬正洋等[21]、張飛等[22]的方法并稍作修改，所得結(jié)果分別為4×104 U/g和717 U/g，纖維素酶活力采用DNS方法[23]測定，結(jié)果為159 U/g。

由圖1可知，隨著酶添加量的增加，葉黃素提取量整體呈先上升后下降的趨勢（P＜0.05），酶添加量為3%時，葉黃素提取量為6 318 μg/g，達(dá)到最高值，而后隨著酶添加量增加至5%，葉黃素提取量顯著下降至5 606 μg/g，原因可能是酶添加量過多，促使水解產(chǎn)物破壞細(xì)胞壁，使其破裂，導(dǎo)致葉黃素擴(kuò)散受到一定限制，堵塞其主體通道，溶出受阻，從而使提取量下降[24]。因此，選擇2%、3%、4% 3個水平的酶添加量進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 酶解時間對葉黃素提取量的影響

由圖2可知，在60～150 min范圍內(nèi)，葉黃素提取量隨著酶解時間的延長呈逐漸升高的趨勢，在150 min時達(dá)到最大值，為5 855 μg/g；當(dāng)酶解時間達(dá)到180 min時，葉黃素提取量下降至5 486 μg/g，原因可能是在過短的酶解時間內(nèi)，復(fù)合酶并沒有完全破壞細(xì)胞壁，導(dǎo)致葉黃素未能被有效提??；隨著酶解時間的增加，復(fù)合酶能充分破壞細(xì)胞壁，葉黃素隨之大量釋放，提取量上升；當(dāng)酶解時間過長時，底物濃度逐漸降低，產(chǎn)物積累逐漸升高，從而對酶活性產(chǎn)生反饋抑制作用，抑制酶促反應(yīng)，導(dǎo)致葉黃素提取量逐漸減少[25]。因此，選擇酶解時間120，150，180 min 3個水平進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 酶解溫度對葉黃素提取量的影響

由圖3可知，當(dāng)酶解溫度為35～50 ℃時，葉黃素提取量隨著酶解溫度的升高呈顯著增加的趨勢（P＜0.05），且在50 ℃時達(dá)到最高值，為6 440 μg/g；當(dāng)酶解溫度為55 ℃時，葉黃素提取量降至5 464 μg/g，原因可能是當(dāng)溫度升高至最適溫度時，有助于提高酶解速率和葉黃素的擴(kuò)散能力，當(dāng)酶解溫度過高時，復(fù)合酶發(fā)生不可逆的變性，甚至失活，從而影響細(xì)胞破壁[26]。因此，選擇50 ℃作為最佳溫度。

2.1.4 液料比對葉黃素提取量的影響

由圖4可知，在液料比20∶1～50∶1范圍內(nèi)，葉黃素提取量隨著液料比的增大呈顯著上升的趨勢，當(dāng)液料比為50∶1時，葉黃素提取量為5 873 μg/g，原因可能是葉黃素在超聲波輔助作用下充分溶出；繼續(xù)增大液料比至60∶1，葉黃素提取量降低至5 288 μg/g，原因可能是原料與乙酸乙酯提取劑接觸過多，不能提高溶出速度，反而起到稀釋作用，使其提取量降低；還有可能是超聲波的能量隨著液料比的增加消耗過大，導(dǎo)致原料吸收的速率減小，提取量下降[27]。因此，選擇液料比40∶1、50∶1、60∶1 3個水平進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.1.5 超聲時間對葉黃素提取量的影響

由圖5可知，當(dāng)超聲時間為30～60 min時，葉黃素提取量顯著增加（P＜0.05），并在60 min時達(dá)到最高值6 458 μg/g；當(dāng)超聲時間延長至70 min時，葉黃素提取量下降至6 105 μg/g，原因可能是隨著超聲時間的增加，細(xì)胞壁被較完全地破壞，促使提取量上升；超聲時間過長，所引起的空化效應(yīng)和機(jī)械振動使溶出葉黃素的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，發(fā)生部分降解反應(yīng)，從而使葉黃素提取量降低[28]。因此，選擇超聲時間50，60，70 min 3個水平進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計結(jié)果

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以酶添加量（A）、酶解時間（B）、液料比（C）、超聲時間（D）作為考察因素，以葉黃素提取量（Y）作為響應(yīng)值，通過Design-Expert V8.0.6.1軟件，采用Box-Behnken方法對黃玉米中葉黃素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

2.2.2 響應(yīng)面方差分析

通過對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到的二次多項式模型回歸方程為Y=7 585.2+201.92A-147.50B-46.58C+189.33D-208.25AB+266.75AC+120.75AD+119BC-353.25BD-164CD-617.73A2-1 056.85B2-793.23C2-507.1D2。由表3可知，模型的F值為13.81，P＜0.000 1，達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），失擬項的P值為0.991 6＞0.05，不顯著，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果受所選因素的影響較大，受其他因素的影響較小，可信度高，實(shí)驗(yàn)設(shè)計可靠。R2為0.932 5（接近1），表明實(shí)測值與模型預(yù)測值的擬合程度較好；RAdj2為0.864 9，表明該模型能解釋86.49%的響應(yīng)值變化和結(jié)果；變異系數(shù)（C.V.）為4.07%＜10%，精密度為11.132＞4，表明該模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠。各影響因素中，二次項A2、B2、C2、D2的影響均極顯著（Plt;0.01），一次項A、D以及交互項BD的影響顯著（Plt;0.05），而其他一次項、交互項的影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值和P值可判斷各因素對響應(yīng)值（Y）的影響，F(xiàn)值越大、P值越小，影響越顯著；各單因素對葉黃素提取量的影響程度從大到小為酶添加量（A）＞超聲時間（D）＞酶解時間（B）＞液料比（C），各因素交互作用對葉黃素提取量的影響程度從大到小為BD＞AC＞AB＞CD＞AD＞BC。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用

響應(yīng)面能直觀反映出各因素交互作用的顯著性結(jié)果，3D響應(yīng)曲面坡度越陡峭、等高線越密集、橢圓程度越高，表明兩因素之間交互作用越顯著，反之則越不顯著。由圖6可知各因素之間的交互作用，圖6中e的等高線橢圓程度較高，表明酶解時間和超聲時間的交互作用對葉黃素提取量的影響顯著，與方差分析結(jié)果一致；而其他等高線偏圓，表明交互作用不顯著。

2.2.4 最佳工藝驗(yàn)證

根據(jù)Box-Behnken模型優(yōu)化得到的最佳工藝條件為酶添加量3.21%、酶解時間145.91 min、液料比49.68∶1 （mL/g）、超聲時間62.63 min，在該條件下，黃玉米中葉黃素提取量的理論值達(dá)到7 641.64 μg/g。為驗(yàn)證回歸模型的有效性，根據(jù)實(shí)際將工藝參數(shù)調(diào)整為酶添加量3.20%、酶解時間146 min、液料比50∶1 （mL/g）、超聲時間63 min，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證，所得的葉黃素提取量達(dá)到（7 639.49±3.73） μg/g，與預(yù)測值接近，表明模型可靠，為葉黃素提取工藝提供了參考。

3 黃玉米中葉黃素體外抗氧化活性分析

3.1 DPPH自由基清除能力

由圖7可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1～0.4 mg/mL時，VC溶液的DPPH·清除率逐漸增加（92.42%～96.59%）且具有顯著性差異（Plt;0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時DPPH·清除率達(dá)到97.06%；而黃玉米中葉黃素的DPPH·清除率在質(zhì)量濃度為0.1～0.4 mg/mL時呈上升趨勢（63.53%～74.04%），在0.5 mg/mL時DPPH·清除率達(dá)到77.3%；證明在一定范圍內(nèi)，DPPH·清除率與其濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系，由于DPPH自由基中存在單電子，與黃玉米中葉黃素發(fā)生電子配對，其紫色顏色的變化與黃玉米中葉黃素濃度呈正相關(guān)性[29]。根據(jù)數(shù)據(jù)分析，VC溶液的IC50值為0.002 mg/mL，黃玉米中葉黃素的IC50值為0.022 mg/mL，IC50值越小，表明自由基清除能力越強(qiáng)，抗氧化作用越強(qiáng)[30]，由此表明黃玉米中葉黃素的DPPH·清除能力雖弱于VC溶液，但也具有一定的抗氧化能力。

3.2 ABTS+自由基清除能力

由圖8可知，VC溶液和黃玉米中葉黃素均具有一定的清除ABTS+自由基的能力。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1～0.4 mg/mL時，VC溶液和黃玉米中葉黃素對ABTS+自由基的清除率均呈顯著上升趨勢（P＜0.05），分別為61.83%～84.48%和46.13%～73.44%；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5～0.7 mg/mL時，VC溶液對ABTS+自由基的清除率繼續(xù)上升，在0.7 mg/mL時達(dá)到最大值96.03%，而黃玉米中葉黃素對ABTS+自由基的清除率呈平緩上升趨勢（74.67%～77.49%），ABTS溶液中具有穩(wěn)定的含氮自由基，其羥基結(jié)構(gòu)會干擾自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而產(chǎn)生抗氧化作用[31-32]，雖然黃玉米中葉黃素的清除能力低于VC溶液，但其較強(qiáng)的供氫能力也能在清除反應(yīng)中發(fā)揮作用；數(shù)據(jù)分析得出，VC溶液的IC50值為0.067 mg/mL，黃玉米中葉黃素的IC50值為0.124 mg/mL，表明黃玉米中葉黃素對ABTS+自由基具有一定的清除能力，但其效果沒有VC溶液明顯。

3.3 超氧陰離子自由基清除能力

在機(jī)體內(nèi)，超氧陰離子自由基的壽命最長，一定條件下可生成羥基自由基、過氧化氫、脂質(zhì)過氧化物及單線態(tài)氧等其他活性氧，從而造成機(jī)體的氧化損傷[33]。由圖9可知，隨著質(zhì)量濃度從0.2 mg/mL增加至1.0 mg/mL，黃玉米中葉黃素的超氧陰離子自由基清除率從23.30%增加到42.95%；而VC溶液的超氧陰離子自由基清除率從49.58%增加到65.52%，優(yōu)于黃玉米中葉黃素的清除效果；數(shù)據(jù)分析得出，VC溶液的IC50值為0.267 mg/mL，黃玉米中葉黃素的IC50值為1.447 mg/mL，表明黃玉米中葉黃素對超氧陰離子自由基具有一定的清除能力，但其效果弱于VC溶液。

3.4 羥基自由基清除能力

羥基自由基作為一種活性氧自由基，可通過電子轉(zhuǎn)移、脫氫或加成等使核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子發(fā)生氧化損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死或突變[34]。由圖10可知，質(zhì)量濃度在0.2～1.4 mg/mL范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，黃玉米中葉黃素的羥基自由基清除率從14.41%增加到57.28%；而VC溶液的羥基自由基清除率從49.06%增加到85.23%，優(yōu)于黃玉米中葉黃素的清除效果；數(shù)據(jù)分析得出，VC溶液的IC50值為0.339 mg/mL，黃玉米中葉黃素的IC50值為1.374 mg/mL，表明黃玉米中葉黃素對羥基自由基也具有一定的清除能力。

3.5 鐵離子還原能力

在酸性條件下，樣品中的抗氧化物可將Fe3+-TPTZ還原成Fe2+-TPTZ，使顏色呈現(xiàn)藍(lán)色，在593 nm處表現(xiàn)出強(qiáng)吸收作用。當(dāng)體系中存在大量Fe3+-TPTZ時，F(xiàn)e2+-TPTZ的生成量可作為檢測樣品還原能力的評價指標(biāo)，即鐵離子還原能力（總抗氧化能力），F(xiàn)e3+還原能力用FRAP值衡量，F(xiàn)RAP值越大，還原能力越強(qiáng)[35]。由圖11可知，黃玉米中葉黃素在0.2～1.4 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)不同程度的還原能力，且與濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。隨著質(zhì)量濃度的增加，還原能力顯著上升，當(dāng)質(zhì)量濃度增加至1.2 mg/mL時，黃玉米中葉黃素還原能力趨于平緩狀態(tài)，最大值為1.806 mmol/L；而在相同質(zhì)量濃度下，VC溶液在1.2 mg/mL后，還原能力呈繼續(xù)上升趨勢（P＜0.05），最大值為2.108 mmol/L，總體來看，黃玉米中葉黃素的鐵離子還原能力雖低于VC溶液，但同樣也具有良好的抗氧化效果。

4 結(jié)論

本文通過超聲波輔助復(fù)合酶法提取黃玉米中的葉黃素，固定木瓜蛋白酶∶纖維素酶∶果膠酶的比例為1∶1∶1，經(jīng)酶添加量、酶解時間、酶解溫度、液料比、超聲時間的單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計，優(yōu)化黃玉米中葉黃素的提取工藝并探討其體外抗氧化活性。結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)為酶添加量3.2%、酶解時間146 min、酶解溫度50 ℃、液料比50∶1 （mL/g）、超聲時間63 min，該條件下所得葉黃素提取量為（7 639.49±3.73） μg/g，與預(yù)測值7 641.64 μg/g接近，表明通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化黃玉米中葉黃素提取工藝準(zhǔn)確可行；黃玉米中的葉黃素對DPPH·、ABTS＋·、O2-·、·OH均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，IC50值分別為0.022，0.124，1.447，1.374 mg/mL，對鐵離子的還原能力較強(qiáng)，濃度為1.4 mg/mL時，F(xiàn)RAP值為1.806 mmol/L，與VC接近。

綜上所述，超聲波輔助復(fù)合酶法能夠?qū)崿F(xiàn)提高葉黃素提取量的目的，同時，葉黃素優(yōu)良的抗氧化能力為后續(xù)的功能性研究提供了數(shù)據(jù)支撐。下一步將在葉黃素的分離純化、異構(gòu)化及構(gòu)象分析、抗氧化產(chǎn)品開發(fā)等方面予以探究。

參考文獻(xiàn)：

[1]PRASANNA B M， PALACIOS-ROJAS N， HOSSAIN F， et al.Molecular breeding for nutritionally enriched maize： status and prospects[J].Frontiers in Genetics，2020，10：1392.

[2]HAYASHI R， HAYASHI S， MACHIDA S. Changes in aqueous humor lutein levels of patients with cataracts after a 6-week course of lutein-containing antioxidant supplementation[J].Current Eye Research，2022，47（7）：1016-1023.

[3]ZHANG H J， LIU X B， CHEN X M， et al. Lutein delays photoreceptor degeneration in a mouse model of retinitis pigmentosa[J].Neural Regeneration Research，2022，17（7）：1596-1603.

[4]WILSON L M， THARMARAJAH S， JIA Y， et al. The effect of lutein/zeaxanthin intake on human macular pigment optical density： a systematic review and meta-analysis[J].Advances in Nutrition，2021，12（6）：2244-2254.

[5]LI J， ABDEL-AAL E S M. Dietary lutein and cognitive function in adults： a meta-analysis of randomized controlled trials[J].Molecules，2021，26（19）：5794.

[6]NAZARI L， KOMAKI S， SALEHI I， et al. Investigation of the protective effects of lutein on memory and learning using behavioral methods in a male rat model of Alzheimer's disease[J].Journal of Functional Foods，2022，99（3）：105319.

[7]GANSUKH E， MYA K K， JUNG M， et al. Lutein derived from marigold （Tagetes erecta） petals triggers ROS generation and activates Bax and caspase-3 mediated apoptosis of human cervical carcinoma （HeLa） cells[J].Food and Chemical Toxicology，2019，127：11-18.

[8]EOM J W， LIM J W， KIM H. Lutein induces reactive oxygen species-mediated apoptosis in gastric cancer AGS cells via NADPH oxidase activation[J].Molecules，2023，28（3）：1178.

[9]D'ESTE M， FRANCISCI D D， ANGELIDAKI I. Novel protocol for lutein extraction from microalga Chlorella vulgaris [J].Biochemical Engineering Journal，2017，127：175-179.

[10]JALALI-JIVAN M， ABBASI S， FATHI-ACHACHLOUEI B. Lutein extraction by microemulsion technique：evaluation of stability versus thermal processing and environmental stresses[J].LWT-Food Science and Technology，2021，149（16）：111839.

[11]MARY LEEMA J T， PERSIA JOTHY T， DHARANI G. Rapid green microwave assisted extraction of lutein from Chlorella sorokiniana （NIOT-2）-process optimization[J].Food Chemistry，2022，372：131151.

[12]SAINI A， PANESAR P S， BERA M B. Valuation of Citrus reticulata （kinnow） peel for the extraction of lutein using ultrasonication technique[J].Biomass Conversion and Biorefinery，2021，11（5）：2157-2165.

[13]ANTONIO M， SANJEET M， ANGELA I， et al. Extraction of astaxanthin and lutein from microalga Haematococcus pluvialis in the red phase using CO2 supercritical fluid extraction technology with ethanol as co-solvent[J].Marine Drugs，2018，16（11）：432.

[14]WEN Y， NIU M， ZHANG B J， et al. Structural characteristics and functional properties of rice bran dietary fiber modified by enzymatic and enzyme-micronization treatments[J].LWT-Food Science and Technology，2017，75：344-351.

[15]陳燊，曾紅亮，陳萬明，等.超聲微波協(xié)同提取橄欖多糖及其脫蛋白工藝的研究[J].熱帶作物學(xué)報，2015，36（8）：1484-1490.

[16]郭磊，高然，田野，等.樺褶孔菌不同溶劑萃取物抗氧化活性研究[J].西部林業(yè)科學(xué)，2020，49（2）：17-23.

[17]胡曉波.魚腥草多糖的結(jié)構(gòu)表征和抗炎活性研究[D].合肥：合肥工業(yè)大學(xué)，2021.

[18]王靜杰，杜鑫，鐘強(qiáng)，等.超聲輔助酶法制備海參性腺多糖的結(jié)構(gòu)特性及抗氧化活性[J].食品科學(xué)，2021，42（21）：97-104.

[19]孟繁玲，張宇，徐少博，等.南瓜中游離葉黃素的制備及抗氧化活性[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2020，39（8）：81-88.

[20]WANG X Y， LIU X Y， SHI N W， et al. Response surface methodology optimization and HPLC-ESI QTOF-MS/MS analysis on ultrasonic-assisted extraction of phenolic compounds from okra （Abelmoschus esculentus） and their antioxidant activity[J].Food Chemistry，2023，405（4）：134966.

[21]萬正洋，黃業(yè)傳，彭春雷，等.分子動力學(xué)模擬抗壞血酸對木瓜蛋白酶活性的影響[J].肉類研究，2023，37（1）：1-6.

[22]張飛，岳田利，費(fèi)堅，等.果膠酶活力的測定方法研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2004（4）：134-137.

[23]孫盈，田永強(qiáng)，趙麗坤.纖維素酶的CMC酶活測定條件的研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（2）：68-71，74.

[24]龍海濤，薛利新，張志霞，等.固定化混合酶提取番茄紅素的工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2014，35（4）：189-193.

[25]李彩霞，宋海，焦楊，等.果膠酶提取黑果枸杞花青素的工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2016，37（7）：204-209.

[26]王瑩，陳圓，聶倩倩，等.復(fù)合酶法輔助提取柚子皮多糖的工藝優(yōu)化[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，392（5）：86-88，91.

[27]馬萍，郭增旺，張麗媛，等.超聲微波協(xié)同提取小米糠總黃酮工藝及其抗炎活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2017，29（11）：1966-1975，1876.

[28]YUE T， SHAO D， YUAN Y， et al. Ultrasound-assisted extraction， HPLC analysis， and antioxidant activity of polyphenols from unripe apple[J].Journal of Separation Science，2015，35（16）：2138-2145.

[29]ZHANG X L， ZHANG X J， GU S S， et al. Structure analysis and antioxidant activity of polysaccharide-iron（Ⅲ） from Cordyceps militaris mycelia[J].International Journal of Biological Macromolecules，2021，179（1）：170-179.

[30]朱和權(quán)，馮進(jìn)，李春陽，等.響應(yīng)面法優(yōu)化白首烏多糖超聲輔助提取工藝及其結(jié)構(gòu)表征[J].食品工業(yè)科技，2021，42（10）：153-159.

[31]董夢依.幾種黃酮類化合物抗氧化、抗腫瘤活性研究及構(gòu)效關(guān)系初探[D].南昌：南昌大學(xué)，2019.

[32]李亞軍，易鵲，楊軍衡，等.黑老虎花總黃酮超聲輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究[J].食品工業(yè)科技，2021，42（13）：179-183.

[33]TAO H X， ZHOU J G， WU T， et al. High-throughput superoxide anion radical scavenging capacity assay[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014，62（38）：9266-9272.

[34]張昊，任發(fā)政.羥基和超氧自由基的檢測研究進(jìn)展[J].光譜學(xué)與光譜分析，2009，29（4）：1093-1099.

[35]李生茂，李倩茹，周春陽，等.益智總黃酮超聲輔助提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化及其抗氧化活性評價[J].保鮮與加工，2021，21（8）：43-49.