嗜熱鏈球菌發(fā)酵辣椒產(chǎn)胞外多糖提取、結(jié)構(gòu)特征及體外抗氧化活性研究

摘要：為解析嗜熱鏈球菌發(fā)酵二荊條辣椒后產(chǎn)胞外多糖（SR-EPS）的結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)探究其體外抗氧化活性，文章以水提醇沉法提取SR-EPS，經(jīng)Sevage法除蛋白、透析截留去雜質(zhì)后，測定了SR-EPS的基本成分，利用高效液相凝膠色譜儀、傅里葉紅外光譜儀、離子色譜儀、掃描電鏡等對SR-EPS的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步表征，同時(shí)考察了其在體外的抗氧化活性。結(jié)果表明，SR-EPS的得率為94 mg/mL，可溶性總糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸的含量分別為39.23%、0.88%、9.03%；SR-EPS由3個(gè)主要組分構(gòu)成，包含α和β兩種類型的糖苷鍵，是以甘露糖、葡萄糖和半乳糖為主的酸性雜多糖，表觀結(jié)構(gòu)為顆粒堆疊狀、緊密且有規(guī)則；SR-EPS對ABTS+·、DPPH·和羥基自由基的清除能力以及鐵離子螯合能力均以劑量為依賴。綜上，該研究可為了解乳酸菌發(fā)酵辣椒產(chǎn)胞外多糖的體外抗氧化活性提供參考，也為胞外多糖結(jié)構(gòu)有序性理論提供數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)為乳酸菌胞外多糖在功能性食品中的研發(fā)和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：嗜熱鏈球菌；辣椒；胞外多糖；結(jié)構(gòu)解析；抗氧化活性

中圖分類號：TS201.1""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號：1000-9973（2024）11-0052-07

Extraction， Structural Characteristics and in Vitro Antioxidant Activity of

Extracellular Polysaccharides from Peppers Fermented by Streptococcus thermophilus

HU Ying1， LUO Fang1， YAN Zhang-jin-bo1， ZU Jiao1， MIN Li1， JIANG Wei2*

（1.Zunyi Medical University， Zunyi 563000， China; 2.Zunyi Medical and Pharmaceutical

College， Zunyi 563000， China）

Abstract： In order to analyze the structural characteristics of extracellular polysaccharides （SR-EPS） from Erjingtiao" peppers fermented by Streptococcus thermophilus， and to explore its in vitro antioxidant activity， in this paper， SR-EPS are extracted by water extraction and alconol precipitation method. After the protein is removed by Sevage method and impurities are removed by dialysis and entrapment， the basic components of SR-EPS are determined， and the structure of SR-EPS is preliminarily characterized by high performance liquid gel chromatograph， Fourier infrared spectrometer， ion chromatograph， scanning electron microscope and so on. At the same time， its in vitro antioxidant activity is investigated. The results show that the yield of SR-EPS is 94 mg/mL， and the content of total soluble sugars， proteins and uronic acids is 39.23%， 0.88%， 9.03% respectively. SR-EPS are composed of three main components， including two types of glycosidic bonds such as α and β. They are acidic heteropolysaccharides mainly composed of mannose， glucose and galactose. Their apparent structure is particle stacking， compact and regular. The scavenging capacity of SR-EPS on ABTS+， DPPH， hydroxyl radicals and iron ion chelation capacity are dose-dependent. In summary， this study can provide references for understanding the in vitro antioxidant activity of extracellular polysaccharides from peppers fermented by lactic acid bacteria， and provide data support for the theory of structural order of extracellular polysaccharides. At the same time， it can provide a certain theoretical basis for the research and application of lactic acid bacteria extracellular polysaccharides in functional foods.

Key words： Streptococcus thermophilus; pepper; extracellular polysaccharides; structure analysis; antioxidant activity

收稿日期：2024-04-29

基金項(xiàng)目：遵義市科技計(jì)劃項(xiàng)目（遵市科合HZ字[2021]226號）；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合基礎(chǔ)-ZK[2023]一般522號）

作者簡介：胡穎（1986—），女，講師，博士，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生、農(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)與保鮮。

*通信作者：蔣緯（1988—），男，講師，博士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)與保鮮、糖化學(xué)與糖生物學(xué)。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）已被大量研究證實(shí)在腸道疾病治療、免疫力增強(qiáng)、飲品風(fēng)味改善、抗菌、結(jié)腸癌預(yù)防和過敏反應(yīng)緩解等方面扮演著正面角色[1-2]。此外，LAB利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的初級、次級代謝產(chǎn)物受到國內(nèi)外眾多研究者的關(guān)注。在其眾多代謝產(chǎn)物中，胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）已被很多研究證實(shí)具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)腸道菌群等生物活性[3]，EPS是一種長鏈、高分子量化合物，由重復(fù)單元和分支組成，分子量通常在4×104 ～6×106 Da之間[4]。來源于果蔬制品的EPS產(chǎn)生菌主要包括腸膜明串珠菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌和食源性干酪乳酸桿菌等乳酸菌[5-11]。而用于EPS產(chǎn)生菌分離的果蔬主要有四川泡菜、菊芋、紅薯、大棗汁、薄荷、東北酸菜等。值得關(guān)注的是，暫未發(fā)現(xiàn)關(guān)于乳酸菌發(fā)酵辣椒產(chǎn)胞外多糖純提物的結(jié)構(gòu)表征及生物活性的相關(guān)研究。因此，關(guān)于乳酸菌發(fā)酵辣椒過程中EPS的產(chǎn)量、種類、結(jié)構(gòu)、功能活性及其變化規(guī)律的研究十分有意義，不僅能發(fā)掘出發(fā)酵型辣椒的應(yīng)用潛力，而且增加了辣椒的利用價(jià)值，對于辣椒的開發(fā)和利用有著重要的指導(dǎo)意義。本試驗(yàn)以貴州遵義二荊條辣椒為研究對象，通過嗜熱鏈球菌純種發(fā)酵，獲取發(fā)酵辣椒胞外多糖后，主要從結(jié)構(gòu)表征和活性表現(xiàn)兩個(gè)方面初步探究SR-EPS，為提升貴州特色優(yōu)質(zhì)資源——辣椒及傳統(tǒng)發(fā)酵食品的應(yīng)用附加值提供了一定的數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

原料：二荊條辣椒，購于貴州省遵義市新蒲新區(qū)農(nóng)貿(mào)市場。

菌株：嗜熱鏈球菌 IFF16038。

精制食鹽、60%紅星二鍋頭酒（均為食品級）；MRS瓊脂培養(yǎng)基（生物純級）；蛋白胨、牛肉浸膏、葡萄糖、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二胺、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80、無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、甲醇、硫酸、磷酸、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基、2，2′-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽、EDTA、1，10-菲啰啉（鄰二氮菲）、抗壞血酸、氯化亞鐵、菲啰嗪、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、30%過氧化氫溶液、苯酚、無水葡萄糖、牛血清白蛋白、硫酸亞鐵、考馬斯亮藍(lán)G-250、過硫酸鉀、D-半乳糖醛酸、間羥基聯(lián)苯、無水四硼酸鈉、氫氧化鈉、單糖標(biāo)準(zhǔn)品等試劑（均為分析純）。

1.2 試驗(yàn)主要儀器

LC-LX-L60D臺(tái)式低速離心機(jī)、LC-10N-50A冷凍干燥機(jī)、LC-RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 上海力辰邦西儀器科技有限公司；KDC-1044 低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海鷹迪儀器設(shè)備有限公司；Multiskan SkyHigh全波長酶標(biāo)儀、Thermo ICS 5000+離子色譜系統(tǒng) 賽默飛世爾科技公司；TU-1810 紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；YP3002B電子天平 上海菁海儀器有限公司；SN-LM-75立式高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；VECTOR 22傅果葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司；Aglient 1200高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

根據(jù)喬少婷等[12]的方法并稍作改動(dòng)，將貯藏于-80 ℃的嗜熱鏈球菌劃線接種于MRS平板，40 ℃培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，40 ℃培養(yǎng)24 h。隨后，以3 500 r/min離心10 min，去除上清液，用無菌生理鹽水對菌體沉淀洗滌1～2次，再用10 mL無菌生理鹽水對其進(jìn)行重懸，渦旋混勻后作為發(fā)酵劑備用，以上操作均在無菌條件下操作。

1.3.2 原料預(yù)處理及發(fā)酵

挑選無蟲蛀、無腐爛的新鮮二荊條辣椒清洗后晾干，隨后去除辣椒的梗、瓤、籽，切成3～5 cm橫段，用60%的白酒浸泡1～2 min以除去原料表面可能附著的微生物，裝入已滅菌的發(fā)酵罐中后再加入一定量的無菌水和食鹽，然后以5×105 CFU/g的接種量添加發(fā)酵劑，封罐、充分混勻后發(fā)酵，發(fā)酵進(jìn)程中對pH值和OD值進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測，當(dāng)pH值≤4.0且OD值趨于平穩(wěn)時(shí)達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，可進(jìn)行EPS的提取制備。

1.3.3 SR-EPS提取流程

參考刁山山等[13]的方法并稍作修改，具體操作：1.3.2中發(fā)酵辣椒所得發(fā)酵液→離心（3 500 r/min，10 min）后取上清液→減壓濃縮（65 ℃）至300 mL→4倍體積無水乙醇醇沉過夜（4 ℃）→離心（3 500 r/min，10 min）取沉淀→減壓濃縮（70 ℃）以去除多余的乙醇→蒸餾水復(fù)溶→去離子水透析（截留量1×105 Da，48 h）→Sevage試劑（三氯甲烷∶正丁醇為4∶1）去除糖溶液中的蛋白質(zhì)→減壓揮干殘留Sevage試劑→減壓冷凍干燥→SR-EPS多糖樣品。按下式計(jì)算SR-EPS得率：

粗多糖得率（mg/mL）=粗多糖質(zhì)量（mg）濃縮發(fā)酵液體積（mL）。

1.3.4 總糖含量的測定

配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01，0.02，0.04，0.06，0.08 mg/mL）以及0.1 mg/mL的SR-EPS樣品溶液，參照苯酚-硫酸法[14]測定樣品中總糖含量。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。以葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，獲得擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=8.220 3x+0.007 1，R2=0.999 9，SR-EPS樣品的可溶性總糖含量根據(jù)上述回歸方程計(jì)算[15]。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量的測定

配制牛血清的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.02，0.04，0.08，0.12，0.16 mg/mL）以及1 mg/mL的SR-EPS樣品溶液，參照考馬斯亮藍(lán)法[16]并稍作修改測定蛋白質(zhì)含量。以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=5.144 3x+0.014 2，R2=0.990 4，SR-EPS樣品的蛋白質(zhì)含量根據(jù)上述回歸方程計(jì)算[17]。

1.3.6 糖醛酸含量的測定

參考楊兵[18]的方法，配制D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.003，0.006，0.009，0.012，0.015 mg/mL）以及0.6 mg/mL的SR-EPS樣品溶液，采用3-苯基酚顯色法測定樣品中半乳糖醛酸的含量。以半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。根據(jù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=52.456x-0.019 4，R2=0.999 4計(jì)算SR-EPS樣品中糖醛酸的含量[19]。

1.3.7 SR-EPS結(jié)構(gòu)表征

1.3.7.1 分子量及分布測定

采用高效液相凝膠色譜儀（HPLC）對SR-EPS的分子量進(jìn)行測定，精確稱取1.00 mg的葡聚糖T-2000、T-500、T-70、T-40和T-10標(biāo)準(zhǔn)品（分子量分別為2 000 000，500 000，70 000，40 000，10 000 Da）充分溶解于1.0 mL去離子水中，同時(shí)獲得濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)糖溶液。對標(biāo)準(zhǔn)品和SR-EPS樣品進(jìn)行HPLC分析，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4，并計(jì)算SR-EPS的分子量。將SR-EPS測定的保留時(shí)間代入擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=-0.346 2x+9.459 5，R2=0.992 7計(jì)算SR-EPS的平均分子量。

1.3.7.2 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）測定

稱取已干燥預(yù)處理的SR-EPS樣品2 mg與干燥恒重的溴化鉀粉末200 mg研磨，壓片，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)利用FT-IR儀進(jìn)行掃描，掃描16次，以2 cm-1的分辨率收集紅外光譜。

1.3.7.3 單糖組成分析

分別精確稱取單糖標(biāo)準(zhǔn)品后，加入去離子水配制成單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.4，0.8，4，8，16，24，32，40 μg/mL）；稱取適量SR-EPS多糖樣品，加入1 mL 2 mol/L TFA溶液，121 ℃加熱2 h，用氮?dú)獯蹈?，加?9.99%甲醇清洗，再吹干，重復(fù)甲醇清洗2～3次，加入去離子水溶解，將標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品液轉(zhuǎn)入色譜瓶中待測。采用Thermo ICS 5000+離子色譜系統(tǒng)，利用電化學(xué)檢測器對單糖組分進(jìn)行分析檢測。

1.3.7.4 掃描電鏡（SEM）觀察

用導(dǎo)電膠將少量SR-EPS樣品粘于樣品臺(tái)，噴金后，在高真空模式下利用SEM以觀測倍數(shù)分別為500×、1 000×、2 000×、5 000×觀察SR-EPS的表面形貌。

1.3.8 體外抗氧化活性的測定

ABTS+·、DPPH·和羥基自由基清除能力以及Fe2+螯合能力的測定常被用于檢測抗氧化活性，在本試驗(yàn)中，3種自由基檢測的陽性對照為抗壞血酸（VC），F(xiàn)e2+螯合能力測定的陽性對照為乙二胺四乙酸（EDTA），SR-EPS多糖樣品被分別配制成0.125，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0 mg/mL的系列濃度后待測。以下試驗(yàn)每個(gè)濃度均進(jìn)行3次平行測定。

1.3.8.1 ABTS自由基清除能力測定

參考文獻(xiàn)[20]的方法并稍作改動(dòng)，稱取38.4 mg ABTS和6.623 mg過硫酸鉀混合溶解并定容至10 mL，室溫下避光放置過夜（12 h），用蒸餾水稀釋至溶液在734 nm處的吸光度值為0.700±0.02左右，得到ABTS工作液。吸取50 μL待測樣液加入96孔板中，再加入ABTS工作液150 μL，在室溫下反應(yīng)30 min后于734 nm處測定吸光度值。用蒸餾水替代樣品溶液測定空白值。按下式計(jì)算ABTS自由基清除率：

ABTS+·清除率（%）=（1-ASA0）×100%。

式中：AS為胞外多糖溶液的吸光度值；A0為蒸餾水替代樣品溶液的空白值。

1.3.8.2 DPPH自由基清除能力測定

采用曹磊等[21]的試驗(yàn)方法，配制150 μmol/L DPPH溶液，用80%的甲醇溶液配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光待用。分別于96孔板中加入50 μL待測樣液和DPPH溶液200 μL，室溫下避光反應(yīng)30 min后，于517 nm處測定吸光度值。用80%甲醇溶液替代樣品溶液測定空白值。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率：

DPPH·清除率（%）=（1-ASA0）×100%。

式中：AS為胞外多糖溶液的吸光度值；A0為80%甲醇溶液替代樣品溶液的空白值。

1.3.8.3 羥基自由基清除能力測定

參照李淑敏等[22]的方法并略作修改：待測樣液取200 μL，加入0.75 mmol/L 1，10-菲啰啉溶液、0.75 mmol/L FeSO4、0.01% 過氧化氫溶液200 μL，充分混勻后，取反應(yīng)體系液250 μL于96孔板中，37 ℃下反應(yīng)60 min，在536 nm處測其吸光度值。按下式計(jì)算羥基自由基清除率：

羥基自由基清除率（%）=（AS-AbA0-Ab）×100%。

式中：AS為胞外多糖溶液的吸光度值；Ab為蒸餾水替代胞外多糖溶液的吸光度值；A0為蒸餾水替代過氧化氫溶液和胞外多糖溶液的吸光度值。

1.3.8.4 Fe2+螯合能力測定

取待測樣液400 μL于1.5 mL EP管中，依次加入2.0 mmol/L FeCl2溶液20 μL、蒸餾水740 μL，渦旋混勻，于室溫下反應(yīng)3 min，再加入5.0 mmol/L菲啰嗪40 μL，渦旋混勻，于室溫下反應(yīng)10 min后，取250 μL于96孔板中，在562 nm處測其吸光度值。按下式計(jì)算鐵離子螯合能力：

鐵離子螯合能力（%）=（1-AS-A0Ab）×100%。

式中：AS為胞外多糖溶液的吸光度值；Ab為蒸餾水替代胞外多糖溶液的吸光度值；A0為蒸餾水替代FeCl2溶液的吸光度值。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用Origin 2022和SPSS 27.0軟件。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SR-EPS基本成分分析

發(fā)酵劑嗜熱鏈球菌接種量為5×105 CFU/g，在40 ℃條件下發(fā)酵二荊條辣椒至pH值≤4.0且OD值處于穩(wěn)態(tài)時(shí)，獲取含有嗜熱鏈球菌胞外多糖的發(fā)酵液。通過水提醇沉法提取SR-EPS，對上述工藝SR-EPS得率、總糖含量、蛋白質(zhì)含量、糖醛酸含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

2.2 SR-EPS的分子量分布

由圖5可知，SR-EPS洗脫出的峰主要分布在7～22 min之間，將SR-EPS測得的3個(gè)峰的保留時(shí)間代入由葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的回歸方程中，計(jì)算得到SR-EPS的分子量分布，見表2。

由表2中峰面積大小可知，第二個(gè)組分（峰號2）的占比較其他兩個(gè)組分更高，為80.58%，說明該組分可能是構(gòu)成SR-EPS的最主要組分，這也為后續(xù)的進(jìn)一步純化提供了思路。綜上所述，嗜熱鏈球菌發(fā)酵辣椒產(chǎn)胞外多糖分子量分布呈現(xiàn)多峰結(jié)構(gòu)，所形成的SR-EPS胞外多糖組成成分較復(fù)雜，為雜多糖。

2.3 SR-EPS的FT-IR分析

由圖6可知，在3 400 cm-1左右出現(xiàn)由—OH的拉伸振動(dòng)引起的吸收峰，在2 900 cm-1左右出現(xiàn)由C—H拉伸振動(dòng)引起的吸收峰，由此可綜合判斷SR-EPS為糖類化合物[23]；此外，在1 730 cm-1附近有一個(gè)弱吸收峰，可判斷為—COOH伸縮振動(dòng)信號峰，表明SR-EPS含有糖醛酸[24]；在1 640，1 420 cm-1左右分別出現(xiàn)由C—O彎曲振動(dòng)和C—H彎曲振動(dòng)引起的吸收峰，可判斷為多糖的紅外特征吸收峰[25]；在1 240 cm-1左右出現(xiàn)由—OH的彎曲振動(dòng)引起的吸收峰以及800～900 cm-1含有的α和β構(gòu)型糖苷鍵共同構(gòu)成多糖物質(zhì)的特征峰圖[26-28]；此外，lt;1 000 cm-1出現(xiàn)的峰形常被認(rèn)為是構(gòu)成多糖類物質(zhì)的指紋圖譜，依托指紋圖譜能對多糖類物質(zhì)進(jìn)行簡單區(qū)分。綜上可知，SR-EPS是一種典型的酸性胞外多糖。

2.4 SR-EPS的單糖組成分析

9種單糖和4種糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品的離子色譜圖見圖7。

由圖8可知，SR-EPS主要由巖藻糖（Fuc）、鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）6種單糖以及半乳糖醛酸（Gal-UA）和葡萄糖醛酸（Glc-UA）2種糖醛酸組成，8種組分物質(zhì)的量的比值為Fuc∶Rha∶Ara∶Gal∶Glc∶Man∶Gal-UA∶Glc-UA為0.71∶9.55∶7.46∶11.64∶27.66∶38.41∶1.52∶3.04，這也進(jìn)一步說明SR-EPS是以甘露糖、葡萄糖和半乳糖為主的酸性雜多糖。

2.5 SR-EPS表觀結(jié)構(gòu)分析

利用SEM對SR-EPS的表觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖9。SR-EPS呈顆粒堆疊狀，堆疊顆粒呈現(xiàn)緊密且有規(guī)則排列狀態(tài)。

2.6 SR-EPS體外抗氧化活性分析

2.6.1 SR-EPS對ABTS自由基的清除能力

由圖10可知，陽性對照VC表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗氧化能力，當(dāng)VC濃度為0.125～4.0 mg/mL時(shí)，其對ABTS+·的清除率保持在較高水平。而SR-EPS濃度在0.125～4.0 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，其對ABTS+·的清除率與其濃度呈正相關(guān)；當(dāng)SR-EPS濃度超過0.25 mg/mL時(shí)，對ABTS+·的清除率顯著上升（Plt;0.05）；當(dāng)SR-EPS濃度達(dá)到4.0 mg/mL時(shí)，對ABTS+·的清除率達(dá)到最高值，為37.81%。

2.6.2 SR-EPS對DPPH自由基的清除能力

由圖11可知，在0.125～4.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，VC對DPPH自由基的清除率基本保持在89%以上，表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗氧化能力。SR-EPS對DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，即在0.125～4.0 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，對DPPH自由基的清除率表現(xiàn)出隨濃度增加而上升的趨勢；但是，從上升趨勢可以看出，當(dāng)SR-EPS濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，其對DPPH自由基的清除率顯著提高（Plt;0.05）；當(dāng)SR-EPS濃度提升至4.0 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到最大值?？傊?，SR-EPS對DPPH自由基的清除能力與其對ABTS自由基的清除能力保持相對一致性[29]。

2.6.3 SR-EPS對羥基自由基的清除能力

由圖12可知，在0.125～2.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，VC對羥基自由基的清除率呈現(xiàn)顯著上升趨勢（Plt;0.05），而當(dāng)VC濃度在2.0～4.0 mg/mL之間，對羥基自由基的清除率并沒有因VC濃度的增加而表現(xiàn)出顯著提升（P＞0.05）。SR-EPS在0.125，0.25 mg/mL較低濃度時(shí)表現(xiàn)出極低的羥基自由基清除率，然而，當(dāng)SR-EPS濃度范圍調(diào)整到0.5～4.0 mg/mL時(shí)，其對羥基自由基的清除率顯著上升（Plt;0.05），同時(shí)也體現(xiàn)出清除率與多糖濃度的劑量依賴關(guān)系。

2.6.4 SR-EPS對鐵離子螯合能力的影響

由圖13可知，在0.125～0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，EDTA對鐵離子的螯合能力呈現(xiàn)顯著上升趨勢（Plt;0.05），然而，當(dāng)EDTA濃度大于0.5 mg/mL后，EDTA對鐵離子的螯合能力并未進(jìn)一步顯著提升（P＞0.05）。當(dāng)EDTA濃度低于0.5 mg/mL時(shí)，SR-EPS濃度改變對鐵離子螯合能力的影響不顯著（P＞0.05）；但是，當(dāng)SR-EPS濃度范圍在1.0～2.0 mg/mL時(shí)，鐵離子螯合能力達(dá)到了平穩(wěn)增長期；當(dāng)SR-EPS濃度提升至4.0 mg/mL時(shí)，鐵離子螯合能力達(dá)到最大值，為20.5%。

由上述結(jié)果可知，SR-EPS作為一種新型的由嗜熱鏈球菌發(fā)酵辣椒產(chǎn)生的胞外多糖，具有較高的得率，相對容易獲取。SR-EPS的基本成分并不復(fù)雜，且由SR-EPS的分子量分布可知，該胞外多糖共包括3個(gè)主要組分，其中組分2因其較高的響應(yīng)值被認(rèn)為是SR-EPS的重要組成成分，也為后續(xù)對SR-EPS雜多糖的進(jìn)一步分離、純化提供了方便和可能。在抗氧化活性的研究中發(fā)現(xiàn)，SR-EPS具有一定的體外抗氧化活性，這為其后續(xù)用于功能食品的深入開發(fā)提供了基礎(chǔ)。其抗氧化能力可能與多糖中含羥基等官能團(tuán)密切相關(guān)[30]；SR-EPS對ABTS自由基、DPPH 自由基和羥基自由基的清除率均與糖濃度保持劑量依賴關(guān)系，總體呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)趨勢。

3 結(jié)論

本研究利用嗜熱鏈球菌對貴州遵義特產(chǎn)二荊條辣椒進(jìn)行純種發(fā)酵，并以此為基礎(chǔ)采用水提醇沉法對發(fā)酵液中的胞外多糖進(jìn)行提取制備后得到SR-EPS。通過對SR-EPS得率計(jì)算，嗜熱鏈球菌發(fā)酵辣椒所得胞外多糖的產(chǎn)量較高。SR-EPS是一種含糖量較高、蛋白質(zhì)含量較少的酸性雜多糖，其主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖等單糖組成。作為一種易獲取且產(chǎn)量高的粗制雜多糖，其在抗氧化能力和鐵離子螯合能力方面的表現(xiàn)較良好，在今后會(huì)繼續(xù)對SR-EPS進(jìn)行再分離和再純化以提升其在活性和功能上的表現(xiàn)力。綜上，本文可為了解乳酸菌發(fā)酵辣椒產(chǎn)生的胞外多糖的抗氧化作用的表現(xiàn)提供參考，也為胞外多糖結(jié)構(gòu)有序性理論提供數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)為乳酸菌胞外多糖在功能性食品中的研發(fā)和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

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