不同乙醇濃度手掌參提取物揮發(fā)性成分及抗氧化作用分析

摘 要：為探究不同乙醇濃度對手掌參揮發(fā)性成分種類及抗氧化能力的影響，本實驗采用頂空-氣相色譜-質(zhì)譜法（Headspace-Solid Phase Microextraction-Gas Chromatography-Mass Spectrometry，HS-SPME-GC-MS）對濃度為75%和95%手掌參乙醇提取物及手掌參原料的揮發(fā)性成分進行測定，采用酶標法對兩種手掌參乙醇提取物的總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）、DPPH自由基和超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力進行評估。結(jié)果顯示，原料及兩種提取物中共檢測到82種揮發(fā)性物質(zhì)。其中，95%手掌參乙醇提取物的揮發(fā)性成分種類最多，為56種；兩種手掌參乙醇提取物共有的揮發(fā)性成分為16種，差異成分4種；95%手掌參乙醇提取物的T-AOC及DPPH自由基清除能力顯著高于75%手掌參乙醇提取物，但O2-·清除率顯著低于75%手掌參乙醇提取物；對甲酚、十六烷酸乙酯、苯乙烯和辛醇等提取物揮發(fā)性成分與T-AOC及DPPH自由基清除能力呈顯著正相關，與O2-·清除能力呈顯著負相關。本研究可為手掌參揮發(fā)性功能成分的開發(fā)提供參考。

關鍵詞：手掌參；乙醇提取物；揮發(fā)性成分；抗氧化能力

Analysis of Volatile Components and Antioxidant Effects of the Different Ethanol Concentrations of Gymnadenia conopsea （L.） R. Br.

CHEN Tianrong， LIU Jiale

（Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences， Food Science Institute， Lhasa 850000， China）

Abstract： In order to investigate the effects of different ethanol concentrations on the types of volatile components and antioxidant capacity of Gymnadenia conopsea （L.） R. Br.， this experiment used headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME-GC-MS） to determine the volatile components of Gymnadenia conopsea （L.） R. Br. ethanol extracts and Gymnadenia conopsea （L.） R. Br. raw materials at concentrations of 75% and 95%. Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was used to evaluate the total antioxidant capacity （T-AOC）， DPPH radical and superoxide anion radical （O2-·） scavenging ability of the two Gymnadenia conopsea （L.） R. Br. ethanol extracts. The results showed that a total of 82 volatile substances were detected in the raw materials and two extracts. Among them， 95% of the volatile components in the ethanol extract of Gymnadenia conopsea （L.） R. Br. are the most diverse， with 56 types; there are 16 common volatile components and 4 different components in the ethanol extracts of two types of Gymnadenia conopsea （L.） R. Br.; the T-AOC and DPPH free radical scavenging ability of 95% Gymnadenia conopsea （L.） R. Br. ethanol extract was significantly higher than that of 75% Gymnadenia conopsea （L.） R. Br. ethanol extract， but the O2-· scavenging rate was significantly lower than that of 75% Gymnadenia conopsea （L.） R. Br. ethanol extract; the volatile components of extracts such as cresol， ethyl hexadecanoate， styrene， and octanol were significantly positively correlated with T-AOC and DPPH radical scavenging ability， and significantly negatively correlated with O2-· scavenging ability. This study can provide reference for the development of volatile functional components in the Gymnadenia conopsea （L.） R. Br..

Keywords： Gymnadenia conopsea （L.） R. Br.; ethanol extract; volatile components; antioxidant capacity

手掌參（Gymnadenia conopsea （L.） R. Br.）為蘭科手參屬多年生草本植物，也被稱為佛手參、掌參、藏三七等，藏族人稱“旺拉”，廣泛分布于我國西藏、青海、甘肅和四川等地[1-2]。此外，在朝鮮、日本、俄羅斯等國家也有其分布[3]。手掌參含有豐富的多糖、黃酮、皂苷、生物堿、氨基酸、脂肪、蛋白質(zhì)和粗纖維等多種成分，目前已從手掌參塊莖中分離出170余種化合物[4-6]。現(xiàn)代藥理學研究表明手掌參具有抗氧化[7]、抗疲勞[8]、鎮(zhèn)靜催眠[9]、降低血脂保護肝臟[10]、降低血糖水平[11]、降尿酸作用[12]以及抗缺氧效應[13]等多種功效，且其乙醇提取物具有顯著的清除自由基[14]、抗矽肺纖維化[15]、抗腫瘤[16]等作用。但不同乙醇濃度下乙醇提取物呈現(xiàn)不同的生物活性，且目前還沒有關于手掌參乙醇提取物揮發(fā)性物質(zhì)的測定研究。本研究基于頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法（Headspace-Solid Phase Microextraction-Gas Chromatography-Mass Spectrometry，HS-SPME-GC-MS），對95%和75%兩種手掌參乙醇提取物進行揮發(fā)性成分的測定和比較分析，并對兩種手掌參乙醇提取物進行抗氧化能力評價，以期為手掌參食飲品的開發(fā)利用和風味物質(zhì)研究提供基礎參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

手掌參，西藏自治區(qū)拉薩市乃倉超市。

無水乙醇，成都金山化學試劑有限公司；總抗氧化能力測定試劑盒（BC 1315）、DPPH自由基清除能力試劑盒（BC 4750）、超氧陰離子能力清除能力試劑盒（BC 1415），均購自索萊寶生物制藥有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-9203A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；BS223S分析天平，Sartorius；KH-500DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Buchi；HJ-A6恒溫磁力攪拌水浴鍋，山東歐萊博儀器有限公司；K6600-B酶標儀；Perkin Elmer Clarus? 690氣相色譜儀；Perkin Elmer Clarus? SQ 8T質(zhì)譜儀；手動固相微萃取進樣手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex萃取頭，Supelco?；UPH-II-10T超純水制造系統(tǒng)，四川優(yōu)普超純科技有限公司；各量程移液槍，Eppendorf。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

用蒸餾水將手掌參洗凈，40 ℃烘干表面水分后，粉碎，過60目篩，40 ℃烘干至恒重，備用。準確稱量10.00 g手掌參粉末于500 mL錐形瓶中，按料液比（1∶40）添加體積分數(shù)為75%和95%乙醇，于500 W、70 ℃超聲輔助提取80 min。將提取溶液過濾后，于60 ℃蒸餾至5～20 mL，恒溫水浴干燥至恒重，備用。此時，75%手掌參乙醇提取物提取率約為14.0%，95%手掌參乙醇提取物提取率約為4.0%[12]。

1.3.2 頂空固相微萃取

稱取適量75%和95%手掌參乙醇提取物干燥樣品于試管中，配制成濃度為20 g·L-1的待測液。取8 mL待測液于20 mL固相微萃取儀采樣瓶中，加入20 μL 50 mg·L-1仲辛醇標準品，將裝有待測液的采樣瓶置于恒溫磁力攪拌水浴鍋中于50 ℃平衡5 min，插入裝有2 cm萃取頭的手動進樣器，頂空萃取35 min后，移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口（溫度為250 ℃）中，熱解析進樣，每個樣品重復測定3次。

1.3.3 儀器測定條件

（1）色譜條件。色譜柱為Perkin Elmer Elite-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）彈性石英毛細管柱；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（純度99.999%）；載氣流量1.0 mL·min-1；分流比19∶1；溶劑延遲時間5 min；程序升溫：初始溫度50 ℃（保留2 min），以3.0 ℃·min-1升溫至100 ℃，以6 ℃·min-1升溫至150 ℃，以4 ℃·min-1升溫至240 ℃，運行時間56.50 min。

（2）質(zhì)譜條件。離子源為EI源；電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度250 ℃；倍增器電壓1 538 V；質(zhì)量范圍35～400 amu；數(shù)據(jù)采集時間范圍5～56.5 min。

（3）圖譜檢索。對各樣品及平行樣總離子流圖，使用Mainlib、Nist-msms、Nist-msms2、Nist-ri、Replib譜圖庫進行圖譜檢索和結(jié)果分析，用內(nèi)標法計算各化學成分的相對質(zhì)量分數(shù)。

1.3.4 抗氧化能力測定

將干燥至恒重的75%和95%手掌參乙醇提取物用蒸餾水配制成20 g·L-1的母液，并用蒸餾水稀釋至1 g·L-1，按照試劑盒說明書進行總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力的測定。

1.4 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism軟件，以單向方差分析方法進行組間均值差異顯著性分析，實驗數(shù)據(jù)均以“均值±標準差”表示。P＜0.01表示差異水平極顯著，P＜0.05表示差異水平顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種手掌參乙醇提取物揮發(fā)性成分分析

2.1.1 兩種手掌參乙醇提取物揮發(fā)性成分離子流圖

樣品經(jīng)1.3處理方法及測定條件下，得到兩種手掌參乙醇提取物及手掌參原料揮發(fā)性成分總離子流圖。由圖1可知，通過比較保留時間和峰形，可看出75%手掌參乙醇提取物、95%手掌參乙醇提取物、手掌參原料揮發(fā)性物質(zhì)及其含量存在一定差異，同時也有部分相似的揮發(fā)性成分；從豐富度來看，95%手掌參乙醇提取物揮發(fā)性成分較為豐富。綜上所述，不同乙醇濃度對手掌參提取物揮發(fā)性成分提取有顯著影響，不同乙醇濃度手掌參提取物及原料揮發(fā)性物質(zhì)存在一定差異。

2.1.2 兩種手掌參乙醇提取物揮發(fā)性成分種類分析

由表1可知，在75%和95%手掌參乙醇提取物及手掌參原料中共檢測到82種揮發(fā)性物質(zhì)。由圖2可知，95%手掌參乙醇提取物揮發(fā)性成分種類明顯高于75%手掌參乙醇提取物及手掌參原料。其中，手掌參原料共檢測到29種揮發(fā)性物質(zhì)，如圖2（a）所示，主要包括3種苯類、5種醇類、2種酚類、11種醛類、3種酸類、1種酮類、1種烷烴類、1種酯類及2種其他類；75%手掌參乙醇提取物共檢測到26種揮發(fā)性成分，如圖2（b）所示，主要包括2種苯類、2種醇類、2種酚類、5種醛類、4種酸類、3種酮類、1種烷烴類、2種烯烴類、2種酯類及3種其他類；95%手掌參乙醇提取物共檢測到56種揮發(fā)性成分，如圖2（c）所示，包括3種苯類、4種醇類、6種酚類、9種醛類、7種酸類、2種酮類、3種烷烴類、1種烯烴類、13種酯類及8種其他類。

將在75%和95%手掌參乙醇提取物及手掌參原料的揮發(fā)性物質(zhì)進行比較。由圖3可知，95%手掌參乙醇提取物與手掌參原料共有的揮發(fā)性成分有9種，75%手掌參乙醇提取物與其原料共有的揮發(fā)性成分有8種，兩種手掌參乙醇提取物共有的揮發(fā)性成分有16種，而三者共有的揮發(fā)性成分有7種，主要為鄰二甲苯、對甲酚、2，4-二叔丁基酚、正辛醛、壬醛、癸醛和7-甲氧基-2-甲基喹啉-4-醇。

2.1.3 兩種手掌參乙醇提取物揮發(fā)性成分主成分分析

對2種手掌參乙醇提取物揮發(fā)性成分進行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）。由圖4可知，兩組樣本可明顯分離，表明數(shù)據(jù)良好，可反應樣本整體信息。

為進一步篩選差異揮發(fā)性物質(zhì)，本研究進行了偏最小二乘判別分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA）。由圖5和圖6可知，PLS-DA和OPLS-DA的模型參數(shù)分別為R2=（0.0，0.64）、Q2=（0.0，-0.22）；R2=（0.0，0.63）、Q2=（0.0，-0.76），模型參數(shù)較好，可作為預測模型。以VIP＞1，P＜0.05作為篩選差異揮發(fā)性物質(zhì)條件，結(jié)果顯示，2種手掌參乙醇提取物中共篩選出4種差異揮發(fā)性物質(zhì)，分別為苯乙烯、對甲酚、十六烷酸乙酯及2，4-二叔丁基苯酚。

2.1.4 兩種手掌參乙醇提取物揮發(fā)性成分相關性分析

對兩種手掌參乙醇提取物進行相關性分析，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，苯乙烯與7-甲氧基-2-甲基喹啉-4-醇、對甲酚、辛醇、2，2’-偶氮二-2-甲基丙酰胺、十六烷酸乙酯和2，4-二叔丁基苯酚等呈顯著正相關；7-甲氧基-2-甲基喹啉-4-醇與對甲酚、辛醇、壬醛、2，2’-偶氮二-2-甲基丙酰胺、十六烷酸乙酯和2，4-二叔丁基苯酚等呈顯著正相關；對甲酚與辛醇、2，2’-偶氮二-2-甲基丙酰胺、十六烷酸乙酯和2，4-二叔丁基苯酚等呈顯著正相關；辛醇與壬醛、2，2’-偶氮二-2-甲基丙酰胺、十六烷酸乙酯和2，4-二叔丁基苯酚等呈顯著正相關；3-叔丁基-2-羥基苯甲醛與苯乙烯、7-甲氧基-2-甲基喹啉-4-醇、對甲酚、辛醇、2，2’-偶氮二-2-甲基丙酰胺、2-甲氧基肉桂醛、十六烷酸乙酯和2，4-二叔丁基苯酚呈顯著負相關。

2.2 兩種手掌參乙醇提取物抗氧化能力分析

兩種手掌參乙醇提取物抗氧化能力結(jié)果見圖8。由圖8可知，95%手掌參乙醇提取物的總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力顯著高于75%手掌參乙醇提取物（P＜0.05）；75%手掌參乙醇提取物的超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力顯著高于95%手掌參乙醇提取物（P＜0.01）。通過分析比較兩種手掌參乙醇提取物揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)不同濃度手掌參乙醇提取物含有不同揮發(fā)性成分，且含量也存在差異。這表明兩種手掌參乙醇提取物起主導作用的成分含量可能存在差異，亦可能含有不同功能成分，故進一步對其抗氧化能力和揮發(fā)性成分進行相關性分析。

2.3 手掌參乙醇提取物揮發(fā)性成分與抗氧化能力相關性分析

手掌參乙醇提取物揮發(fā)性成分與其抗氧化能力相關性分析如圖9所示。由圖9可知，其T-AOC與對甲酚、十六烷酸乙酯、苯乙烯、2，2’-偶氮二-2-甲基丙酰胺、7-甲氧基-2-甲基喹啉-4-醇、辛醇及2，4-二叔丁基苯酚呈極顯著性正相關（P＜0.01），與壬醛呈顯著正相關（P＜0.05）；與3-叔丁基-2-羥基苯甲醛呈顯著負相關（P＜0.05）。DPPH自由基清除能力與對甲酚、十六烷酸乙酯、苯乙烯、2，2’-偶氮二-2-甲基丙酰胺和辛醇呈顯著正相關（P＜0.05）。超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力與3-叔丁基-2-羥基苯甲醛呈極顯著正相關（P＜0.001）；與對甲酚、十六烷酸乙酯、苯乙烯、2，2’-偶氮二-2-甲基丙酰胺、2，4-二叔丁基苯酚呈極顯著負相關（P＜0.01），與7-甲氧基-2-甲基喹啉-4-醇、辛醇和2-甲氧基肉桂醛呈顯著性負相關（P＜0.05）。

3 結(jié)論

本實驗探究了75%和95%手掌參乙醇提取物及手掌參原料的揮發(fā)性成分差異，并初步評估了兩種手掌參乙醇提取物的抗氧化性能。結(jié)果表明，95%手掌參乙醇提取物揮發(fā)性成分種類顯著高于75%手掌參乙醇提取物及其原料，其中醇類、酚類、酸類和酯類化合物較為豐富，且95%手掌參乙醇提取物的總抗氧化能力及DPPH自由基清除能力顯著高于75%手掌參乙醇提取物；相關性分析結(jié)果表明對甲酚、十六烷酸乙酯、苯乙烯、2，2’-偶氮二-2-甲基丙酰胺等成分與總抗氧化能力及DPPH自由基清除能力呈顯著正相關，與超氧陰離子自由基清除能力呈極顯著負相關。本研究為手掌參飲品的研發(fā)和風味物質(zhì)分析提供了理論參考。

參考文獻

[1]楊爽，楊春蕾，李永霞，等.林芝地區(qū)野生手掌參生境土壤養(yǎng)分狀況研究[J].西藏科技，2020（5）：9-14.

[2]龐家華.長白山手掌參保護研究[D].長春：吉林大學，2020.

[3]SHANG X，GUO X，LIU Y，et al.Gymnadenia conopsea （L.） R. Br.：a systemic review of the ethnobotany， phytochemistry， and pharmacology of an important asian folk medicine[J]. Front pharmacol，2017，8：24.

[4]MENG X H，WANG M，LIN P C.Gymnadenia conopsea （L.） R. Br.：comprehensive review of propagation and breeding， traditional uses， chemical composition，pharmacology，quality control，and processing[J].Journal of Ethnopharmacolo-gy，2023，306：116205.

[5]LIN P C，WU D T，XIE J，et al.Characterization and comparison of bioactive polysaccharides from the tubers of Gymnadenia conopsea[J].Food Hydrocolloids，2015，43：199-206.

[6]WANG X，ZHONG X J，ZHOU N，et al.Rapid characterizaiton of chemical constituents of the tubers of Gymnadenia conopsea by UPLC-Orbitrap-MS/MS analysis[J].Molecules，2020，25（4）：898.

[7]馮洋洋，李杭雨，張琳梓，等.手掌參多糖對60Co-γ射線輻射小鼠造血和抗氧化功能損傷的治療作用研究[J].核農(nóng)學報，2022，36（7）：1362-1370.

[8]趙亮，劉國清.手掌參合劑抗疲勞作用的實驗研究[J].中醫(yī)臨床研究，2011，3（22）：17.

[9]周欣欣，熊平，林志成，等.手參鎮(zhèn)靜催眠作用的實驗研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2009，11（9）：33-35.

[10]張?zhí)於?，陳朝勇，李少華，等.手參對高脂血癥大鼠血脂及肝功能的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，24（4）：865-867.

[11]馬宏偉，劉榮國，楊文鈺，等.復方手參丸治療糖尿病腎病40例臨床觀察[J].中國民族民間醫(yī)藥，2015，24（3）：71-72.

[12]CHEN T R，PUBU D J，ZHANG W H，et al.Optimization of the extraction process and metabonomics analysis of uric acid-reducing active substances from Gymnadenia R.Br. and its protective effect on hyperuricemia zebrafish[J].Frontiers in Nutrition，2022，9，1054294.

[13]ZHANG Y C，LIU L，LIANG C T，et al.Expression profiles of long noncoding RNAs in mice with high-altitude hypoxia-induced brain injury treated with Gymnadenia conopsea （L.） R. Br.[J].Neuropsychiatric Disease and Treatment，2020，16：1239-1248.

[14]李紅兵，劉曄瑋，李立，等.手掌參不同溶劑提取物清除自由基活性評價[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20（12）：3253-3255.

[15]WANG J，ZENG J B，ZHAO X F，et al.Effects of Gymnadenia conopsea alcohol extract on collagen synthesis in rat lungs exposed to silica and its mechanism of antioxidative stress[J].Journal of Chinese integrative medicine，2007，5（1）：50-55.

[16]LIN P C，WANG X，ZHONG X J，et al.Chemical characterization of a PD-1/PD-L1 inhibitory activity fraction of the ethanol extract from Gymnadenia conopsea[J].Journal of Asian Natural Products Research，2021，23（3）：235-249.