基于核心KASP標(biāo)記的江蘇粳稻品種DNA指紋圖譜構(gòu)建

收稿日期：2024-04-27

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（BK20210151）；江蘇省種質(zhì)資源精準(zhǔn)鑒定評(píng)價(jià)項(xiàng)目（005012691230229）

作者簡(jiǎn)介：朱小品（1989-），女，河南商丘人，博士，助理研究員，主要從事水稻種質(zhì)資源遺傳多樣性及種子休眠與萌發(fā)的生物學(xué)機(jī)理研究。（E-mail）zxp1028@126.com

通訊作者：顏 偉，（E-mail）yanwei@jaas.ac.cn

摘要： 為了建立江蘇粳稻品種DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，本研究利用水稻10K液相芯片對(duì)314份來源廣泛的水稻種質(zhì)資源進(jìn)行SNP基因分型，篩選出一系列高多態(tài)性的SNP位點(diǎn)并開發(fā)出122個(gè)KASP標(biāo)記。利用122個(gè)KASP標(biāo)記對(duì)38份江蘇粳稻品種進(jìn)行檢測(cè)，以多態(tài)性信息量（PIC）＞0.3，最小等位基因頻率（MAF）＞0.2，檢出率＞0.9為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出56個(gè)具有高效鑒別效率的核心KASP標(biāo)記。遺傳距離相關(guān)性分析結(jié)果表明，基于56個(gè)核心KASP標(biāo)記的江蘇粳稻品種的遺傳距離與基于122個(gè)高多態(tài)性KASP標(biāo)記的的江蘇粳稻品種的遺傳距離相關(guān)系數(shù)為89.1%，呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），表明56個(gè)核心標(biāo)記可以有效代替122個(gè)高多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定。進(jìn)一步利用56個(gè)核心KASP標(biāo)記對(duì)102份江蘇粳稻品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，并構(gòu)建了102份品種的DNA指紋圖譜和分子身份證二維碼，本研究結(jié)果為江蘇地區(qū)粳稻品種鑒定、選育和種質(zhì)資源高效利用提供了參考。

關(guān)鍵詞： 水稻；KASP標(biāo)記；DNA指紋圖譜；品種鑒定；遺傳多樣性分析

中圖分類號(hào)： S511.2 +2"" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ""文章編號(hào)： 1000-4440（2024）09-1569-17

Construction of DNA fingerprint for japonica rice varieties in Jiangsu based on core KASP markers

ZHU Xiaopin， XU Tingting， MENG Shan， YANG Xue， YANG Xin， ZHU Yin， DI Jiachun， GUO Chunbin， WANG Ning， YAN Wei

（Institute of Germplasm Resources and Biotechnology， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Provincial Platform for Conservation and Utilization of Agricultural Germplasm/Jiangsu Key Laboratory for Agrobiology， Nanjing 210014， China）

Abstract： In order to establish the DNA fingerprinting database of japonica rice varieties in Jiangsu province， SNP genotyping was carried out in 314 rice germplasm resources by using GenoBaits rice 10K panel， a series of SNP loci with high polymorphism were screened and 122 KASP markers were developed. Thirty-eight japonica rice varieties in Jiangsu province were tested with 122 KASP markers， and 56 core KASP markers with high identification efficiency were selected with polymorphism information content （PIC）＞0.3， minor allele frequency （MAF）＞0.2， and detection rate ＞0.9 as screening criteria. The results of genetic distance correlation analysis showed that the correlation coefficient between the genetic distance of Jiangsu japonica rice varieties based on 56 core KASP markers and the genetic distance of Jiangsu japonica rice varieties based on 122 highly polymorphic KASP markers was 89.1%， showing a very significant positive correlation （P＜0.01）. The results indicated that 56 core markers could effectively replace 122 highly polymorphic markers for variety identification. The genetic diversity of 102 japonica rice varieties in Jiangsu province was further analyzed by using 56 core KASP markers， and the DNA fingerprints and molecular ID codes of 102 varieties were constructed. The results of this study provide a reference for the identification， breeding and efficient utilization of japonica rice germplasm resources in Jiangsu province.

Key words： Oryza sativa L.；KASP marker；DNA fingerprint；cultivar identification；genetic diversity analysis

水稻是中國(guó)主要的糧食作物之一，近年來，得益于育種技術(shù)的進(jìn)步，水稻品種更新?lián)Q代的速度不斷加快，全國(guó)每年審定的水稻新品種有上千個(gè)（中國(guó)種業(yè)大數(shù)據(jù)平臺(tái)）。然而，隨著育成品種數(shù)的日益增多，品種同質(zhì)化問題日益凸顯，而真正具有突破性的新品種則相對(duì)稀缺。建立快速、高效、低成本的品種分子鑒定體系，有助于保護(hù)、篩選、利用種質(zhì)資源，推進(jìn)水稻品種原始創(chuàng)新，同時(shí)有利于維護(hù)育種者的權(quán)益。

傳統(tǒng)的品種真實(shí)性鑒定基于田間的表型性狀，數(shù)據(jù)調(diào)查、整理分析需要消耗大量的精力，且該方法周期長(zhǎng)，易受環(huán)境影響，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模快速鑒定[1]。DNA分子標(biāo)記特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高，不易受外界環(huán)境影響，是品種鑒定和遺傳分析強(qiáng)有力的工具[2]。DNA分子標(biāo)記經(jīng)歷了幾代的發(fā)展，目前已有數(shù)十種，如RFLP標(biāo)記、RAPD標(biāo)記、AFLP標(biāo)記、SSR標(biāo)記、SNP標(biāo)記等[3]。其中SSR標(biāo)記和SNP標(biāo)記是最經(jīng)典且應(yīng)用最廣泛的2類分子標(biāo)記，被國(guó)際植物品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）確定為構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的推薦標(biāo)記[4]。

SSR標(biāo)記存在難以實(shí)現(xiàn)高通量、數(shù)據(jù)整合復(fù)雜以及可選用標(biāo)記分布有限等問題，這些問題限制了SSR標(biāo)記技術(shù)在現(xiàn)代育種工作中的進(jìn)一步應(yīng)用和發(fā)展。相比之下，SNP標(biāo)記具有分布廣泛、分布均勻、二態(tài)性等優(yōu)點(diǎn)，更易實(shí)現(xiàn)高通量位點(diǎn)和高通量樣品的檢測(cè)，適于數(shù)據(jù)整合和共享[5-7]。2021年《水稻品種真實(shí)性鑒定SNP標(biāo)記法》通過了農(nóng)業(yè)行業(yè)審定[8]。目前，SNP標(biāo)記已在水稻、小麥、玉米、豆類、棉花等主要作物品種鑒定以及遺傳多樣性分析中被廣泛應(yīng)用[9-13]。全基因組重測(cè)序和基因芯片掃描是高通量檢測(cè)SNP位點(diǎn)的重要方法，但這兩種方法的檢測(cè)成本高，檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)量龐大，需要高性能計(jì)算機(jī)進(jìn)行存儲(chǔ)和分析，同時(shí)對(duì)檢測(cè)人員的數(shù)據(jù)分析能力要求較高。

基于等位基因特異性PCR的競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增技術(shù)（Kompetitive allele-specific PCR，KASP）在SNP分型方面具有高精度、低成本和高效率的優(yōu)勢(shì)，并且該技術(shù)可以根據(jù)檢測(cè)群體設(shè)計(jì)特定的組合標(biāo)記，也可以根據(jù)特定功能位點(diǎn)開發(fā)功能分子標(biāo)記，檢測(cè)位點(diǎn)和檢測(cè)樣本具有很大的靈活性[14]。陸海燕等[15]利用玉米全基因組高密度SNP基因分型數(shù)據(jù)，篩選并開發(fā)202個(gè) KASP標(biāo)記，群體遺傳距離相關(guān)性分析和群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，202個(gè)高多態(tài)信息含量（PIC）的KASP標(biāo)記可用于玉米種質(zhì)資源的研究。 孫正文等[13]利用棉花CottonSNP63K芯片篩選出393個(gè)核心KASP標(biāo)記并構(gòu)建品種特異的分子指紋圖譜，表明KASP分子標(biāo)記在棉花遺傳改良中具有廣泛的應(yīng)用前景。以上研究結(jié)果表明，篩選高效KASP標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定和遺傳多樣性分析，可以在降低成本的同時(shí)保證檢測(cè)準(zhǔn)確性和靈敏度，是一種更經(jīng)濟(jì)、高效的方案。

本研究利用水稻10K液相芯片對(duì)314份來源廣泛的水稻種質(zhì)資源進(jìn)行全基因組掃描，通過層層篩選，獲得了56個(gè)高多態(tài)性的核心KASP標(biāo)記?；?6個(gè)KASP核心標(biāo)記對(duì)102份江蘇粳稻品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，構(gòu)建了江蘇粳稻品種的DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫和品種分子身份證二維碼。本研究結(jié)果將為江蘇地區(qū)粳稻種質(zhì)資源的科學(xué)管理、高效利用以及品種鑒定和品種創(chuàng)新提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用試驗(yàn)材料均來自江蘇省農(nóng)作物種質(zhì)資源中期庫，主要為江蘇地區(qū)的主要水稻品種，包括南粳系列、淮稻系列、徐稻系列、鎮(zhèn)稻系列、武運(yùn)粳系列、武育粳系列、武香粳系列、鹽稻系列、鹽粳系列以及揚(yáng)粳系列等102份江蘇地區(qū)種植的主要水稻品種，具體品種名稱和育成單位信息如表1所示。

1.2 SNP位點(diǎn)篩選及KASP標(biāo)記開發(fā)

利用博瑞迪開發(fā)的10K液相芯片對(duì)314份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行全基因組掃描，對(duì)得到的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，以多態(tài)性信息含量（PIC）＞0.4篩選高多態(tài)性SNP位點(diǎn)，并根據(jù)SNP位點(diǎn)在染色體的分布情況，最終篩選出170個(gè)候選SNP位點(diǎn)，根據(jù)SNP位點(diǎn)側(cè)翼100～200 bp序列，使用網(wǎng)站http：//www.snpway.com/設(shè)計(jì)KASP引物，進(jìn)行KASP標(biāo)記篩選。KASP引物組合包含兩條特異性引物F1、F2和一條通用引物R，其中F1引物5′端連接與FAM熒光結(jié)合的特異性序列5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，用于檢測(cè)參考基因組上的等位基因；F2引物5′端連接與HEX熒光結(jié)合的特異性序列5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，用于檢測(cè)變異位點(diǎn)上的等位基因。

利用CTAB法提取水稻幼苗DNA，使用核酸微量測(cè)定儀進(jìn)行DNA質(zhì)量濃度測(cè)量和質(zhì)量檢測(cè)，將DNA質(zhì)量濃度稀釋至10～20 ng/μL。將稀釋的DNA轉(zhuǎn)到96孔PCR樣品板上，每板中2個(gè)孔加ddH2O作為對(duì)照（NTC）。KASP反應(yīng)體系為：每孔0.8 μL DNA，每孔0.75 μL 2×KASP Master mix（LGC）+0.05 μL引物。KASP反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝徊剑A(yù)變性94 ℃，15 min；第二步，變性94 ℃，20 s，復(fù)性/延伸61～55 ℃（每循環(huán)1次下降0.6 ℃），60 s，共10個(gè)循環(huán)；第三步，變性94 ℃，20 s，復(fù)性/延伸61～55 ℃，60 s， 26個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用IntelliQube（LGC）機(jī)器進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)讀取和分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將102份水稻品種的基因型數(shù)據(jù)整理成HapMap格式，利用PowerMaker3.25軟件計(jì)算每個(gè)標(biāo)記的最小等位基因頻率（MAF）、多態(tài)性信息量（PIC），利用TASSEL v5.0軟件的鄰接算法計(jì)算水稻品種間的遺傳距離，利用Figtree v1.4.3構(gòu)建聚類圖。

在Excel中，根據(jù)基因分型結(jié)果，將每份材料的基因型進(jìn)行數(shù)字化賦值，將 SNP 標(biāo)記基因型分為AA、TT、CC、GG、 雜合、缺失6種情況，分別用1、2、3、4、0、9表示，在Excel中對(duì)基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)字化賦值后，每份材料的基因型信息由一串56位數(shù)字構(gòu)成，構(gòu)建了每份材料的分子指紋數(shù)據(jù)，并利用在線軟件草料二維碼生成器（http：//cli.im/）將分子指紋數(shù)據(jù)生成分子指紋二維碼。

2 結(jié)果與分析

2.1 高多態(tài)性SNP位點(diǎn)篩選及KASP標(biāo)記開發(fā)

利用博瑞迪開發(fā)的水稻10K液相芯片（GenoBaits rice 10K panel）對(duì)314份來源廣泛的水稻種質(zhì)資源進(jìn)行全基因組掃描，獲得了水稻基因組上分布的33 580個(gè)SNP位點(diǎn)。對(duì)獲得的總SNP位點(diǎn)進(jìn)行過濾篩選，去除SNP缺失率＞10%，最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）＜0.05，樣本缺失率＞10%的位點(diǎn)，共篩選出20 260個(gè)高質(zhì)量SNP位點(diǎn)，這些位點(diǎn)均勻分布在水稻基因組上。多態(tài)性信息量（PIC）可以衡量DNA分子標(biāo)記在品種群體中的多態(tài)性，以PIC＞0.4為條件進(jìn)行篩選，獲得了1 192個(gè)高多態(tài)性SNP位點(diǎn)作為候選位點(diǎn)。從1 192個(gè)候選SNP位點(diǎn)中篩選出位點(diǎn)前后100 bp均沒有其他變異位點(diǎn)的SNP位點(diǎn)，再結(jié)合染色體分布情況，最終篩選出170個(gè)高PIC的SNP位點(diǎn)用于KASP標(biāo)記開發(fā)。170個(gè)SNP位點(diǎn)在基因組的分布情況如圖1A所示，SNP位點(diǎn)平均間隔2.2 Mb。

以Nip_MSU7.0為參考基因組，從基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站Jbrowse（https：//www.mbkbase.org/jbrowse/？data）下載170個(gè)高多態(tài)性SNP位點(diǎn)側(cè)翼100 bp的序列，利用KASP引物開發(fā)網(wǎng)站SNPWay（http：//www.gentides.cn/snpprimer/）設(shè)計(jì)KASP引物。為了檢驗(yàn)KASP引物的有效性，選擇表1中前38份江蘇粳稻品種作為檢測(cè)群體，分析每個(gè)KASP標(biāo)記的基因分型效果，圖1B中左上方和右下方聚集的點(diǎn)分別代表等位基因型和參考基因型，中間聚集的點(diǎn)代表雜合基因型，左下方的黑色點(diǎn)代表陰性對(duì)照（NTC）。最終從170個(gè)KASP標(biāo)記中，篩選出122個(gè)準(zhǔn)確性較高的KASP標(biāo)記。

2.2 核心SNP位點(diǎn)篩選及KASP標(biāo)記開發(fā)

為了進(jìn)一步篩選在粳稻品種中高多態(tài)性的核心標(biāo)記[16]。首先分析122個(gè)KASP標(biāo)記對(duì)38份水稻種質(zhì)資源的基因型分型結(jié)果，以最小等位基因頻率（MAF）＞0.20、多態(tài)性信息量（PIC）＞0.3、檢出率＞90%、雜合率＜5%為篩選標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合KASP標(biāo)記在染色體上的分布情況[15]，篩選出56個(gè)高PIC的SNP位點(diǎn)。56個(gè)SNP位點(diǎn)覆蓋了水稻基因組的12條染色體，平均間隔6.6 Mb（圖2A）。38份水稻種質(zhì)資源中，這些位點(diǎn)PIC為0.34～0.50，平均值為0.47；利用這56個(gè)SNP位點(diǎn)開發(fā)出56個(gè)核心KASP標(biāo)記（表2）。MAF為0.22～0.50，平均值為0.40（圖2B、圖2C）。

為驗(yàn)證56個(gè)核心KASP標(biāo)記對(duì)水稻品種的區(qū)分效率，利用122個(gè)高多態(tài)性的KASP標(biāo)記和56個(gè)核心KASP標(biāo)記對(duì)38份江蘇粳稻品種進(jìn)行基因分型，計(jì)算品種間的遺傳距離?；?22個(gè)高多態(tài)性KASP標(biāo)記，38份江蘇育成粳稻品種的兩兩遺傳距離為0.10～0.75，遺傳距離平均值為0.46，對(duì)38份粳稻品種的區(qū)分效率為100%。有696對(duì)粳稻品種間的遺傳距離小于0.7，占總對(duì)數(shù)的99%；有7對(duì)粳稻品種間的遺傳距離大于0.7，占總對(duì)數(shù)的1%（圖3A）?；?6個(gè)核心KASP標(biāo)記，38份粳稻品種兩兩遺傳距離為0.09～0.75，遺傳距離平均值為0.47，對(duì)38份粳稻品種的區(qū)分效率為100%。有799對(duì)粳稻品種的品種間遺傳距離小于0.7，占總對(duì)數(shù)的98%；有11對(duì)粳稻品種的品種間遺傳距離大于0.7，占總對(duì)數(shù)的2%（圖3B），并且基于56個(gè)核心KASP標(biāo)記的遺傳距離與基于122個(gè)高多態(tài)性KASP標(biāo)記的遺傳距離呈極顯著線性相關(guān)（P＜0.01）（圖3C）。結(jié)果表明，56個(gè)核心KASP標(biāo)記可以有效代替122個(gè)高多態(tài)性KASP標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定，即56個(gè)核心KASP標(biāo)記可以有效鑒定江蘇粳稻品種。

2.3 102份江蘇粳稻品種遺傳多樣性分析

利用56個(gè)核心KASP標(biāo)記對(duì)102份江蘇粳稻品種進(jìn)行基因分型，計(jì)算品種間的遺傳距離，利用鄰接法（Neighbor-joining method）構(gòu)建該群體的聚類進(jìn)化樹，結(jié)果顯示102份水稻品種可以被劃分為4個(gè)亞群，Pop1、Pop2、Pop3、Pop4（圖4）。Pop1亞群包含7份品種，其中有6份品種為武運(yùn)粳3號(hào)衍生后代，主要為江蘇太湖和蘇南地區(qū)種植的品種，如南粳46、寧粳3號(hào)；Pop2亞群包含18份品種，主要為江蘇省蘇中及寧鎮(zhèn)揚(yáng)丘陵地區(qū)推廣的品種，如揚(yáng)育粳2號(hào)、武運(yùn)粳24號(hào)；Pop3亞群包含20份品種，主要為江蘇省淮北地區(qū)大面積推廣品種，包括鹽粳和華粳系列；Pop4亞群包含57份品種，該亞群品種數(shù)目最多，其中桂花黃、秀水04、武育粳3號(hào)、鎮(zhèn)稻88為江蘇粳稻育成品種的早期骨干親本，系譜分析發(fā)現(xiàn)Pop4亞群主要為這些骨干親本及其衍生后代的粳稻品種。Pop4亞群中，徐稻3號(hào)（B66）、徐稻4號(hào)（B143）、徐稻7（B144）號(hào)、徐稻8號(hào)（B145）、連粳20（B87）、連粳6號(hào)（B100）、鎮(zhèn)稻99（B55）、寧粳4號(hào)（B101）等8份在江蘇淮北地區(qū)大面積推廣的粳稻品種均為鎮(zhèn)稻88（B35）的衍生后代；淮稻5號(hào)（B72）、淮稻6號(hào)（B44）、南粳51（B129）、南粳0212（B131）均和骨干親本武育粳3號(hào)有親緣關(guān)系。以上結(jié)果表明56個(gè)核心KASP標(biāo)記能夠?qū)⒉煌贩N的粳稻根據(jù)親緣關(guān)系進(jìn)行聚類。

2.4 102份江蘇粳稻品種DNA指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)56個(gè)核心KASP標(biāo)記對(duì)102份江蘇粳稻品種的基因分型結(jié)果構(gòu)建江蘇育成粳稻品種的特異DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。將 KASP標(biāo)記基因型分為AA、TT、CC、GG、 雜合、缺失6種情況，分別用1、2、3、4、0、9表示，在Excel中對(duì)基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)字化賦值后，每份材料的基因型信息由一串56個(gè)數(shù)字構(gòu)成，如南粳9108的分子身份信息數(shù)字化表示為“14343411331142433413224421124142132331112343233222444243”，構(gòu)建102份水稻品種的DNA指紋圖譜（表3）。對(duì)比102份粳稻品種的DNA指紋數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，56個(gè)KASP標(biāo)記將102份粳稻品種分為102種特異單倍型，即可以將102份江蘇粳稻全部區(qū)分，區(qū)分效率達(dá)到100%。將分子身份證數(shù)據(jù)批量導(dǎo)入草料二維碼生成軟件（https：//console.cli.im/nedit？create_from=126）中，分別生成了102份水稻品種的分子身份證指紋圖譜二維碼，圖5展示了部分粳稻品種的分子身份證二維碼。

3 討論

種質(zhì)鑒定是種質(zhì)保存和新品種審定的重要環(huán)節(jié)[17-19]，建立快速、準(zhǔn)確的品種鑒定體系對(duì)種質(zhì)鑒定具有重要意義。利用DNA指紋技術(shù)[20]可以實(shí)現(xiàn)品種的快速、準(zhǔn)確鑒定，該技術(shù)在種質(zhì)鑒定和產(chǎn)權(quán)糾紛中發(fā)揮重要作用。此外，通過DNA指紋鑒定技術(shù)，不僅可以有效鑒別出種質(zhì)庫中的重復(fù)種質(zhì)資源，還可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行種質(zhì)資源的鑒定與評(píng)價(jià)，大大提高種質(zhì)資源的保存質(zhì)量與利用效率[21]。

SSR和SNP分子標(biāo)記為國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的農(nóng)作物DNA指紋鑒定技術(shù)，SSR標(biāo)記的基因分型過程包括PCR擴(kuò)增、凝膠電泳和銀染或熒光檢測(cè)等多個(gè)步驟，操作繁瑣且耗時(shí)較長(zhǎng)，特別是在高通量檢測(cè)中，需要同時(shí)分析大量樣本，傳統(tǒng)SSR基因分型方法無法滿足這種需求[22]。SNP位點(diǎn)在基因組中分布廣泛，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，SNP位點(diǎn)的檢測(cè)方法也越來越多樣。全基因組測(cè)序可以對(duì)品種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，但重測(cè)序文庫的建立成本較高，且數(shù)據(jù)量龐大，對(duì)研究人員的數(shù)據(jù)分析能力要求更高[23]。芯片微陣列技術(shù)可以檢測(cè)全基因組SNP位點(diǎn)，但是其檢測(cè)成本較高，在品種鑒定中不夠靈活。與其他SNP檢測(cè)方法相比，KASP技術(shù)靈活性較高，且檢測(cè)成本低[24]。近年的研究結(jié)果表明，提取核心SNP位點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)品種的有效鑒定[16]。魏中艷等[25]利用12個(gè)高多態(tài)性KASP標(biāo)記與2個(gè)特異等位變異KASP標(biāo)記組成了大豆核心標(biāo)記組合GlySNP14，利用GlySNP14對(duì)599份大豆種質(zhì)進(jìn)行鑒定，其中100份大豆種質(zhì)能被準(zhǔn)確區(qū)分，表明確定核心KASP標(biāo)記可以降低鑒定成本，同時(shí)保證鑒定的準(zhǔn)確性。

由于同一種植區(qū)往往集中利用少數(shù)骨干優(yōu)良親本進(jìn)行育種，導(dǎo)致遺傳背景狹窄，育成品種同質(zhì)化嚴(yán)重，因此需要建立特定區(qū)域育成品種的分子指紋圖譜，一方面可以鑒定種質(zhì)的真實(shí)性，另一方面也可以為親本選擇提供指導(dǎo)[26-27]。江蘇地區(qū)作為中國(guó)主要的粳稻栽培區(qū)，具有悠久的種植歷史和豐富的種質(zhì)資源。構(gòu)建江蘇地區(qū)粳稻品種DNA指紋圖譜，有助于提高品種鑒定的準(zhǔn)確率和效率，避免傳統(tǒng)鑒定方法中的主觀性和誤差，同時(shí)也有助于發(fā)掘和利用江蘇地區(qū)的優(yōu)良種質(zhì)資源，推動(dòng)粳稻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

4 結(jié)論

本研究利用10k液相芯片對(duì)314份遺傳多樣性豐富的粳稻種質(zhì)資源進(jìn)行全基因組掃描結(jié)果，篩選出170個(gè)在12條染色體均勻分布、高多態(tài)性的SNP位點(diǎn)，其中根據(jù)122個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)出122個(gè)KASP標(biāo)記。以38個(gè)江蘇主要育成粳稻品種作為檢測(cè)群體，篩選出56個(gè)核心KASP標(biāo)記。遺傳距離相關(guān)性分析結(jié)果表明，基于56個(gè)核心KASP標(biāo)記的江蘇粳稻品種遺傳距離與基于122個(gè)高多態(tài)性KASP標(biāo)記的江蘇粳稻品種遺傳距離呈極顯著線性相關(guān)（P＜0.01），表明56個(gè)核心KASP標(biāo)記可以有效代替122個(gè)高多態(tài)性KASP標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定，大大降低了檢測(cè)成本。利用56個(gè)核心KASP標(biāo)記對(duì)江蘇102份主要育成粳稻品種進(jìn)行品種檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)56個(gè)標(biāo)記組合在102份品種中可以形成102個(gè)特異的單倍型，說明102份材料能夠被完全區(qū)分，表明56個(gè)核心KASP標(biāo)記可以有效區(qū)分江蘇區(qū)域的粳稻品種，同時(shí)56個(gè)核心KASP標(biāo)記可以用于江蘇粳稻分子指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建。本研究結(jié)果對(duì)江蘇地區(qū)粳稻品種的高效鑒定和資源高效利用具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李陽陽，李 劍，周欣興，等. 新時(shí)期水稻新品種保護(hù)和DUS測(cè)試現(xiàn)狀與問題探討[J]. 中國(guó)稻米，2024，30（2）：51-56.

[2] 孔維國(guó)，王俊峰，丁漢鳳. DNA指紋數(shù)據(jù)庫在我國(guó)主要農(nóng)作物種質(zhì)資源中的應(yīng)用[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，46（4）：131-135.

[3] 唐立群，肖層林，王偉平. SNP分子標(biāo)記的研究及其應(yīng)用進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（12）：154-158.

[4] 王富強(qiáng)，樊秀彩，張 穎，等. SNP分子標(biāo)記在作物品種鑒定中的應(yīng)用和展望[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2020，21（5）：1308-1320.

[5] ALEXANDROV N， TAI S S， WANG W S， et al. SNP-Seek Database of SNPs derived from 3000 rice genomes [J]. Nucleic Acids Research，2015，43：1023-1027.

[6] CHEN H D， XIE W B， HE H， et al. A high-density SNP genotyping array for rice biology and molecular breeding [J]. Molecular Plant，2014，7（3）：541-553.

[7] 李巧英. 農(nóng)作物種子檢測(cè)中SSR與SNP分子標(biāo)記方法的比較分析[J]. 中國(guó)種業(yè)，2021（12）：48-50.

[8] 中國(guó)水稻研究所，中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心. 水稻品種真實(shí)性鑒定SNP標(biāo)記法：NY/T 2745-2021[S]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2021.

[9] 顏廷進(jìn)，蒲艷艷，張文蘭，等. 基于SNP標(biāo)記的菜豆品種真實(shí)性和純度鑒定技術(shù)[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，51（12）：111-119.

[10]KUMAR D， CHHOKAR V， SHEORAN S， et al. Characterization of genetic diversity and population structure in wheat using array based SNP markers [J]. Molecular Biology Reports，2020，47（1）：293-306.

[11]TAM N T， DWIYANTI M S， KOIDE Y， et al. Profiling SNP and nucleotide diversity to characterize mekong delta rice landraces in southeast asian populations [J]. Plant Genome，2019，12（3）：1-11.

[12]TIAN H L， YANG Y， YI H M， et al. New resources for genetic studies in maize （Zea mays L.）：a genome-wide Maize6H-60K single nucleotide polymorphism array and its application[J]. Plant Journal，2021，105（4）：1113-1122.

[13]孫正文，匡 猛，馬峙英，等. 利用CottonSNP63K芯片構(gòu)建棉花品種的指紋圖譜[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，50（24）：4692-4704.

[14]楊青青，唐家琪，張昌泉，等. KASP標(biāo)記技術(shù)在主要農(nóng)作物中的應(yīng)用及展望[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2022，38（4）：58-71.

[15]陸海燕，周 玲，林 峰，等. 基于高通量測(cè)序開發(fā)玉米高效KASP分子標(biāo)記[J]. 作物學(xué)報(bào)，2019，45（6）：872-878.

[16]李樂晨，朱國(guó)忠，蘇秀娟，等. 適于海島棉指紋圖譜構(gòu)建的SNP核心位點(diǎn)篩選與評(píng)價(jià)[J]. 作物學(xué)報(bào)，2019，45（5）：647-655.

[17]石 晗，陳子義，陳 玨，等. 54份蠶豆種質(zhì)資源主要農(nóng)藝性狀的綜合鑒定與評(píng)價(jià)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，51（20）：67-76.

[18]周玉杰，賀治洲，林秋云，等. 熱帶水稻種質(zhì)資源全生育期耐鹽性鑒定與評(píng)價(jià)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2023，54（7）：1944-1952.

[19]許園園，邢苗苗，嚴(yán)繼勇，等. 甘藍(lán)黑腐病致病菌分離與種質(zhì)資源抗性鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，50（10）：98-103.

[20]周彩霞，羅培四，孔方南，等. 木奶果種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析及DNA指紋圖譜構(gòu)建 [J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2022，53（5）：1207-1215.

[21]馬小定，崔 迪，韓 冰，等. 水稻種質(zhì)資源全基因組DNA指紋鑒定方法研究[J]. 植物遺傳資源學(xué)，2023，24（4）：1106-1113.

[22]CASTELLANA S， RANZINO L， BERITOGNOLO I， et al. Genetic characterization and molecular fingerprint of traditional umbrian tomato （Solanum lycopersicum L.） landraces through SSR markers and application for varietal identification[J]. Genetic Resources and Crop Evolution，2020，67（7）：1807-1820.

[23]HUANG X H， HAN B. Natural variations and genome-wide association studies in crop plants [J]. Annual Review of Plant Biology，2014，65：531-551.

[24]SEMAGN K， BABU R， HEARNE S， et al. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR （KASP）：overview of the technology and its application in crop improvement [J]. Molecular Breeding，2014，33（1）：1-14.

[25]魏中艷，李慧慧，李 駿，等. 應(yīng)用SNP精準(zhǔn)鑒定大豆種質(zhì)及構(gòu)建可掃描身份證[J]. 作物學(xué)報(bào)，2018，44（3）：315-323.

[26]孔維國(guó)，王俊峰，丁漢鳳，等. DNA指紋數(shù)據(jù)庫在我國(guó)主要農(nóng)作物種質(zhì)資源中的應(yīng)用[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，46（4）：131-135.

[27]吳則東，江 偉，馬龍彪. 分子標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)作物品種鑒定上的研究進(jìn)展及未來展望[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（33）：172-176.

（責(zé)任編輯：成紓寒）