精氨酸改性生物質(zhì)炭固定陰溝腸桿菌TMX-6的優(yōu)化及降解噻蟲(chóng)嗪的效果

收稿日期：2023-12-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32302406、42007133、31772197），江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX（22）3074]

作者簡(jiǎn)介：曹瑤瑤（1988-），女，山西長(zhǎng)治人，博士，助理研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地污染修復(fù)研究。（E-mail）yaoycao@jaas.ac.cn

通訊作者：張雷剛，（E-mail）leigang.zh@163.com；余向陽(yáng)，（E-mail）yuxy@jaas.ac.cn

摘要： 噻蟲(chóng)嗪的廣泛使用對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成直接或潛在的安全隱患。為實(shí)現(xiàn)殘留噻蟲(chóng)嗪的快速降解，本研究在精氨酸改性生物質(zhì)炭（Arg@BC）的基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，明確Arg@BC與陰溝腸桿菌TMX-6制備Arg@BC/TMX-6炭基菌劑的優(yōu)化方案，并對(duì)不同劑型的TMX-6對(duì)噻蟲(chóng)嗪的降解能力進(jìn)行比較。結(jié)果表明，Arg@BC中精氨酸含量與Arg@BC/TMX-6中TMX-6單位固定量呈正相關(guān)關(guān)系，對(duì)生物質(zhì)炭進(jìn)行精氨酸改性可提高生物質(zhì)炭對(duì)帶負(fù)電細(xì)菌的捕獲性能。Arg@BC/TMX-6制備的最優(yōu)條件為Arg@BC質(zhì)量濃度50 g/L、精氨酸與生物質(zhì)炭重量比5.0∶10.0、固定化12 h。Arg@BC/TMX-6對(duì)噻蟲(chóng)嗪降解率（50.69%）高于相當(dāng)量的Arg@BC與TMX-6的降解率之和，即精氨酸改性生物質(zhì)炭再固定TMX-6有利于提高TMX-6對(duì)噻蟲(chóng)嗪的降解能力。本研究結(jié)果為進(jìn)一步利用炭基材料固定降解微生物應(yīng)用于農(nóng)藥污染土壤的修復(fù)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 噻蟲(chóng)嗪；精氨酸；生物質(zhì)炭；農(nóng)藥殘留；農(nóng)藥降解

中圖分類號(hào)： X592"" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A"" 文章編號(hào)： 000-4440（2024）09-1749-09

Optimization of immobilization of Enterobacter cloacae TMX-6 by arginine-modified biochar and its degradation effect on thiamethoxam

CAO Yaoyao， GE Jing， SHENG Hongjie， FENG Fayun， WAN Qun， MA Liya， ZHANG Leigang， YU Xiangyang

（Institute of Food Safety and Nutrition， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Food Quality and Safety-State Key Laboratory Cultivation Base， Ministry of Science and Technology， Nanjing 210014， China）

Abstract： The widespread use of thiamethoxam poses a direct or potential safety hazard to the ecological environment and human health. In order to achieve the rapid degradation of residual thiamethoxam， on the basis of arginine modified biochar （Arg@BC）， the optimal preparation scheme of carbon-based microbial agent Arg@BC/TMX-6 prepared by Arg@BC and Enterobacter cloacae TMX-6 was determined by single factor and orthogonal experiments， and the degradation ability of different formulations of TMX-6 to thiamethoxam was compared. The results showed that the arginine content in Arg@BC was positively correlated with the fixed amount of TMX-6 in Arg@BC/TMX-6. Arginine modification could improve the capture performance of biochar to negatively charged bacteria. The optimal conditions for the preparation of Arg@BC/TMX-6 were as follows： the mass concentration of Arg@BC was 50 g/L， the weight ratio of arginine to biochar was 5.0∶10.0， and the immobilization time was 2 h. The degradation rate （50.69%） of thiamethoxam by Arg@BC/TMX-6 was higher than the sum of the degradation rates of Arg@BC and TMX-6， that is， arginine-modified biochar re-immobilized TMX-6 was beneficial to improve the degradation ability of TMX-6 to thiamethoxam. The results of this study provide a theoretical basis for the further use of carbon-based materials to immobilize degrading microorganisms for the remediation of pesticide-contaminated soil.

Key words： thiamethoxam;arginine;biochar;pesticide residues;pesticide degradation

新煙堿類農(nóng)藥引發(fā)的環(huán)境污染對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成嚴(yán)重威脅。噻蟲(chóng)嗪是第二代煙堿類高效低毒殺蟲(chóng)劑，被廣泛用于水稻、馬鈴薯、蘋果等作物的蟲(chóng)害防治。但噻蟲(chóng)嗪施用后近70%的藥物活性成分通過(guò)降雨、地表徑流等方式殘留于土壤及水體，導(dǎo)致土壤和水體環(huán)境惡化[1-2]，且噻蟲(chóng)嗪對(duì)蜜蜂、鳥(niǎo)類和水生動(dòng)物等具有生物毒性[3-5]。因此，加強(qiáng)噻蟲(chóng)嗪的管理及其污染農(nóng)田的治理對(duì)于生態(tài)環(huán)境安全具有重要意義。

利用微生物進(jìn)行有機(jī)污染物的生物降解是常用的污染物治理措施[6-8]。但外源微生物在自然環(huán)境中可利用營(yíng)養(yǎng)物有限及與土著微生物資源競(jìng)爭(zhēng)中的劣勢(shì)，導(dǎo)致其生存增殖受限。生物質(zhì)炭作為重要的微生物固定化材料，因其比表面積大、孔隙度高、性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在土壤原位修復(fù)領(lǐng)域具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)[9-14]。然而，生物質(zhì)炭對(duì)不同微生物活性及其生長(zhǎng)的影響存在菌株差異性，且其在營(yíng)養(yǎng)供給等方面相對(duì)欠缺[15-18]，因此，生產(chǎn)實(shí)踐中需要對(duì)生物質(zhì)炭進(jìn)行定向改性調(diào)控，以提高其性能[19-21]。由于精氨酸具有帶正電的側(cè)鏈和較高的等電點(diǎn)，因此，利用精氨酸進(jìn)行生物質(zhì)炭的改性可提高其對(duì)帶負(fù)電細(xì)菌的捕獲性能[22]。

陰溝腸桿菌TMX-6具有較強(qiáng)的噻蟲(chóng)嗪降解能力[23]。為進(jìn)一步提高TMX-6的降解性能，本研究在利用精氨酸改性生物質(zhì)炭（Arg@BC）的基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，分析精氨酸與生物質(zhì)炭重量比、改性生物質(zhì)炭（Arg@BC）質(zhì)量濃度及改性生物質(zhì)炭與TMX-6的固定化時(shí)間對(duì)制備的炭基菌劑降解噻蟲(chóng)嗪能力的影響，明確Arg@BC/TMX-6炭基菌劑的優(yōu)化制備方案，并對(duì)不同材料對(duì)噻蟲(chóng)嗪的降解能力進(jìn)行比較，解析Arg@BC/TMX-6降解噻蟲(chóng)嗪的增效機(jī)理，以期為炭基材料固定化微生物技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)藥污染土壤的修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生物質(zhì)炭與菌懸液的制備

生物質(zhì)炭（BC）購(gòu)自南京勤豐眾成生物質(zhì)新材料有限公司，噻蟲(chóng)嗪原藥（97.9%）購(gòu)自濟(jì)南綠霸農(nóng)藥有限公司，精氨酸（98.0%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（MSM）的配制：稱取0.4 g MgSO4·7H2O、0.2 g K2HPO4、0.2 g （NH4）2SO4、0.08 g CaSO4，置于容量瓶中，用去離子水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2±0.2，121 ℃高壓滅菌20 min。

稱取10 mg噻蟲(chóng)嗪原藥，用乙腈定容至10 mL，配置成1.0 g/L噻蟲(chóng)嗪溶液，于超凈工作臺(tái)中用MSM培養(yǎng)基將其稀釋，得到10 mg/L的噻蟲(chóng)嗪溶液。

精氨酸改性生物質(zhì)炭：采用Zhang等[22]方法，制備精氨酸改性生物質(zhì)炭Arg@BC，并裝袋密封備用。

LB液體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基的制備：稱取5.0 g酵母粉、10.0 g胰蛋白胨和10.0 g NaCl，加入950 mL離子水，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2，并定容至1 000 mL。在1.0 L LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂17.5 g獲得LB固體培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基均需在121 ℃高溫高壓下滅菌20 min。

菌懸液制備：將本團(tuán)隊(duì)前期篩選得到的陰溝腸桿菌TMX-6，在固體LB平板培養(yǎng)基上劃線接種，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，用接種環(huán)從斜面上剝?nèi)尉浣尤?00 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，混勻得到菌懸浮液原液，通過(guò)平板涂布計(jì)數(shù)法測(cè)得其TMX-6含量為4.17×10 0CFU/mL；采用Tecan Spark多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司產(chǎn)品）測(cè)定懸浮液600 nm處的吸光度（OD600），用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）將菌懸液進(jìn)行稀釋使得其OD600為1.00，測(cè)得其TMX-6含量為0.6×10 0CFU/mL，并作為備用菌懸浮液[23]。

1.2 炭基菌劑（Arg@BC/TMX-6）制備的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將精氨酸（Arg）與生物質(zhì)炭（BC）按重量比為0.1∶10.0、0.5∶10.0、1.5∶10.0、2.5∶10.0、5.0∶10.0和7.5∶10.0制備精氨酸改性生物質(zhì)炭（Arg@BC），改性后利用氨基酸含量檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶公司產(chǎn)品）測(cè)定改性后生物質(zhì)炭中的精氨酸含量，以明確不同的Arg與BC配制重量比對(duì)Arg@BC中精氨酸含量的影響，得到適宜的Arg與BC配制重量比。

分別稱取Arg與BC配制重量比為0.1∶10.0、0.5∶10.0、1.5∶10.0、2.5∶10.0、5.0∶10.0和7.5∶10.0的精氨酸改性生物質(zhì)炭1.25 g，利用OD600為1.00的菌懸液分別定容至25 mL，得到不同Arg與BC配制重量比下質(zhì)量濃度為50 g/L的混合溶液，于ZQZY-70BF型振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品）30 ℃恒溫固定12 h，經(jīng)離心收集固體后置于-20 ℃冰箱預(yù)凍12 h，再利用ALPHA1-2/LD-plus型真空冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Marin Christ 公司產(chǎn)品）干燥48 h即得精氨酸改性生物質(zhì)炭基菌劑（Arg@BC/TMX-6）。測(cè)定Arg與BC配制重量比對(duì)Arg@BC/TMX-6中TMX-6單位固定量（單位質(zhì)量的精氨酸改性生物質(zhì)炭所固定的菌落總數(shù)）的影響，方法是將1.0 g精氨酸改性生物質(zhì)炭基菌劑加入10 mL帶有鋼珠的無(wú)菌水中，靜置20 min，于振蕩培養(yǎng)箱200 r/min振蕩30 min，得到母液菌懸液。利用梯度稀釋法和平板計(jì)數(shù)法測(cè)定母液菌懸液中TMX-6數(shù)量，從而得到精氨酸與生物質(zhì)炭配制重量比對(duì)TMX-6單位固定量的影響。

利用上述適宜的Arg與BC配制重量比制備Arg@BC，分別稱取0.25 g、0.50 g、1.25 g、2.50 g、5.00 g、12.50 g的Arg@BC，利用OD600為1.00的菌懸液定容到25 mL，得到Arg@BC質(zhì)量濃度分別為10 g/L、20 g/L、50 g/L、100 g/L、200 g/L和500 g/L的混合溶液。然后將混合溶液置于ZQZY-70BF振蕩培養(yǎng)箱，30 ℃恒溫振蕩固定12 h，將菌株負(fù)載到生物質(zhì)炭上，通過(guò)真空冷凍干燥獲得精氨酸改性生物質(zhì)炭基菌劑。測(cè)定精氨酸改性生物質(zhì)炭基菌劑的TMX-6單位固定量，考察Arg@BC質(zhì)量濃度對(duì)TMX-6單位固定量的影響。

以Arg與BC配制重量比5.0∶10.0制備的Arg@BC，利用OD600為1.00的菌懸液定容得到Arg@BC質(zhì)量濃度為50 g/L的混合溶液，于振蕩培養(yǎng)箱30 ℃恒溫固定1 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h 后，通過(guò)真空冷凍干燥獲得精氨酸改性生物質(zhì)炭基菌劑。測(cè)定TMX-6單位固定量，考察固定時(shí)間對(duì)精氨酸改性生物質(zhì)炭基菌劑的TMX-6單位固定量的影響。

1.3 Arg@BC/TMX-6制備的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取Arg@BC質(zhì)量濃度、Arg與BC配制重量比和固定化時(shí)間3個(gè)因素各自較優(yōu)的3個(gè)水平（表1），利用SPSS 20.0軟件設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)方案（表2），進(jìn)行炭基菌劑的制備及其TMX-6單位固定量的測(cè)定。此外，取上述各處理得到的Arg@BC/TMX-6炭基菌劑0.5 g分別加入10 mL 0 mg/L噻蟲(chóng)嗪溶液，于30 ℃恒溫避光環(huán)境下180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，采用AB Sciex Exion液相色譜結(jié)合AB Sciex Qtrap 5500+三重四極質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）（美國(guó)AB SCIEX公司產(chǎn)品）方法測(cè)定培養(yǎng)液中噻蟲(chóng)嗪濃度，計(jì)算得到噻蟲(chóng)嗪降解率。每樣品測(cè)定3次。最終以TMX-6單位固定量、噻蟲(chóng)嗪降解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定Arg@BC/TMX-6炭基菌劑制備的最優(yōu)工藝條件。

培養(yǎng)液中噻蟲(chóng)嗪濃度HPLC-MS/MS檢測(cè)方法如下：取5 mL混勻的培養(yǎng)液至50 mL離心管，加入5 mL乙腈后振蕩10 min，再加入1.0 g NaCl振蕩1 min，于臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品）5 000 r/min離心5 min，吸取2 mL上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶，利用AB Sciex Exion液相色譜與AB Sciex Qtrap 5500+三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（HPLC-MS/MS）測(cè)定，色譜柱為Kinetex F5（100 cm×30 mm，2.6 μm）。具體檢測(cè)條件：流動(dòng)相為體積比4∶1的乙腈與0.1%甲酸水混合溶液，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，測(cè)定時(shí)間5 min。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源（ESI），電噴霧電離，毛細(xì)管電壓為4 000 V，霧化氣壓力310.1 kPa，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）檢測(cè)。

1.4 不同材料對(duì)噻蟲(chóng)嗪降解能力的比較

在上述正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以噻蟲(chóng)嗪降解率為依據(jù)優(yōu)選出Arg@BC/TMX-6炭基菌劑的適宜制備工藝；同時(shí)，根據(jù)適宜的質(zhì)量濃度和固定化時(shí)間，制備BC/TMX-6。根據(jù)TMX-6菌數(shù)量及材料質(zhì)量等量添加的原則，將0.5 g Arg@BC/TMX-6、0.6 mL TMX-6菌懸浮液原液、0.5 g生物質(zhì)炭（BC）、0.5 g BC/TMX-6、0.5 g Arg@BC、0.5 g Arg@BC和0.6 mL TMX-6（Arg@BC+TMX-6）、0.08 g Arg和0.42 g BC（Arg+BC）、0.08 g Arg和0.42 g BC/TMX-6（Arg+BC/TMX-6）分別加入10 mL 0 mg/L噻蟲(chóng)嗪溶液，以不添加炭基菌劑和菌液的噻蟲(chóng)嗪自然降解為對(duì)照（CK），于振蕩培養(yǎng)箱30 ℃、180 r/min恒溫避光培養(yǎng)3 d，采用HPLC-MS/MS方法測(cè)定初始溶液中和培養(yǎng)3 d后溶液中噻蟲(chóng)嗪質(zhì)量濃度，進(jìn)而計(jì)算得到各處理下噻蟲(chóng)嗪的降解率。

1.5 生物質(zhì)炭固定化TMX-6的掃描電鏡表征

電鏡掃描TMX-6菌體樣品制備：活化培養(yǎng)TMX-6至OD600值為1.00，5 000 r/min離心5 min，PBS洗滌3次后加入2.5%戊二醛，4 ℃固定12 h；并于5 000 r/min離心5 min，PBS溶液清洗3次，按乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%的順序梯度脫水，每次加入后靜置15 min，5 000 r/min離心5 min，最后100%乙醇洗滌3次得到TMX-6重懸菌液。吸取TMX-6重懸菌液滴加于玻片表面，保鮮膜封口后烘箱烘干，轉(zhuǎn)移至樣品臺(tái)，另將真空冷凍干燥后的Arg@BC/TMX-6炭基菌劑和BC/TMX-6炭基菌劑平鋪在樣品臺(tái)上，進(jìn)行噴金處理。使用EVO LS10場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（德國(guó)蔡司公司產(chǎn)品）觀察TMX-6在培養(yǎng)液和炭基材料上的微觀結(jié)構(gòu)。

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Excel 2016和Origin 9.0軟件繪制圖、表，利用SPSS 20.0軟件和Duncan’s檢驗(yàn)法進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 Arg@BC/TMX-6制備的單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同精氨酸（Arg）與生物質(zhì)炭（BC）重量比處理下制得的精氨酸改性生物質(zhì)炭（Arg@BC）中精氨酸含量變化如圖1所示。從圖中可以看出，當(dāng)Arg與BC重量比由0.1∶10.0增加到5.0∶10.0時(shí)，Arg@BC中精氨酸含量逐步升高，Arg與BC重量比為5.0∶10.0時(shí)，Arg@BC中精氨酸含量達(dá)到最大值（15.91%）；而當(dāng)Arg 與BC重量比進(jìn)一步增加至7.5∶10.0時(shí)，Arg@BC中精氨酸含量沒(méi)有顯著變化。因此，制備精氨酸改性生物質(zhì)炭的精氨酸與生物質(zhì)炭最適重量比為5.0∶10.0。產(chǎn)生該結(jié)果的主要原因是精氨酸改性生物質(zhì)炭主要通過(guò)精氨酸與生物質(zhì)炭上官能團(tuán)（-NH2、-COOH等）的絡(luò)合作用[23]，而生物質(zhì)炭上官能團(tuán)數(shù)量是一定的，且官能團(tuán)間在結(jié)合過(guò)程中存在空間位阻，導(dǎo)致絡(luò)合飽和后進(jìn)一步增加精氨酸時(shí)，新增的Arg無(wú)法與生物質(zhì)炭絡(luò)合。

不同精氨酸與生物質(zhì)炭重量比的精氨酸改性生物質(zhì)炭制備的Arg@BC/TMX-6炭基菌劑中TMX-6單位固定量如圖2所示。從圖中可以看出，隨著精氨酸與生物質(zhì)炭重量比由0.1∶10.0增加至5.0∶10.0，Arg@BC/TMX-6中TMX-6單位固定量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)Arg 與BC重量比達(dá)5.0∶10.0時(shí)，Arg@BC/TMX-6中TMX-6菌單位固定量高達(dá)4.48×10 0CFU/g。當(dāng)Arg與 BC重量比進(jìn)一步提高至7.5∶10.0時(shí)，Arg@BC/TMX-6中TMX-6單位固定量沒(méi)有顯著變化。由于Arg具有帶正電的側(cè)鏈和較高的等電點(diǎn)，利用精氨酸改性可提高生物質(zhì)炭對(duì)帶負(fù)電細(xì)菌的捕獲性能[23]，且生物質(zhì)炭對(duì)微生物的吸附性能與其表面電荷數(shù)量呈顯著正相關(guān)[24-25]。從圖1和圖2還可以看出，隨著精氨酸與生物質(zhì)炭重量比的變化，Arg@BC/TMX-6中Arg含量與TMX-6單位固定量有相同的變化趨勢(shì)，這說(shuō)明，兩者之間存在正相關(guān)關(guān)系。

生物質(zhì)炭作為吸附性能良好的材料，具有較高的比表面積和豐富的孔隙結(jié)構(gòu)，為微生物附著提供了充足的吸附位點(diǎn)[25]。精氨酸改性生物質(zhì)炭質(zhì)量濃度對(duì)Arg@BC/TMX-6炭基菌劑中TMX-6單位固定量的影響如圖3所示。從圖中可以看出，當(dāng)精氨酸改性生物質(zhì)炭質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，制備的炭基菌劑中TMX-6單位固定量最高；隨著精氨酸改性生物質(zhì)炭質(zhì)量濃度的增加，制備的炭基菌劑中TMX-6單位固定量逐步降低。產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能是精氨酸改性生物質(zhì)炭質(zhì)量濃度相對(duì)菌懸液中TMX-6數(shù)量始終處于過(guò)飽和狀態(tài)，精氨酸改性生物質(zhì)炭質(zhì)量濃度對(duì)Arg@BC/TMX-6中TMX-6單位固定量的影響表現(xiàn)出一定的飽和效應(yīng)。此外，本研究制備的Arg@BC/TMX-6炭基菌劑對(duì)TMX-6菌的單位固定量達(dá)1×10 0CFU/g數(shù)量級(jí)，與任宏洋等[26]的研究結(jié)果一致。

固定時(shí)間對(duì)Arg@BC/TMX-6中TMX-6單位固定量的影響如圖4所示。從圖中可以看出，隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng)，精氨酸改性生物質(zhì)炭中TMX-6單位固定量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。固定時(shí)間為12 h時(shí)，精氨酸改性生物質(zhì)炭中TMX-6單位固定量最高。其原因可能是當(dāng)固定時(shí)間小于12 h時(shí)，精氨酸改性生物質(zhì)炭主要表現(xiàn)為吸附TMX-6，直至12 h時(shí)TMX-6固定量達(dá)到吸附飽和。此后進(jìn)一步延長(zhǎng)固定時(shí)間，TMX-6固定量將顯著降低，主要原因可能有兩個(gè)，一是精氨酸改性生物質(zhì)炭中營(yíng)養(yǎng)成分有限，短時(shí)間內(nèi)菌株TMX-6可逐步吸附，而在時(shí)間延長(zhǎng)后，細(xì)菌生長(zhǎng)所需養(yǎng)分的減少，導(dǎo)致部分菌株產(chǎn)生衰亡和細(xì)菌數(shù)量下降；二是細(xì)菌固定在生物質(zhì)炭上為動(dòng)態(tài)過(guò)程，即存在吸附-解吸附作用，在固定初始階段，載體固定化菌株主要表現(xiàn)為吸附優(yōu)勢(shì)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，菌株在生物質(zhì)炭載體上以解吸附為主，故生物質(zhì)炭載體固定菌株過(guò)程是先增加后減少。因此，本研究中最優(yōu)固定化時(shí)間宜選取12 h。

2.2 Arg@BC/TMX-6制備的正交試驗(yàn)結(jié)果

Arg@BC/TMX-6炭基菌劑制備正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。從表中可以看出，精氨酸改性生物質(zhì)炭質(zhì)量濃度10 g/L、精氨酸與生物質(zhì)炭重量比7.5∶10.0、固定時(shí)間12 h的3號(hào)處理制備的Arg@BC/TMX-6中TMX-6單位固定量最高，達(dá)5.88×10 0 CFU/g。結(jié)合3個(gè)因素3個(gè)水平下的TMX-6單位固定量平均值（表4）可知，3個(gè)因素對(duì)TMX-6單位固定量影響從高到低依次為：精氨酸改性生物質(zhì)炭質(zhì)量濃度、固定時(shí)間、精氨酸與生物質(zhì)炭重量比，即精氨酸改性生物質(zhì)炭質(zhì)量濃度對(duì)Arg@BC/TMX-6中TMX-6單位固定量影響最大。這說(shuō)明，精氨酸改性生物質(zhì)炭表面吸附位點(diǎn)的飽和效應(yīng)在固定化過(guò)程中起著決定性作用。從TMX-6單位固定量角度考慮，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，預(yù)測(cè)的優(yōu)化方案為精氨酸改性生物質(zhì)炭質(zhì)量濃度10 g/L、Arg∶BC重量比5.0∶10.0、固定時(shí)間12 h。

精氨酸改性生物質(zhì)炭質(zhì)量濃度50 g/L、精氨酸與生物質(zhì)炭重量比5.0∶10.0、固定化時(shí)間12 h條件下制備的Arg@BC/TMX-6降解噻蟲(chóng)嗪的效果最好，降解率為50.69%，顯著高于其他處理（表3）。3個(gè)因素3個(gè)水平下的噻蟲(chóng)嗪降解率平均值如表5所示。從表5中可以看出，3個(gè)因素對(duì)噻蟲(chóng)嗪降解率的影響從高到低依次為精氨酸改性生物質(zhì)炭質(zhì)量濃度、固定時(shí)間、精氨酸與生物質(zhì)炭重量比，即精氨酸改性生物質(zhì)炭質(zhì)量濃度對(duì)Arg@BC/TMX-6降解噻蟲(chóng)嗪的效果影響最大。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果得到的噻蟲(chóng)嗪降解率建立響應(yīng)面，預(yù)測(cè)的Arg@BC/TMX-6炭基菌劑最優(yōu)制備方案與處理5一致。噻蟲(chóng)嗪的降解過(guò)程主要依賴微生物的降解作用，一般來(lái)說(shuō)，TMX-6固定量越多，噻蟲(chóng)嗪降解率越高。本試驗(yàn)中處理5的TMX-6單位固定量（4.96×10 0CFU/g）顯然低于處理3（5.69×10 0CFU/g），但其噻蟲(chóng)嗪降解率卻顯著高于處理3。造成這種現(xiàn)象的原因可能是噻蟲(chóng)嗪降解率不但受TMX-6固定量的影響，還與環(huán)境pH值相關(guān)。處理5反應(yīng)液的堿性更強(qiáng)，有利于促進(jìn)噻蟲(chóng)嗪的降解，這與Li等[27]的研究結(jié)果一致。所以，本研究選取處理5的制備方案，即精氨酸改性生物質(zhì)炭質(zhì)量濃度50 g/L、精氨酸與生物質(zhì)炭重量比5.0∶10.0、固定時(shí)間12 h，為Arg@BC/TMX-6炭基菌劑的最優(yōu)制備方案。

2.3 Arg@BC/TMX-6中TMX-6的表征

TMX-6在培養(yǎng)液和精氨酸改性生物質(zhì)炭上的微觀結(jié)構(gòu)如圖5所示。從培養(yǎng)液中分離收集到的TMX-6呈桿狀、兩端鈍圓形，直徑約0.4 μm，長(zhǎng)度約1.0 μm，屬典型的腸桿菌結(jié)構(gòu)（圖5A1和圖5A2）。生物質(zhì)炭因其Zeta電位高、比表面積和孔隙度大，容易吸附微生物，是微生物良好的棲息地[25-26]。TMX-6在生物質(zhì)炭表面附著時(shí)，呈現(xiàn)零星的散落菌體分布，如圖5B1和圖5B2所示。TMX-6在精氨酸改性生物質(zhì)炭（Arg@BC）表面附著時(shí)，雖然不同部位的TMX-6附著量存在一定的差異，但總體的附著數(shù)量明顯增加（圖5C1和圖5C2），即精氨酸改性能顯著提高生物質(zhì)炭上TMX-6的固定量。

2.4 不同劑型TMX-6對(duì)噻蟲(chóng)嗪降解能力的比較

不同劑型TMX-6對(duì)噻蟲(chóng)嗪降解能力如圖6所示。從圖6可以看出，Arg@BC/TMX-6炭基菌劑處理的噻蟲(chóng)嗪降解率為50.69%，顯著高于其他處理，其次為TMX-6處理、Arg+BC/TMX-6處理和BC/TMX-6處理；而Arg@BC、BC、Arg+BC、Arg@BC+TMX-6等處理的噻蟲(chóng)嗪降解率與噻蟲(chóng)嗪自然降解對(duì)照（CK）無(wú)顯著差異。這說(shuō)明精氨酸、生物質(zhì)炭對(duì)噻蟲(chóng)嗪降解沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用，菌株TMX-6是噻蟲(chóng)嗪降解的主導(dǎo)因子。圖6中還可以看出，Arg@BC+TMX-6處理對(duì)噻蟲(chóng)嗪的降解率顯著低于TMX-6處理，可能是由于Arg@BC的強(qiáng)堿性降低了TMX-6的存活率和生物活性，導(dǎo)致其噻蟲(chóng)嗪降解率降低。加入TMX-6后，噻蟲(chóng)嗪降解率得到顯著提升，Arg+BC/TMX-6處理、TMX-6及BC/TMX-6的噻蟲(chóng)嗪降解率分別為24.52%、26.92%、27.64%，均高于CK，但3個(gè)處理間噻蟲(chóng)嗪降解率沒(méi)有顯著差異，表明精氨酸作為外源添加物時(shí)，不能增強(qiáng)BC/TMX-6對(duì)噻蟲(chóng)嗪的降解效果，其原因可能是添加精氨酸并未提升生物質(zhì)炭對(duì)TMX-6的捕獲性能，雖然添加精氨酸可為TMX-6提供營(yíng)養(yǎng)源，但噻蟲(chóng)嗪降解效果沒(méi)有明顯增效說(shuō)明TMX-6難以利用游離的精氨酸。

此外，Arg@BC/TMX-6對(duì)噻蟲(chóng)嗪的降解率（50.69%）顯著高于相當(dāng)量的精氨酸改性生物質(zhì)炭（Arg@BC）和TMX-6的降解率之和，具有“1+1＞2”的增效作用，原因可能是一方面精氨酸改性生物質(zhì)炭可以為微生物提供一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于提高微生物的生物活性[28]；另一方面精氨酸改性生物質(zhì)炭通過(guò)高吸附性能捕獲噻蟲(chóng)嗪分子，有利于促進(jìn)降解菌TMX-6對(duì)其降解[29-31]。

3 結(jié)論

精氨酸與生物質(zhì)炭重量比為5.0∶10.0時(shí)制備的精氨酸改性生物質(zhì)炭（Arg@BC）中精氨酸含量最高，主要原因?yàn)榫彼崤c生物質(zhì)炭上官能團(tuán)（-NH2、-COOH等）的絡(luò)合存在空間位阻效應(yīng)，該條件下結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到平衡。同時(shí)，Arg@BC中精氨酸含量與Arg@BC/TMX-6中TMX-6單位固定量呈正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明精氨酸改性可提高生物質(zhì)炭對(duì)帶負(fù)電細(xì)菌的捕獲性能。

精氨酸改性生物質(zhì)炭（Arg@BC）的質(zhì)量濃度由10 g/L增加至500 g/L，TMX-6單位固定量呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢(shì)，而隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng)，TMX-6單位固定量呈先增后減的趨勢(shì)，原因主要是Arg@BC的添加量相對(duì)TMX-6數(shù)量始終處于過(guò)飽和狀態(tài)，而菌株固定化是動(dòng)態(tài)過(guò)程，即存在吸附-解吸附作用。在固定初始階段，Arg@BC載體主要表現(xiàn)為吸附優(yōu)勢(shì)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，菌株在Arg@BC載體上以解吸附為主。結(jié)合TMX-6單位固定量和噻蟲(chóng)嗪降解率的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終優(yōu)選的精氨酸改性生物質(zhì)炭基菌劑制備條件為Arg@BC質(zhì)量濃度50 g/L、精氨酸與生物質(zhì)炭重量比5.0∶10.0.0、固定化時(shí)間12 h。

Arg@BC/TMX-6炭基菌劑對(duì)噻蟲(chóng)嗪降解率（50.69%）高于相當(dāng)量的Arg@BC和菌株TMX-6的噻蟲(chóng)嗪降解率之和，即利用精氨酸進(jìn)行生物質(zhì)炭改性，再進(jìn)行TMX-6固定制備的精氨酸改性生物質(zhì)炭基菌劑具有“1+1＞2”的增效作用，表明生物質(zhì)炭經(jīng)過(guò)精氨酸改性后可以顯著增強(qiáng)生物質(zhì)炭固定噻蟲(chóng)嗪降解菌TMX-6能力，進(jìn)而提高其對(duì)噻蟲(chóng)嗪的降解率。本研究結(jié)果為進(jìn)一步利用炭基材料進(jìn)行農(nóng)藥污染土壤修復(fù)提供支撐和依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 田 雨. 毒死蜱污染土壤的固定化微生物強(qiáng)化修復(fù)研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

[2] 董素俠. 韭菜植株對(duì)噻蟲(chóng)嗪的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2021.

[3] CHENG H， TANG G， WANG S， et al. Combined remediation effects of biochar and organic fertilizer on immobilization and dissipation of neonicotinoids in soils[J]. Environment International，2022，169：107500.

[4] JACTEL H， VERHEGGEN F， THIRY D， et al. Alternatives to neonicotinoids[J]. Environment International， 2019，129：423-429.

[5] RADOLINSKI J， WU J， XIA K， et al. Plants mediate precipitation-driven transport of a neonicotinoid pesticide[J]. Chemosphere，2019，222：445-452.

[6] 韓永和，何睿文，李 超，等. 鄰苯二甲酸酯降解細(xì)菌的多樣性、降解機(jī)理及環(huán)境應(yīng)用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016，11（2）：37-49.

[7] 沈 思，王曉瑜，王海霞，等. 細(xì)菌降解鄰苯二甲酸酯的研究進(jìn)展[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2019，35（11）：2104-2120.

[8] MAHTO K U， VANDANA， PRIYADARSHANEE M， et al. Bacterial biofilm and extracellular polymeric substances in the treatment of environmental pollutants：Beyond the protective role in survivability[J]. Journal of Cleaner Production，2022，379：134759.

[9] FENG F， CHEN X， WANG Q， et al. Use of Bacillus-siamensis-inoculated biochar to decrease uptake of dibutyl phthalate in leafy vegetables[J]. Journal of Environmental Management，2020，253：109636.

[10]LIU J， YU M， QU Y， et al. Compensation of the magnetic force imaging by scanning directions[J]. Micron，2017，102：15-20.

[11]XIONG B， ZHANG Y， HOU Y， et al. Enhanced biodegradation of PAHs in historically contaminated soil by M. gilvum inoculated biochar[J]. Chemosphere，2017，182：316-324.

[12]遲青山. 生物炭與細(xì)菌微生物互作對(duì)小白菜生長(zhǎng)的影響及益生菌的分離表征[D]. 沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

[13]MUKHERJEE S， SARKAR B， ARALAPPANAVAR V K， et al. Biochar-microorganism interactions for organic pollutant remediation：challenges and perspectives[J]. Environmental Pollution，2022，308：119609.

[14]楊宗政，許文帥，吳志國(guó)，等. 微生物固定化及其在環(huán)境污染治理中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2020，47（12）：4278-4292.

[15]LIU H， WANG X， SONG X， et al. Generalists and specialists decomposing labile and aromatic biochar compounds and sequestering carbon in soil[J]. Geoderma，2022，428：116176.

[16]THUNSHIRN P， WENZEL W W， PFEIFER C. Pore characteristics of hydrochars and their role as a vector for soil bacteria：a critical review of engineering options[J]. Critical Reviews in Environmental Science and Technology，2022，52（23）：4147-4171.

[17]楊彩霞. 混合生物炭固定化微生物降解土壤中PAHs[D]. 沈陽(yáng)：遼寧大學(xué)，2022.

[18]ZHENG X， XU W， DONG J， et al. The effects of biochar and its applications in the microbial remediation of contaminated soil：a review[J]. Journal of Hazardous Materials，2022，438：129557.

[19]張秀霞，秦麗姣，黃聰聰，等. 微生物固定化載體的選擇及其性能[J]. 化工進(jìn)展，2011，30（12）：2781-2786.

[20]李振偉. 改性生物炭固定化微生物對(duì)石油污染土壤的修復(fù)研究[D]. 青島：中國(guó)石油大學(xué)（華東），2018.

[21]WU C， ZHI D， YAO B， et al. Immobilization of microbes on biochar for water and soil remediation：a review[J]. Environmental Research，2022，212：113226.

[22]ZHANG M， HE L， ZHANG X， et al. Improved removal performance of gram-negative and gram-positive bacteria in sand filtration system with arginine modified biochar amendment[J]. Water Research，2022，211：118006.

[23]詹紅林，葛 靜，程江峰，等.內(nèi)生菌定殖水稻對(duì)稻田土壤中毒死蜱降解的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（14）：278-282.

[24]黃 茜. 生物質(zhì)炭固定化微生物對(duì)水中壬基酚的去除效果研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2017.

[25]任 靜，沈佳敏，張 磊，等. 生物炭固定化多環(huán)芳烴高效降解菌劑的制備及穩(wěn)定性[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2020，40（12）：4517-4523.

[26]任宏洋，馬伶俐，王 兵，等. 生物炭基固定化菌劑對(duì)石油類污染物的高效降解[J]. 環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2017，11（11）：6177-6183.

[27]LI Y， SU P， LI Y， et al. Adsorption-desorption and degradation of insecticides clothianidin and thiamethoxam in agricultural soils[J]. Chemosphere，2018，207：708-714.

[28]ZHANG M， XIA H， RIAZ M， et al. Various beneficial microorganisms colonizing on the surface of biochar primarily originated from the storage environment rather than soil environment[J]. Applied Soil Ecology，2023，182：104700.

[29]元妙新. 固定化細(xì)菌增強(qiáng)修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤及影響因素[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2011.

[30]趙淑雯，張倩茹，張楚晨，等. 土壤污染修復(fù)中的生物炭-微生物交互作用研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2023，42（7）：1423-1435.

[31]FENG F， SUN X， JIANG W， et al. Stenotrophomonas pavanii DJL-M3 inoculated biochar stabilizes the rhizosphere soil homeostasis of carbendazim-stressed rice[J]. Environmental Pollution，2023，329：121723.

（責(zé)任編輯：石春林）