不同提取方法提取馬鈴薯蛋白的研究

摘要：該實(shí)驗(yàn)以新鮮馬鈴薯為原料，采用醇溶法、鹽溶法、堿溶法3種方法提取馬鈴薯蛋白，測(cè)定其純度和提取率，結(jié)果表明，醇溶法提取的馬鈴薯蛋白純度為94.5%，提取率為4.5%，提取效果最好。通過(guò)SDS-PAGE電泳分析，醇溶法提取的馬鈴薯蛋白亞基條帶多，分子量范圍廣，并且在分子量為25～40 kDa范圍內(nèi)含量很高，說(shuō)明醇溶法能有效提取馬鈴薯蛋白質(zhì)的各個(gè)組分；進(jìn)一步研究其理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)醇溶法提取的蛋白質(zhì)持油性、持水性、乳化性、乳化穩(wěn)定性更好；水解度分析顯示醇溶法提取的馬鈴薯蛋白水解度更高。因此，在這3種方法中，醇溶法是比較經(jīng)濟(jì)、所得蛋白質(zhì)性質(zhì)較好的提取方法。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯蛋白質(zhì)；提取方法；功能特性；水解度

中圖分類(lèi)號(hào)：TS215 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號(hào)：1000-9973（2024）09-0054-05

Study on Extraction of Protein from Potato by Different Extraction Methods

ZHANG Yu-xuan1，2， LI Hua-xin1，2， CHEN Ying1，2， MA Jin-pu1，2，

GUO Xing-chen1，2， FAN Pei-ru3， GAO Dan-dan1，2*

（1.China-Malaysia National Joint Laboratory， Biomedical Research Center， Northwest Minzu University，

Lanzhou 730030， China; 2.College of Life Science and Engineering， Northwest Minzu University，

Lanzhou 730124， China; 3.College of Chemistry， Sichuan University， Chengdu 610207， China）

Abstract： In this experiment， with fresh potatoes as the raw materials， potato protein is extracted by three methods such as alcohol dissolution method， salt dissolution method， alkali dissolution method， and its purity and extraction rate are determined. The results show that the purity of potato protein extracted by alcohol dissolution method is 94.5%， the extraction rate is 4.5%， and the extraction effect is the best. SDS-PAGE electrophoresis analysis shows that the potato protein extracted by alcohol dissolution method has many subunit bands， a wide range of molecular weights， and a high content in the molecular weight range of 25～40 kDa， indicating that alcohol dissolution method could effectively extract various components of potato protein. Further research on its physicochemical properties shows that the protein extracted by alcohol dissolution method has better oil holding capacity， water holding capacity， emulsibility and emulsification stability. Hydrolysis analysis shows that potato protein extracted by alcohol dissolution method has a higher degree of hydrolysis. Therefore， among the three methods， alcohol dissolution method is a more economical extraction method to obtain protein with better properties.

Key words： potato protein; extraction method; functional characteristics; degree of hydrolysis

收稿日期：2024-03-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項(xiàng)目（31960461）；蘭州市城關(guān)區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022JSCX0011）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（31920230153）；甘肅省青年博士基金項(xiàng)目（2023QB-001）

作者簡(jiǎn)介：張鈺璇（1999—），女，碩士，研究方向：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。

*通信作者：高丹丹（1983—），女，教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。

馬鈴薯是一年生草本植物，與胡椒、茄子、番茄等屬同一科。在上百種茄科植物中，馬鈴薯是少數(shù)幾個(gè)塊莖植物之一[1-2]。馬鈴薯目前為第四大糧食作物，僅次于小麥、水稻和玉米，中國(guó)的馬鈴薯種植面積和鮮薯產(chǎn)量均居世界首位，且均占世界的1/4[3]。馬鈴薯蛋白含有豐富的必需氨基酸，賴(lài)氨酸含量可達(dá)6.7%～10.10%[4]，將馬鈴薯作為主食可以補(bǔ)足以小麥和大米作為主食的缺陷。目前已有的馬鈴薯蛋白提取方法包括酸熱沉淀法、超濾法、酶法等，使用范圍較廣的方法是酸熱沉淀法，但在實(shí)際應(yīng)用中存在處理工藝較復(fù)雜、易使馬鈴薯蛋白失活的問(wèn)題[5]；超濾法適合大規(guī)模生產(chǎn)馬鈴薯蛋白，但在工業(yè)生產(chǎn)中超濾膜的清洗成本偏高，仍需要開(kāi)發(fā)出價(jià)格低廉的濾膜從而降低成本[6]；酶法作用條件溫和，能保持蛋白質(zhì)的活性，但目前酶的來(lái)源較單一，在工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)中技術(shù)不是很成熟，有待進(jìn)一步提高[7]。

本實(shí)驗(yàn)主要采用醇溶法、鹽溶法和堿溶法提取馬鈴薯蛋白質(zhì)，通過(guò)SDS-PAGE電泳分析蛋白質(zhì)組分，并對(duì)不同方法提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能性和水解度測(cè)定，以期選擇更有效的馬鈴薯蛋白提取方法，為今后馬鈴薯蛋白的綜合開(kāi)發(fā)利用和功能性產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯：購(gòu)于蘭州市榆中縣福潤(rùn)德超市。

1.2 試劑

甘氨酸：美國(guó)Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)G250、蛋白Marker、牛血清白蛋白：北京索萊寶科技有限公司；木瓜蛋白酶：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

Fresco17超速離心機(jī) Thermo Fisher Scientific公司；Scientz-10YG/A冷凍干燥機(jī) 寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司；KDN-08消化爐 上海新嘉電子有限公司；Kjeltec 8200凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 馬鈴薯蛋白提取

1.4.1.1 醇溶法

參考張旭等[8]的方法，取1 kg體積為1 cm3的馬鈴薯塊，加入250 mL 75%乙醇和0.3 g NaHSO3[9]。徹底破碎后于25 ℃水浴浸提2 h，過(guò)濾，濾液以7 000 r/min離心15 min，取上清液即為蛋白質(zhì)醇溶液，調(diào)節(jié)pH值為4.5，于30 ℃水浴1 h后以6 000 r/min離心15 min，將沉淀冷凍干燥備用。

1.4.1.2 鹽溶法

參考祝海娟等[10]和齊斌等[11]的方法。取1 kg馬鈴薯塊，加入0.8 g NaCl和0.3 g NaHSO3混入250 mL蒸餾水，破碎、過(guò)濾、離心后取上清液，調(diào)節(jié)pH值為4.5，30 ℃水浴1 h后以6 000 r/min離心15 min，將沉淀冷凍干燥備用。

1.4.1.3 堿溶法

參考馬祥林[12]和姚佳[13]的方法。取1 kg馬鈴薯塊，加入0.3 g NaHSO3和250 mL蒸餾水，破碎、過(guò)濾、離心后取上清液，調(diào)節(jié)pH值為8.5，于30 ℃水浴浸提1 h，調(diào)節(jié)pH值為4.5，于30 ℃水浴1 h后以6 000 r/min離心15 min，取沉淀并將其洗滌至中性，冷凍干燥備用。

1.4.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[14]。

蛋白質(zhì)純度（%）=m2m1。

蛋白質(zhì)提取率（%）=m1m3。

式中：m1為實(shí)際提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）；m2為凱氏定氮法測(cè)得的蛋白質(zhì)含量（g）；m3為使用的馬鈴薯總質(zhì)量（g）。

1.4.3 馬鈴薯蛋白的SDS-PAGE分析

參照Fairbanks等[15]的凝膠電泳法，將醇溶法、鹽溶法、堿溶法提取的馬鈴薯蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.4.4 蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的測(cè)定

1.4.4.1 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

參照范廣琦等[16]所述方法攪打馬鈴薯蛋白并測(cè)定馬鈴薯蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

起泡性（%）=V1V0×100%。

泡沫穩(wěn)定性（%）=V2V1×100%。

式中：V0為蛋白質(zhì)溶液體積（mL）；V1為攪打后的泡沫體積（mL）；V2為放置30 min后的泡沫體積（mL）。

1.4.4.2 持水性和持油性的測(cè)定

參照Chandi等[17]的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定。

持水性（g/g）=m2-m1m。

持油性（g/g）=m4-m3m。

式中：m為蛋白樣品質(zhì)量（g）；m1為吸水前蛋白質(zhì)和離心管質(zhì)量（g）；m2為吸水后蛋白質(zhì)和離心管質(zhì)量（g）；m3為吸油前蛋白質(zhì)和離心管質(zhì)量（g）；m4為吸油后蛋白質(zhì)和離心管質(zhì)量（g）。

將上述的水換成色拉油，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的溫度為20，30，40，50，60，70，80，90，100 ℃，按同樣的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即可測(cè)定吸油性。

1.4.4.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參照程贊等[18]的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定。

乳化性（EAI）=H2H1×100%。

乳化穩(wěn)定性（ESI）=H4H3×100%。

式中：H1為試管中樣品溶液的高度（cm）；H2為試管中乳化層的高度（cm）；H3為離心前乳化層的高度（cm）；H4為離心后乳化層的高度（cm）。

1.4.5 水解度的測(cè)定

將3種方法所得的馬鈴薯蛋白質(zhì)溶解，調(diào)節(jié)pH值為6.8，配制成2%的蛋白質(zhì)溶液，使用木瓜蛋白酶在65 ℃條件下分別水解1，2，3，4，5 h后，在100 ℃水浴15 min滅酶，采用茚三酮比色法測(cè)定水解度[19]，水解度計(jì)算公式如下：

DH（%）=hhtot×100%。

式中：DH為水解度（%）；h為水解后每克蛋白被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)（mmol/g）；htot為每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)（mmol/g）。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

利用IBM SPSS Statistics 21軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用Origin 2021軟件進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取馬鈴薯蛋白質(zhì)的純度和提取率

由圖1可知，醇溶法提取的馬鈴薯蛋白質(zhì)提取率和純度都高于鹽溶法；而堿溶法作為蛋白質(zhì)的常用提取方法，在提取馬鈴薯蛋白質(zhì)時(shí)的提取率較高，但是純度較低。相較于這兩種方法，醇溶法得到的蛋白質(zhì)提取率和純度最高，變性程度小[20]，有利于生產(chǎn)。

2.2 不同方法提取馬鈴薯蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳分析

利用SDS-PAGE電泳法分析3種提取方法得到的馬鈴薯蛋白質(zhì)的組成，見(jiàn)圖2。

由圖2可知，3種提取方法所得到的亞基條帶分布均勻，但是3種方法所得的亞基差異顯著。在分子量為25～40 kDa范圍內(nèi)醇溶法提取的蛋白含量相較于其他兩種方法高，并且所得亞基條帶比其他兩種多。堿溶法提取蛋白分子量分布在25～40 kDa和85～150 kDa，鹽溶法提取蛋白分子量分布在25～40 kDa和85～150 kDa，兩種提取方法都在分子量為25～40 kDa和85～150 kDa之間較集中。醇溶法提取的蛋白質(zhì)分布較廣且在10～40 kDa和100～150 kDa之間比較集中。綜上可知，醇溶法能夠更高效地提取馬鈴薯蛋白的組成成分。

2.3 不同提取方法對(duì)蛋白質(zhì)理化特性的影響

2.3.1 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

由圖3中a可知，在pH接近馬鈴薯蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)起泡性低，但采用堿溶法所得的馬鈴薯蛋白起泡性始終高于醇溶法和鹽溶法；隨著pH的增加，蛋白質(zhì)的起泡性均有所提升，在pH為8時(shí)最大，鹽溶法和醇溶法的蛋白質(zhì)起泡性均低于堿溶法；pH處于8～10范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的起泡性都有一定程度的降低，但是使用堿溶法得到的蛋白質(zhì)性質(zhì)更穩(wěn)定，這是因?yàn)殡x蛋白質(zhì)等電點(diǎn)較遠(yuǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間靜電斥力增強(qiáng)，疏水作用減弱，溶解度增強(qiáng)，使得蛋白質(zhì)分子能夠快速在氣-液界面展開(kāi)、重排，有利于氣泡的形成[21]，蛋白質(zhì)泡沫是由液膜包裹氣體而形成的。pH值、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、溶解度、離子強(qiáng)度等因素都影響起泡性和泡沫穩(wěn)定性[21]。起泡性是指蛋白質(zhì)產(chǎn)品攪打生成泡沫的能力；泡沫穩(wěn)定性則反映泡沫存在的持久性。一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)的起泡性影響面包、蛋糕等食品加工過(guò)程，起泡性和泡沫穩(wěn)定性好的蛋白產(chǎn)品可作為良好的起泡劑用于改善烘焙食品的質(zhì)構(gòu)，保證食品口感的舒適[22]。

由圖3中b可知，馬鈴薯蛋白在pH達(dá)到等電點(diǎn)時(shí)，泡沫穩(wěn)定性最大，并且3種方法中堿溶法得到的蛋白質(zhì)泡沫穩(wěn)定性最高，隨著pH的升高，3種方法所得的蛋白質(zhì)泡沫穩(wěn)定性均下降。蛋白質(zhì)的泡沫穩(wěn)定性因?yàn)榈鞍踪|(zhì)所處環(huán)境及蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)的變化而變化，同時(shí)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性受液膜的強(qiáng)度大小和氣體透過(guò)這層液膜的擴(kuò)散速度快慢的影響，還與泡沫的表面電荷性質(zhì)有關(guān)[23]。而鹽溶法和醇溶法提取的蛋白質(zhì)泡沫穩(wěn)定性較小，可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)泡沫因?yàn)榇笮〔煌a(chǎn)生壓力差或者多個(gè)氣泡聚集合并，從而使得蛋白質(zhì)泡沫失穩(wěn)消散[24]。因此，考慮馬鈴薯的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，可以采用堿溶法進(jìn)行提取。

2.3.2 持油性和持水性

由圖4中a可知，在反應(yīng)體系溫度為25 ℃時(shí)，3種方法提取的蛋白質(zhì)持油性均最高，其中醇溶法提取的蛋白質(zhì)持油性最高，可達(dá)1.31 g/g；隨著溫度的上升，促進(jìn)蛋白質(zhì)變性，使得蛋白質(zhì)的持油性呈下降趨勢(shì)，在體系溫度達(dá)95 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)的持油性最低。蛋白質(zhì)的持油性是指蛋白質(zhì)能夠吸附油脂的能力，是非極性脂肪族鏈與蛋白質(zhì)非極性區(qū)之間的疏水性相互作用的結(jié)果[25-26]。

由圖4中b可知，在pH為2～4范圍內(nèi)，3種方法所得的蛋白質(zhì)持水性隨著pH的升高而降低，在pH達(dá)到等電點(diǎn)4左右時(shí)，蛋白質(zhì)的持水性最低，醇溶法提取的蛋白持水性較高，為2.74 g/g，在pH為4～10之間時(shí)，隨著pH的升高，蛋白質(zhì)的持水性也隨之升高，其中醇溶法提取的蛋白質(zhì)持水性上升趨勢(shì)更明顯。持水能力是指蛋白質(zhì)攝取水分并將水分保留在蛋白質(zhì)組織中的能力[27]。蛋白質(zhì)的持水力在食品加工過(guò)程中有重要作用，蛋白質(zhì)的吸水能力直接影響烘焙食品、凝膠類(lèi)食品的質(zhì)構(gòu)，也與乳制品、肉質(zhì)類(lèi)制品的鮮嫩程度相關(guān)，因此蛋白質(zhì)的持水能力對(duì)食品的品質(zhì)、感官等品質(zhì)有著重要的作用。蛋白質(zhì)的吸水性受攜帶親水基團(tuán)的數(shù)量、溶解性及其他組分等因素的影響。

2.3.3 乳化性和乳化穩(wěn)定性

由圖5中a可知，在pH為2～4時(shí)，蛋白質(zhì)的乳化性逐步降低，在pH達(dá)到4時(shí)處于最低水平，且使用3種方法所提取的蛋白質(zhì)的乳化性較接近；隨著pH的升高，蛋白質(zhì)的乳化性逐漸升高，并在pH 8～10范圍內(nèi)陡增，在pH為10時(shí)達(dá)到最高值。蛋白質(zhì)的乳化性是指蛋白質(zhì)溶液從油包水變成水包油乳化過(guò)程中100 mg蛋白質(zhì)能夠乳化油的毫克數(shù)。同時(shí)乳化性是蛋白質(zhì)的一種重要功能性質(zhì)，它具有乳化容量和乳化穩(wěn)定性?xún)煞N特性。蛋白質(zhì)的乳化性可應(yīng)用于香腸、湯料、奶酪和蛋糕等食品中[28]。

由圖5中b可知，這3種方法提取的蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性與乳化性相接近，均在pH為2～4時(shí)降低，在pH為4時(shí)達(dá)最低點(diǎn)，且在pH 4～10范圍內(nèi)上升，在pH為10時(shí)乳化穩(wěn)定性最大，醇溶法提取的蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性可達(dá)35%。蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)乳化液保持明顯穩(wěn)定狀態(tài)并且不會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)相分層或者不穩(wěn)定現(xiàn)象[29-30]。因此，在考慮蛋白質(zhì)乳化性和乳化穩(wěn)定性時(shí)，可以采用醇溶法進(jìn)行提取。

2.4 不同提取方法對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響

由圖6可知，隨著水解時(shí)間的增加，3種提取方法得到的馬鈴薯蛋白質(zhì)水解度均隨之增加，使用醇溶法提取的蛋白質(zhì)水解度在使用酶處理的前2 h呈陡增趨勢(shì)，而使用鹽溶法和堿溶法所得的蛋白質(zhì)在前4 h均呈明顯上升趨勢(shì)，隨后上升緩慢。相比較而言，使用醇溶法提取的馬鈴薯蛋白水解度更高，有利于馬鈴薯蛋白的進(jìn)一步加工處理。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以新鮮馬鈴薯作為研究材料，通過(guò)醇溶法、鹽溶法、堿溶法3種方法提取馬鈴薯蛋白，測(cè)定其提取率和純度后，對(duì)其功能性質(zhì)和水解度進(jìn)行研究，得出以下結(jié)論：醇溶法提取的馬鈴薯蛋白提取率和純度最高，堿溶法純度最低，鹽溶法提取率最低；通過(guò)SDS-PAGE電泳分析，醇溶法提取的馬鈴薯蛋白亞基條帶多，分子量范圍廣，并且在分子量為25～40 kDa范圍內(nèi)含量很高；使用堿溶法得到的蛋白質(zhì)起泡性和泡沫穩(wěn)定性更好并且更穩(wěn)定，醇溶法提取的蛋白質(zhì)持油性和持水性都比其他兩種高，并且乳化性和乳化穩(wěn)定性相較另外兩種更好；醇溶法提取的馬鈴薯蛋白水解度更高且誤差更小。綜上所述，在這3種方法中，醇溶法是比較經(jīng)濟(jì)、所得蛋白質(zhì)性質(zhì)較好的提取方法。

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