麗格海棠外植體組織培養(yǎng)的研究

于 非

(黑龍江省農(nóng)科院園藝分院，哈爾濱150069)

麗格海棠(Begoniaelatior)又名玫瑰海棠，為秋海棠科秋海棠屬的多年生草本花卉[1]，當(dāng)今世界著名的盆栽花卉之一，具有極高的觀賞及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其花色鮮艷，花色品種多,不但是優(yōu)質(zhì)園林綠化用花，還是優(yōu)良的家庭用花。據(jù)調(diào)查僅黑龍江省海棠每年園林綠化用花在2000萬盆以上,家庭用盆花每年在50萬盆左右。具有較高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的室內(nèi)花卉，開發(fā)前景極其廣闊[2]。

麗格海棠目前的傳統(tǒng)繁育方式是有性繁殖和無性繁殖。有性繁殖即種子播種，由于麗格海棠是雜交的產(chǎn)物，胚胎發(fā)育不完全，所以不宜發(fā)芽，開花后結(jié)籽少，種子發(fā)芽率很低,不能保持母本的優(yōu)良特性等缺點(diǎn),一般種子播種不作為商業(yè)化生產(chǎn)的繁育手段；無性繁育即莖段扦插，麗格海棠對(duì)環(huán)境條件要求高，分蘗力弱，莖段扦插成活率與繁殖系數(shù)低, 種質(zhì)退化嚴(yán)重[3]，并且長期無性繁殖還會(huì)造成病毒在植物體內(nèi)傳遞累積，嚴(yán)重影響花卉產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，很難滿足當(dāng)前花卉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的要求。本試驗(yàn)通過對(duì)麗格海棠不同部位外植體的研究，篩選出適合麗格海棠組織培養(yǎng)快繁的培養(yǎng)基，為建立麗格海棠再生體系奠定基礎(chǔ)，提高麗格海棠商品化生產(chǎn)效率提供技術(shù)支持[4]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)采用麗格海棠品種巴克斯(Barkos)，采集地點(diǎn)為黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院智能化溫室。將采集的麗格海棠嫩葉片、葉柄、莖段放于流水下沖洗20 min，置于超凈工作臺(tái)上先用75%的酒精消毒20～30s，蒸餾水沖洗3次。再用0.1%的升汞浸泡搖勻消毒4～6min，蒸餾水沖洗3次,將消毒好的外植體放于經(jīng)過高溫滅菌的蒸餾水中并蓋好瓶蓋，然后用消過毒的解剖刀對(duì)外植體進(jìn)行切割，葉片切成1cm×1cm大小，葉柄、莖段切成1cm左右，接種到不定芽分生培養(yǎng)基上。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同部位外植體的不定芽誘導(dǎo)情況。誘導(dǎo)不定芽分生的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，含 30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH=5.7，添加不同濃度的6-BA、TDZ和2.4-D，共組成6種培養(yǎng)基組合：MS+1mg/L TDZ、MS + 1mg/L TDZ+0.1mg/L 2,4-D、MS+1mg/L TDZ+0.3mg/L 2,4-D、MS+2mg/L TDZ、MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L TDZ、MS+1mg/L 6-BA+0.3mg/L TDZ，每種培養(yǎng)基分別接入不同部位外植體各30個(gè)，重復(fù)3次，培養(yǎng)室溫度26±2℃，光照 1200 lx左右,每天光照 10～12h，4周后觀察其不定芽誘導(dǎo)情況。

1.2.2 不定芽的繼代增殖。將誘導(dǎo)出已分生的不定芽切下接種到繼代增殖培養(yǎng)基中，繼代增殖培養(yǎng)基為MS附加6-BA和NAA，共組成9種培養(yǎng)基，MS+1mg/L 6-BA;MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA;MS+1mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA;MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA;MS+2mg/L 6-BA;MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA;MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA;MS+mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA; MS+3mg/L 6-BA。4周繼代一次，觀察高度大于2.5cm 的不定芽增殖情況。

1.2.3 組培苗的生根。將高度大于2.5cm的組培苗切下接種到生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基為MS附加IBA和NAA,共組成9種培養(yǎng)基，MS+0.1mg/L IBA;MS+0.1mg/L IBA+0.1mg/L NAA;MS+0.1mg/L IBA+0.3mg/L NAA;MS+0.3mg/L IBA;MS+0.3mg/L IBA+0.1mg/L NAA;MS+0.3mg/L IBA+0.3mg/L NAA;MS+0.5mg/L IBA;MS+0.5mg/L IBA+0.1mg/L NAA; MS+0.5mg/L IBA+0.3mg/L NAA。4周后觀察其生根情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜不同部位外植體不定芽分生的培養(yǎng)基

表1 不同部位外植體的不定芽分生情況

續(xù)表1

外植體培養(yǎng)基組合污染率(%)死亡率(%)不定芽再生比率(%)MS+1mg/L TDZ+0.3mg/L 2,4-D41.235.665.2MS+2mg/L TDZ59.449.533.2MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L TDZ39.220.587.3MS+1mg/L 6-BA+0.3mg/L TDZ33.536.970.2

由表1可知，麗格海棠不同部位的外植體都有誘導(dǎo)不定芽成功的幾率。觀察表明，葉片在10d左右周圍組織開始膨大變綠形成愈傷，在20d左右就有不定芽產(chǎn)生，其中不定芽可以從愈傷組織里產(chǎn)生也可以直接從葉片上產(chǎn)生。葉片的不定芽再生比率最高可以達(dá)到90%左右，最適宜葉片不定芽分生的培養(yǎng)基為MS+1mg/L TDZ+0.1mg/L 2,4-D或MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L TDZ；葉柄在25d左右形成愈傷組織并產(chǎn)生不定芽，葉柄在誘導(dǎo)的過程中污染率和死亡率都較高，并且不定芽再生比率較低，其中最適宜葉柄不定芽分生的培養(yǎng)基為MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L TDZ，再生率為66.2%；莖段在培養(yǎng)30d以后在綠的皮層處和邊緣處產(chǎn)生不定芽，莖段在誘導(dǎo)的過程中污染率和死亡率比前兩者都高，但是再生率高于葉柄，最適宜莖段不定芽分生的培養(yǎng)基為MS+1mg/L TDZ+0.1mg/L 2,4-D或MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L TDZ，再生率可達(dá)88.9%。綜上所述，不同部位外植體都可誘導(dǎo)出不定芽，不定芽的再生率葉片>莖段>葉柄。

2.2 不定芽的繼代增殖

將誘導(dǎo)出的不定芽切割后轉(zhuǎn)入到繼代增殖培養(yǎng)基中，30d后新的不定芽葉子膨脹展開，株高增高顯著，苗莖變粗形成小的植株。由表2可知，隨著6-BA濃度的增高不定芽分化速度加快和增殖倍數(shù)提高但6-BA濃度達(dá)到3mg/L時(shí)，芽生長勢(shì)減弱；隨著NAA濃度的提高易生成根，根生成后不定芽增殖速度減慢，因此，麗格海棠不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+2mg/L 6-BA+0～0.1mg/L NAA，增殖系數(shù)可達(dá)5.8。

表2 不定芽的繼代增殖

2.3 組培苗的生根

由表3得出IBA濃度的升高對(duì)麗格海棠組培苗生根有促進(jìn)作用，但I(xiàn)BA濃度達(dá)到0.3 mg/L以上，對(duì)組培苗生長有抑制作用，添加0.1mg/LNAA可以促進(jìn)組培苗生長，但當(dāng)NAA濃度達(dá)到0.3 mg/L以上，出現(xiàn)葉片枯萎現(xiàn)象，因此，組培苗生根可選用0.1～0.3mg/L IBA，可添加0.1mg/L NAA促進(jìn)組培苗生長。

表3 組培苗的生根

3 結(jié)論與討論

外植體的選擇是麗格海棠組織培養(yǎng)體系建立的關(guān)鍵。植物細(xì)胞具有全能型，所以不同部位的外植體都可能誘導(dǎo)成株，但是不同部位的的外植體再生能力上有較大的區(qū)別。本文研究表明：適宜麗格海棠葉片的不定芽再生培養(yǎng)基為MS+1mg/LTDZ+0.1mg/L2,4-D或MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LTDZ，培養(yǎng)4周后的不定芽再生率可以達(dá)到90.2%；適宜葉柄的不定芽再生培養(yǎng)基為MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LTDZ，培養(yǎng)4周后不定芽再生率可達(dá)66.2%；適宜莖段的不定芽再生培養(yǎng)基為MS+1mg/LTDZ+0.1mg/L2,4-D或MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LTDZ，再生率可達(dá)88.9%；該研究對(duì)葉片、葉柄和莖段外植體的污染率、死亡率和不定芽再生率進(jìn)行比較表明，適宜三者的不定芽培養(yǎng)基基本相同，在相同培養(yǎng)基的條件下，葉片的污染率和死亡率都較低，不定芽再生率最高；葉柄的不定芽再生率最低，一般不作為麗格海棠組織培養(yǎng)的外植體選用；莖段的污染率和死亡率最高，但是再生率高于葉柄；所以按不定芽適宜的外植體為葉片>莖段>葉柄。

將培養(yǎng)的不定芽從葉片切下接種到繼代增殖培養(yǎng)基上，最佳的不定芽繼代增殖培養(yǎng)基激素組合為MS+2mg/L 6-BA+0～0.1mg/L NAA，增殖系數(shù)可達(dá)5.8，根據(jù)具體需求可繼續(xù)進(jìn)行增殖，每4周繼代1次；將高度為2.5cm以上的組培苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，最佳的生根培養(yǎng)基激素組合為MS + 0.1～0.3mg/L IBA，組培苗生根后且長度達(dá)到5cm以上可移栽馴化。實(shí)驗(yàn)得出隨著細(xì)胞分裂素濃度的增加對(duì)不定芽再生和增殖均有促進(jìn)作用，但當(dāng)濃度超出一定范圍時(shí)，對(duì)不定芽再生和增殖起到了抑制的作用；高濃度的IBA對(duì)麗格海棠組培苗的生根和生長有促進(jìn)作用，但是抑制了組培苗的增長，出現(xiàn)黃葉枯萎現(xiàn)象。因此，在生產(chǎn)中應(yīng)結(jié)合不定芽和組培苗生長勢(shì)而調(diào)節(jié)激素濃度。麗格海棠組培苗葉片和莖較脆，在生根時(shí)建議切成叢狀，利于生根和馴化。