接骨木概況及遺傳多樣性研究進(jìn)展

郭宇蘭，劉克武，宗憲春

(1.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所，黑龍江牡丹江157011；2.牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江牡丹江157012)

1 接骨木概況

接骨木(SambucuswillamsiiHance)忍冬科(Caprifoliaceae)接骨木屬(Sambucus),落葉灌木或小喬木[1]，廣泛分布于中國(guó)、加拿大、西伯利亞等地區(qū)。接骨木資源豐富，約20種，中國(guó)有5～6種[2]，主要分布于中國(guó)東北地區(qū)。接骨木通常株高5～6 m；生于山坡、灌叢、路邊等[3]。老枝呈淡紅褐色，具明顯的長(zhǎng)橢圓形皮孔，枝上具縱棱線，莖髓發(fā)達(dá)，髓部淡褐色。接骨木的花與葉同出，圓錐形聚傘花序頂生，長(zhǎng)5～11cm，寬4～14cm，具總花梗，花序分枝多成直角開(kāi)展，有時(shí)被稀疏短柔毛，隨即光滑無(wú)毛；花冠蕾時(shí)帶粉紅色，開(kāi)后白色或淡黃色，萼筒杯狀，長(zhǎng)約1mm；雄蕊5枚與花冠裂片等長(zhǎng)，開(kāi)展，花絲基部稍肥大，花藥黃色；雌蕊1枚，花柱較短或幾無(wú)，柱頭2～3裂，子房3～5室。漿果，果實(shí)紅色，極少藍(lán)紫黑色，卵圓形或近圓形，直徑3～5mm，具宿存花萼；有2～3核，每核1粒種子，卵圓形至橢圓形，長(zhǎng)2.5～3.5mm，略有皺紋?；ㄆ谝话銥?～5月，8月末，果落盡；11月初，葉落盡[4]。

接骨木在世界范圍內(nèi)分布極廣，適應(yīng)性較強(qiáng)，對(duì)氣候要求不嚴(yán)；喜向陽(yáng)，但又能稍耐蔭。以肥沃、疏松的土壤培養(yǎng)為好。較耐寒，又耐旱，根系發(fā)達(dá)，萌蘗性強(qiáng)，容易引種和栽培，耐瘠薄，在巖石縫中亦能生存[5]。生長(zhǎng)迅速，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)健，抗病蟲(chóng)能力強(qiáng)，抗逆性強(qiáng)。根肉質(zhì)，常有橫生的根莖串生成新的植株，因而多為叢生狀，根系發(fā)達(dá)，極具擴(kuò)張能力[6]。

作為中醫(yī)的傳統(tǒng)藥材，中醫(yī)學(xué)上接骨木被制成膏藥、蜜丸、膠囊等劑型而廣泛應(yīng)用于治療骨折、跌打損傷[7](在中國(guó)，已有幾個(gè)世紀(jì)用接骨木的莖枝治療骨折的歷史[8])、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、大骨節(jié)病、慢性腎炎等。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)接骨木提取物可以增加骨密度、增強(qiáng)骨強(qiáng)度，在骨折愈合的所有時(shí)間點(diǎn)通過(guò)促進(jìn)骨形成顯著加速骨折愈合。其主要作用機(jī)制為通過(guò)骨折部位的骨密度、血清堿性磷酸酶和骨鈣素水平，以及骨髓基質(zhì)細(xì)胞中鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量來(lái)促進(jìn)骨折愈合[9]。有報(bào)道稱，接骨木提取物通過(guò)抑制骨再吸收過(guò)程和刺激骨再形成過(guò)程來(lái)改進(jìn)骨性質(zhì)[10]。據(jù)《本草綱目》中記載其釋名為續(xù)骨木、木蒴。其味甘、苦，性平，無(wú)毒，有接骨續(xù)筋、活血止痛、祛風(fēng)利濕的功能，多外用于治療創(chuàng)傷出血[11]，同時(shí)還具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化、抗艾滋病等藥理功效[12]。近年的藥理研究表明，接骨木具有降低血脂、延緩衰老、強(qiáng)健大腦等作用，是一種較理想的保健藥物[13]。接骨木提取物還可以應(yīng)用于化妝品中，有滋潤(rùn)皮膚的美容作用，如接骨木洗面奶、接骨木洗發(fā)香波、接骨木營(yíng)養(yǎng)蜜、接骨木營(yíng)養(yǎng)霜；接骨木苷和黏液質(zhì)等成分有殺菌、消炎、止癢功能，可用于制作日常洗護(hù)用品[14]。

2 接骨木研究進(jìn)展

2.1 接骨木的化學(xué)成分

接骨木含有復(fù)雜的化學(xué)成分和多種活性物質(zhì)[15]。許多學(xué)者對(duì)接骨木的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，并取得了一定的進(jìn)展。接骨木中含有豐富的黃酮類及黃酮苷類、木脂素、酚酸以及三萜類等化學(xué)成分。黃酮類及黃酮苷類又稱黃堿素類，是許多中草藥的有效成分，類型最全、結(jié)構(gòu)最復(fù)雜、含量最高的黃酮類化合物集中分布在被子植物中[16]。

黃酮類及黃酮苷類具有防治骨質(zhì)疏松、心血管疾病、清除自由基等藥理功效[17]。林曉影等[18]從接骨木果實(shí)中提取得到的芹黃素、4，5，7-三羥黃酮醇、五羥黃酮、毛地黃黃酮、花青素等黃酮類化合物，對(duì)中老年婦女的代謝具有積極影響，可以防治骨質(zhì)疏松等疾病。Lamaison等[19]從接骨木葉中分離到的人參黃酮苷(panasenoside)能顯著降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血壓。李安林等[20]從接骨木莖中提取總黃酮溶液，然后加入二苯代苦味肼基自由基，結(jié)果表明總黃酮濃度越高清除自由基的效果越好。

木脂素類是由苯丙烷類氧化聚合而成的天然產(chǎn)物。歐陽(yáng)富[21]用60%的乙醇從接骨木的莖枝中分離到7個(gè)木脂素類化合物；Choi[22]用甲醇從接骨木樹(shù)皮中分離得到(-)-olivil-9-O- D-glucopyranoside木脂素類化合物；Hwang[23]用甲醇從接骨木莖枝中分離到木脂素類化合物lariciresinol，其生物活性表現(xiàn)為抗病毒、殺蟲(chóng)、抗腫瘤、保肝與抗氧化、平滑肌解痙、影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及抑制CAMP磷酸二酯酶等作用。此外，在接骨木中發(fā)現(xiàn)的8-O-4'去甲木脂素能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的合成代謝。當(dāng)在細(xì)胞中加入雌激素受體頡抗劑或分裂原活化抑制劑后8-O-4'去甲木脂素對(duì)成骨細(xì)胞的合成代謝則失去了促進(jìn)作用。在接骨木中發(fā)現(xiàn)的(+)-皮樹(shù)脂醇，經(jīng)試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)其具有潛在的抗真菌作用，對(duì)白色念珠菌中的活性氧簇積累有誘導(dǎo)作用。

酚酸類成分是廣泛分布于藥用植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物。楊序娟用60%的乙醇從接骨木莖枝中分離到vanillin， acetovanilone，coniferyl aldhyde，syring aldehyde，4-hydroxybenzoic acid，4-hydroxycinnamic acid，protocatechμic acid，vanillic acid，ferulic acid，indole-3-carboxylic acid等十個(gè)酚酸類化合物。研究表明該類化合物是一種良好的抗氧化劑，具有收斂、抗菌消炎、止血、抗腫瘤、抗突變、抗脂質(zhì)過(guò)氧化物、抗病毒等多種生物活性[24]。

接骨木的莖枝中含有多樣化的生理活性的三萜類化合物。楊序娟等[25]從接骨木莖枝的體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇提取物中分離到白樺醇、白樺酸、齊墩果酸、熊果酸和α-香樹(shù)脂醇5個(gè)三萜類化合物，其中對(duì)抗肝炎活性最為明顯的是齊墩果酸。郭學(xué)敏[26]等從接骨木莖枝的乙醇提取物中也分離到了有較好的抗肝炎活性的三種三萜類化合物，即ursolic acid, cramyrin, lupeol palmitate。

2.2 接骨木籽油的研究現(xiàn)狀

接骨木是珍稀的野生木本油料植物。接骨木的種子含有35%～44%的油脂，油脂中ɑ-亞麻酸的含量較高[27]。此外，接骨木籽油中n-3和n-6系列脂肪酸的配比較合理，該合理配制有益于生命質(zhì)量的提高[28]，故開(kāi)發(fā)接骨木籽油資源擁有一定的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

2.2.1 接骨木籽油的理化指標(biāo)

接骨木籽油為橙黃色，無(wú)雜質(zhì)，清澈透明，具有濃郁的油香味。有學(xué)者采用阿貝氏折光計(jì)測(cè)得其折光率是1.4617；采用自動(dòng)旋光儀測(cè)得其旋光度是0.152(L)；采用比重瓶法測(cè)得其比重是0.88 kg/L；采用韋氏法測(cè)得其碘價(jià)是122.72 g/100g；采用皂化瓶法測(cè)得其皂化價(jià)是178.45mg/g[29]。日常食用的大豆油的比重是0.92 kg/L，碘價(jià)是119 g/100g，對(duì)比后可知接骨木籽油的比重小于大豆油，碘價(jià)大于大豆油，說(shuō)明接骨木籽油的不飽合脂肪酸含量較高，其有益于人體健康。

2.2.2 接骨木籽油中的重金屬含量

表1 接骨木籽油的重金屬含量

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，有學(xué)者[30]采用原子吸收光譜法測(cè)定了接骨木籽油的重金屬含量，結(jié)果如表1所示：

由表1可知，接骨木籽油的重金屬含量均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，其重金屬含量未超標(biāo)，在安全范圍之內(nèi)無(wú)害。

2.2.3 接骨木籽油的脂肪酸組成及含量

有研究者通過(guò)氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，采用峰面積歸一化的方法定量分析了籽油的脂肪酸含量。結(jié)果表明接骨木籽油的棕櫚酸含量大約為15.43%，硬脂酸含量大約為1.60%，油酸含量大約為28.74%，亞油酸含量大約為30.79%，ɑ-亞麻酸含量大約為22.49%[31]。在脂肪酸種類及含量方面，將接骨木籽油與常見(jiàn)食用油對(duì)比可知，接骨木籽油的ɑ-亞麻酸含量明顯高于對(duì)比食用油，這表明接骨木籽油富含人體必需脂肪酸，其保健功效顯著[32]。

2.2.4 接骨木籽油的生物活性

胡榮等[33]研究者以雞和小鼠作為研究對(duì)象，在2周內(nèi)給它們灌胃接骨木籽油，劑量是4g/kg。研究結(jié)果表明，接骨木籽油明顯降低了高脂動(dòng)物模型的血清總膽固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白，增加了它們的高密度脂蛋白以及高密度脂蛋白與總膽固醇的比值。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明接骨木籽油具有降血脂的作用。

李炫萬(wàn)等[34]研究者以小鼠為研究對(duì)象，每日定時(shí)給小鼠灌胃一次接骨木籽油，劑量為2000mg/ kg。結(jié)果表明，小鼠的S180荷瘤實(shí)體瘤以及H22肝癌實(shí)體瘤被抑制生長(zhǎng)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示接骨木籽油具有抗癌的活性。

Zakay-Rones等[35]研究者以流感患者為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)過(guò)程讓他們口服接骨木籽油。結(jié)果發(fā)現(xiàn)流感在3天內(nèi)就能完全被治愈的患者占90%。學(xué)者認(rèn)為接骨木籽油減少了人體內(nèi)紅細(xì)胞的凝集作用，抑制了流感病毒的復(fù)制。學(xué)者Barak[34]在一系列體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)接骨木籽油可以有效抑制10種流感病毒的生長(zhǎng)。此外，Yesilada等[36]研究者通過(guò)一些列實(shí)驗(yàn)總結(jié)出矮接骨木籽油在1.95～250g/ L濃度范圍下可以有效抵抗幽門螺旋桿菌。

劉錚等[37]研究者以小鼠為研究對(duì)象，進(jìn)行了常壓耐缺氧的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給小鼠進(jìn)行腹腔注射以給藥接骨木籽油，劑量分別為10、20、40mL/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體內(nèi)被注射了籽油的小鼠的存活時(shí)間明顯高于與空白對(duì)照組(注射同等劑量的蒸餾水)，且籽油的劑量越大，實(shí)驗(yàn)小鼠的存活時(shí)間就越長(zhǎng)。

范妮娜等[38]研究者以小鼠為研究對(duì)象，給它們灌胃接骨木籽油，劑量為12.5 mg/ kg。結(jié)果表明，接骨木籽油可以強(qiáng)烈刺激小鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，恢復(fù)被環(huán)磷酰胺抑制的淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，效果明顯優(yōu)于對(duì)照組，該實(shí)驗(yàn)顯示接骨木籽油可以活化淋巴細(xì)胞，其具有免疫活性。

Mlinaric等[39]研究者發(fā)現(xiàn)，在接骨木籽油的IC50值為0.017g/L的時(shí)候，它會(huì)抑制HIV- 1逆轉(zhuǎn)錄酶，這說(shuō)明該籽油具有抗艾滋病的作用。Zakay-Rones等[39]研究者通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接骨木籽油可以有效抑制CD+細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中的HIV病毒感染，將這些細(xì)胞從病人的血液中分離出來(lái)后與接骨木籽油置于一處培養(yǎng)一段時(shí)間后，在體系中檢測(cè)不到HIV抗原，這說(shuō)明該籽油具有抗艾滋病的作用。

接骨木籽油的用途廣泛，是一種功能性的油脂，其發(fā)展前景廣闊。隨著人們逐步認(rèn)識(shí)到接骨木籽油的生物活性功能以及人們對(duì)籽油提取工藝的不斷優(yōu)化和改進(jìn)，接骨木籽油的大規(guī)模生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)利用必然會(huì)得到有效的落實(shí)。

3 遺傳多樣性研究

3.1 生物多樣性與遺傳多樣性

生物多樣性是指一定空間范圍內(nèi)生物及其組成系統(tǒng)的總體多樣性和變異性[40]。生物多樣性通常包括3個(gè)主要層次，即基因多樣性、物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性[41]。

生物多樣性的重要組成部分是遺傳多樣性[42]。廣義上講，遺傳多樣性是指地球上生物所攜帶的所有遺傳信息的總和。這些遺傳信息儲(chǔ)存在生物個(gè)體的基因之中，因此，生物多樣性也就是生物的遺傳基因的多樣性，是生命進(jìn)化和物種進(jìn)化的基礎(chǔ)。狹義的遺傳多樣性則是指生物種內(nèi)不同種群間以及個(gè)體間的遺傳多態(tài)性程度。但基因(或遺傳)多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了物種多樣性的范疇[43]。

遺傳多樣性是利用遺傳標(biāo)記來(lái)進(jìn)行研究[44]。遺傳標(biāo)記是指可以穩(wěn)定遺傳的易于識(shí)別的特殊的遺傳多態(tài)性形式[45]。遺傳多樣性的研究方法主要有四種，即形態(tài)標(biāo)記(Morphological Markers)、細(xì)胞標(biāo)記(Cytological Markers)、生化標(biāo)記(Biochemical Markers)和分子標(biāo)記(Molecular Markers)[46]。

形態(tài)標(biāo)記是指顯示植物遺傳多態(tài)性的外觀性狀。該方法具有快捷、方便的優(yōu)點(diǎn)。但由于一些形態(tài)標(biāo)記的多態(tài)性差，易受環(huán)境因素的影響，且標(biāo)記的性狀數(shù)量有限，人工培育形態(tài)標(biāo)記材料的周期較長(zhǎng)，準(zhǔn)確性不高[47]。

細(xì)胞標(biāo)記主要是通過(guò)染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異來(lái)顯示。染色體的數(shù)目特征指的是經(jīng)過(guò)特殊染色顯帶后的染色體帶的顏色深淺、寬窄和位置順序等；而染色結(jié)構(gòu)變異如缺失、重復(fù)、倒位和易位等，非整倍體變異如缺體、單體、三體等都各有其特定的細(xì)胞學(xué)特征[48]。由于用細(xì)胞學(xué)方法難以檢測(cè)不涉及染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)變異或帶型變異的性狀，且該標(biāo)記材料的選育需要花費(fèi)大量的時(shí)間和人力，因此難以廣泛應(yīng)用[49]。

生化標(biāo)記是指利用基因的表達(dá)產(chǎn)物，主要包括貯藏蛋白、同工酶和等位酶等。具有經(jīng)濟(jì)方便、不易受環(huán)境影響的特點(diǎn)[50]。但用該方法標(biāo)記的數(shù)量不能滿足實(shí)際的需要，存在組織特異性和器官特異性。

分子標(biāo)記廣義是指在分子水平上可標(biāo)識(shí)的基因組中任何位點(diǎn)上的相對(duì)差異，狹義是指以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記[51]。與形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記和細(xì)胞學(xué)標(biāo)記相比，因其數(shù)量多(理論上遍及整個(gè)基因組)、多態(tài)性高、多數(shù)標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性等特點(diǎn)[52]，目前已在構(gòu)建遺傳圖譜、親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種等方面得到了廣泛地應(yīng)用[53]。

根據(jù)檢測(cè)方式可將其分為三類：(1)以DNA-DNA雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如比較經(jīng)典的RFLP分子標(biāo)記[54]；(2)以基因組測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的DNA分子標(biāo)記，如SNP(單核苷酸多態(tài)性)分子標(biāo)記[55]；(3)以PCR技術(shù)為核心的DNA標(biāo)記技術(shù)，如RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù))分子標(biāo)記、SSR分子標(biāo)記、AFLP(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)分子標(biāo)記[56]等。

3.2 AFLP分子標(biāo)記

AFLP(Amplified fragment length polymorphism)是由荷蘭Keygene公司科學(xué)家Vos和Zabeau在RFLP和RAPD分子標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的技術(shù)[57]。其基本原理是首先利用限制性內(nèi)切酶水解基因組 DNA ，使其產(chǎn)生不同大小的 DNA 片段，然后與雙鏈人工接頭的酶切片段相連接作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，再以人工接頭的互補(bǔ)鏈為引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，最后在接頭互補(bǔ)鏈的基礎(chǔ)上添加 1～3個(gè)選擇性核苷酸作引物，對(duì)模板 DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增[58]。為了能對(duì)擴(kuò)增片段的大小進(jìn)行調(diào)節(jié)，一般采用兩個(gè)限制性內(nèi)切酶，一個(gè)是切點(diǎn)多的酶，如MseI-具有4堿基識(shí)別位點(diǎn)；另一個(gè)是切點(diǎn)較少的酶，如Eco RI-具有6堿基識(shí)別位點(diǎn)。隨后將雙鏈人工接頭連接在酶切片段兩端形成帶接頭的特異片段，然后通過(guò)PCR引物與接頭序列結(jié)合，經(jīng)變性、退火和延伸周期性的循環(huán)后被擴(kuò)增，再通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測(cè)獲得的DNA擴(kuò)增片段，根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的不同檢測(cè)出多態(tài)性[59]。

AFLP標(biāo)記具有分辨率高、穩(wěn)定性好、效率高、多態(tài)性強(qiáng)的特點(diǎn)，而且一次可檢測(cè)到100～150個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，因而是進(jìn)行種質(zhì)遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析的有效方法，可以確定個(gè)體間的遺傳差異和親緣關(guān)系，從而確定其遺傳距離進(jìn)而進(jìn)行品種指紋圖譜繪制及分類研究[60]。