一起肅南牦牛犢牛沙門(mén)氏菌及病毒性腹瀉病毒混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷和防治建議

摘要：對(duì)一起肅南牦牛犢牛傳染性腹瀉疾病進(jìn)行實(shí)地查看和解剖，根據(jù)臨床癥狀和剖檢變化，筆者初步診斷為疑似病毒性腹瀉病毒和沙門(mén)氏菌感染，為進(jìn)一步進(jìn)行確診和為養(yǎng)殖戶(hù)提供科學(xué)的防治建議，采集未經(jīng)藥物治療死亡的2頭病死犢牛肝臟和10頭病牛全血到實(shí)驗(yàn)室診斷。實(shí)驗(yàn)通過(guò)病毒性腹瀉抗原檢測(cè)、沙門(mén)氏菌直接PCR檢測(cè)、培養(yǎng)菌落觀(guān)察、菌體顯微鏡觀(guān)察、分離菌株P(guān)CR檢測(cè)、藥敏敏感性以及動(dòng)物攻毒試驗(yàn)，確診為沙門(mén)氏菌和病毒性腹瀉病毒混合感染，并提出了防治建議。

關(guān)鍵詞：肅南牦牛犢牛；沙門(mén)氏菌；病毒性腹瀉病毒；實(shí)驗(yàn)室診斷；防治

“肅南牦?！笔窃谄钸B山北麓這種獨(dú)特的地理氣候環(huán)境條件下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人工選育而成的一個(gè)牦牛遺傳資源，也是肅南裕固族自治縣牧民飼養(yǎng)的主要家畜，在全縣畜牧業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。但腹瀉是導(dǎo)致肅南牦牛犢牛高死亡率的主要因素，給畜牧業(yè)發(fā)展造成重大損失和嚴(yán)重影響農(nóng)牧民收入，其中，沙門(mén)氏菌病和病毒性腹瀉病是導(dǎo)致牦牛犢牛發(fā)生腹瀉的主要傳染病。筆者將一例肅南牦牛犢牛沙門(mén)氏菌和病毒性腹瀉混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷報(bào)告如下，并提出了防治建議。

1 發(fā)病情況

肅南縣康樂(lè)鎮(zhèn)賽鼎村牦牛養(yǎng)殖戶(hù)申某于2022年10月中旬從本縣境內(nèi)分批購(gòu)買(mǎi)了86頭肅南牦牛7～8月齡犢牛，11月15日開(kāi)始，3頭牦牛犢牛陸續(xù)出現(xiàn)臨床癥狀，主要表現(xiàn)為腹瀉的疾病，至11月30日，發(fā)病22頭，死亡6頭。

2 臨床癥狀

發(fā)病初期體溫可升高到 40～42 ℃，并可持續(xù) 1～2 d，采食情況不良，精神狀態(tài)萎靡，12～36 h 后排出流水狀灰綠色稀便，夾雜著纖維狀的物質(zhì)和黏膜組織，部分糞便中夾雜帶有黏液和血液，散發(fā)出惡臭難聞的氣味。病牛有腹部疼痛感，會(huì)用后肢踢腹部。大部分患病?？谇淮絻?nèi)、齒齦、硬腭和鼻黏膜處有米粒至蠶豆大糜爛或潰瘍，嚴(yán)重者整個(gè)口腔覆有呈煮熟樣的灰色壞死上皮，大量流出泡沫樣口涎。部分患病牛出現(xiàn)眼結(jié)膜炎癥狀，并伴隨著咳嗽、呼吸急促，隨著病程延長(zhǎng)癥狀也逐漸加重，病牛體質(zhì)虛弱、消瘦，直至脫水嚴(yán)重死亡。

3 剖檢變化

剖檢發(fā)現(xiàn)，食道存在小的潰爛斑點(diǎn)和出血點(diǎn)，腹膜有點(diǎn)狀出血，皺胃和小腸黏膜出現(xiàn)彌散性出血和炎性水腫的情況，腸系膜淋巴結(jié)腫大。大腸內(nèi)有脫落的纖維素性壞死膜，肝臟顏色變淡，脾臟腫大嚴(yán)重，充血，為暗紅色。

4 實(shí)驗(yàn)室診斷

4.1 病毒性腹瀉抗原檢測(cè)

根據(jù)牛病毒性腹瀉抗原檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，在反應(yīng)板每孔加入50 μL檢測(cè)抗體，然后分別加入雙孔陰性對(duì)照和雙孔陽(yáng)性對(duì)照各50 μL，待檢全血50 μL，按照步驟進(jìn)行ELISA試驗(yàn)操作，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)讀取每個(gè)反應(yīng)孔的A（450 nm）值。應(yīng)用公式S-N=樣品（450 nm）值-陰性對(duì)照平均A（450 nm）值計(jì)算每個(gè)反應(yīng)孔樣品的修正OD值，當(dāng)被檢測(cè)樣品COD值大于0.3時(shí)判定為陽(yáng)性。

4.2 沙門(mén)氏菌直接PCR檢測(cè)

將采集的2份病死牛肝臟，編號(hào)為1、2，對(duì)表面進(jìn)行消毒（火焰），從內(nèi)部組織剪取約1 g大小組織，置于預(yù)冷的裝有大磁珠的消毒EP管內(nèi)，加入2 mL的生理鹽水，放置于高通組織研磨器（SCIENTZ-48）內(nèi)，以1 200 rpm 研磨3 min。提取組織的細(xì)菌DNA（按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作）。采用InvA引物，用于沙門(mén)氏菌核酸的檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其包括上下引物各1 μL、 Premix Taq（Ex Taq Version 2.0 plus dye） 25 μL、滅菌后的ddH2O 18 μL、DNA模板5 μL。設(shè)置反應(yīng)程序（如表1所示），進(jìn)行DNA電泳檢測(cè)，觀(guān)察擴(kuò)增片段的大小。在陰性對(duì)照孔無(wú)擴(kuò)增條帶，且在陽(yáng)性對(duì)照孔出現(xiàn)相應(yīng)擴(kuò)增條帶時(shí)判定結(jié)果。若在陽(yáng)性對(duì)照孔出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，陰性對(duì)照孔無(wú)條帶，且樣品擴(kuò)增帶與陽(yáng)性擴(kuò)增帶處于同一位置，則可判定為沙門(mén)氏菌。

4.3 沙門(mén)氏菌的分離培養(yǎng)

將采集的2份病死牛肝臟，編號(hào)為1、2，對(duì)表面進(jìn)行消毒（火焰），從內(nèi)部組織剪取一小塊置于10 mL緩沖蛋白胨水（BPW）中，于37 ℃渦旋振蕩器中培養(yǎng)6 h進(jìn)行菌的富集，然后移取緩沖蛋白胨水3 mL于5 mL RVS肉湯中，于42 ℃水浴鍋中過(guò)夜來(lái)選擇性增菌。然后蘸取RVS肉湯進(jìn)行SS瓊脂平板劃線(xiàn)，每株菌劃線(xiàn)兩個(gè)平板，于37 ℃溫箱中培養(yǎng)18～24 h。挑取SS瓊脂無(wú)色透明有黑色中心的沙門(mén)氏菌疑似菌，于3 mL LB中培養(yǎng)6 h進(jìn)行菌的純化。

4.4 分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增

將上述疑似沙門(mén)氏菌菌落分離培養(yǎng)和純化后，用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取DNA，并將其作為DNA模板，采用Hut為引物，進(jìn)行沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)進(jìn)一步確認(rèn)。其PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序和結(jié)果判定與沙門(mén)氏菌直接PCR檢測(cè)相同。

4.5 沙門(mén)氏菌藥敏試驗(yàn)

1）實(shí)驗(yàn)方法。將純化后的單個(gè)菌落加入4 mL的 TSB 培養(yǎng)基中，37 ℃、100 r/min搖床培養(yǎng)18 h。使用無(wú)菌生理鹽水以1∶20的比例對(duì)培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行稀釋?zhuān)瞥删鶆虻木鷳乙海c濁度管（0.5 麥?zhǔn)蠁挝唬岫纫恢?。吸?00 μL制成的菌懸液于TSA培養(yǎng)基表面，用涂布棒迅速涂布，使菌液均勻分布。將平板正置放入37 ℃培養(yǎng)箱中 2～4 min后，取藥敏片有規(guī)律平貼到平皿培養(yǎng)基表面，具體要求為：藥敏片邊緣距離平皿內(nèi)邊緣不小于13 mm，相鄰兩張藥敏片的距離不小于24 mm。貼好藥敏片后，標(biāo)記藥敏片名稱(chēng)，將平皿倒置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)18～24h 后，觀(guān)察。

2）結(jié)果判定。將平板取出后，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑，并記錄。

4.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攻毒試驗(yàn)

選取6只健康昆明小白鼠，隨機(jī)分為試驗(yàn)組3只和對(duì)照組3只。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射0.3 mL一定濃度的沙門(mén)氏菌TSB培養(yǎng)液，對(duì)照組腹腔注射0.3 mL的滅菌TSB培養(yǎng)液，兩組小白鼠隔離飼養(yǎng)16 h后，觀(guān)察記錄小白鼠生存狀態(tài)。

4.7 實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果

1）病毒性腹瀉抗原檢測(cè)結(jié)果。利用抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)全血中的病毒性腹瀉病毒，結(jié)果從10份樣品中檢出9份為病毒性腹瀉抗原陽(yáng)性。

2）沙門(mén)氏菌直接PCR檢測(cè)結(jié)果。2份樣品出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照同樣的特異性擴(kuò)增條帶，且陰性對(duì)照無(wú)條帶，即可判定為沙門(mén)氏菌（如圖1所示）。

3）沙門(mén)氏菌的分離培養(yǎng)結(jié)果。在所采集病死牛肝臟中分離純化出了在SS瓊脂平板上呈現(xiàn)為黑色中心、白色透明外周、光滑表面、邊緣整齊、形狀為圓形的菌落。通過(guò)革蘭氏染色和顯微鏡檢查，可見(jiàn)為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌（如圖2所示）。

4）分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果。2份樣品出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照同樣的特異性擴(kuò)增條帶，且陰性對(duì)照無(wú)條帶，即可判定為沙門(mén)氏菌（如圖3所示）。

5）沙門(mén)氏菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果。見(jiàn)表2。

6）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攻毒試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)實(shí)驗(yàn)組3只小白鼠實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射0.3 mL一定濃度的沙門(mén)氏菌TSB培養(yǎng)液16 h后，全部死亡。 對(duì)照組3只小白鼠腹腔注射0.3 mL的滅菌TSB培養(yǎng)液16 h后，無(wú)任何反應(yīng)。無(wú)菌采集實(shí)驗(yàn)組死亡小白鼠的肝臟，并進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)，結(jié)果分離出與病原菌形態(tài)極為相似的細(xì)菌，證明小鼠死亡由沙門(mén)氏菌引起。

7）實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)論。通過(guò)上述7種實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，確診為沙門(mén)氏菌和病毒性腹瀉病毒混合感染。

5 防治建議

1）及時(shí)隔離患病牛，并對(duì)環(huán)境進(jìn)行消毒?？墒褂?2%～4%氫氧化鈉進(jìn)行消毒，能夠很好地殺滅環(huán)境中的沙門(mén)氏菌，避免二次感染[1]。

2）免疫接種是預(yù)防的重要措施。制定合理免疫程序，及時(shí)對(duì)未發(fā)病牛群（包括1歲以上牛）接種牛副傷寒滅活疫苗，1 周歲以下的牛只接種2 mL，1周歲以上使用劑量為5 mL。接種牛副傷寒滅活疫苗1周后接種牛病毒性腹瀉疫苗，每頭接種2 mL，21 d后以相同劑量進(jìn)行二免[2]。

3）患牛的治療一定要結(jié)合實(shí)際情況。根據(jù)患牛表現(xiàn)出的臨床癥狀，給予適量抗生素，及時(shí)補(bǔ)液和補(bǔ)充電解質(zhì)。要禁止使用皮質(zhì)類(lèi)固醇藥物，否則會(huì)明顯加劇病牛消化道潰爛癥狀，對(duì)口腔糜爛或潰瘍的病牛應(yīng)用外用藥物對(duì)癥治療[3]。

4）加強(qiáng)牛群飼養(yǎng)管理。對(duì)患病牦牛犢牛進(jìn)行圈養(yǎng)飼喂補(bǔ)飼，增加飼草料適口性和營(yíng)養(yǎng)，提升病牛機(jī)體的免疫力。

5）使用益生菌。飼料中添加或灌服適當(dāng)濃度的乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌等益生菌，增加胃腸道有益菌群，調(diào)節(jié)胃腸道微生物平衡和提高免疫力，降低疾病對(duì)機(jī)體的損害程度[4]。

6）加強(qiáng)引種調(diào)運(yùn)工作。在購(gòu)買(mǎi)牛之前，需要對(duì)養(yǎng)牛場(chǎng)（戶(hù)）進(jìn)行必要的評(píng)估，以保證牛群的健康[3]。運(yùn)輸過(guò)程中和到達(dá)目的地后，最大限度減少牛群的應(yīng)激。

7）開(kāi)展監(jiān)測(cè)。通過(guò)胎盤(pán)屏障垂直傳播并感染胎兒是導(dǎo)致牛群持續(xù)性感染病毒性腹瀉病毒的重要原因[5]，該病流行地區(qū)應(yīng)在繁殖季節(jié)前應(yīng)對(duì)牛群開(kāi)展必要的監(jiān)測(cè)，及時(shí)淘汰感染牛只[6]。

6 討論

隨著家畜在不同地域的交易和流通日益頻繁，裕固縣牦牛發(fā)生的疫病種類(lèi)和數(shù)量也在持續(xù)上升，肅南牦牛這一生活在祁連山高海拔地區(qū)的獨(dú)有牦牛品種有關(guān)沙門(mén)氏菌及病毒性腹瀉病毒混合感染的相關(guān)報(bào)道尚缺乏。牛病毒性腹瀉病毒在我國(guó)各地區(qū)的感染情況較為嚴(yán)重，已成為威脅牛養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染病之一，此次是首次在肅南牦牛中檢出病毒性腹瀉病毒感染的報(bào)道，說(shuō)明肅南牦牛群體中也存在牛病毒性腹瀉病毒病的流行和感染，因?yàn)榕２《拘愿篂a病毒病大部分是隱性感染和免疫耐受，導(dǎo)致沒(méi)有明顯的臨床癥狀，而沒(méi)有被重視，所以應(yīng)該要及時(shí)采取積極有效的防控措施來(lái)遏制該病不斷蔓延[6]。沙門(mén)氏菌是生產(chǎn)生活中常見(jiàn)的一種病菌，血清型多[4]，可根據(jù)病牛臨床特征和分離培養(yǎng)判定病原，并進(jìn)行對(duì)癥治療，常用的抗生素對(duì)牛沙門(mén)氏菌病應(yīng)具有較好療效，但是從該菌的耐藥性來(lái)看，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)可較為準(zhǔn)確的選擇應(yīng)用藥敏性高的藥物，提升療效，縮短用藥時(shí)間，降低治療經(jīng)濟(jì)成本[1]。

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