克氏原螯蝦的三代轉(zhuǎn)錄組測序分析

摘要：為探究在病原刺激情況下克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）的轉(zhuǎn)錄組信息，采用PacBio平臺的單分子實(shí)時測序技術(shù)（SMRT），對使用弧菌刺激下的克氏原螯蝦的血淋巴、肝胰腺、鰓、腸、淋巴器官和肌肉的混合組織樣進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序，獲得克氏原螯蝦的全長轉(zhuǎn)錄本文庫。首先，使用TRIzol法提取總RNA合成雙鏈cDNA用于SMRTbell建庫和測序，利用SMRT分析套件進(jìn)行插入片段識別，Reads分類、聚類和校正，利用BUSCO單拷貝同源數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行組裝的完整性評價(jià)，通過使用CD-HIT軟件，將序列進(jìn)行去冗余分析，最后利用公共數(shù)據(jù)庫NR、NT、SwissProt、KOG、GO、Pfam及KEGG對克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋。全長轉(zhuǎn)錄組得到改良后一致序列149 213個，序列平均長度為2 213 bp。BUSCO單拷貝同源數(shù)據(jù)庫完整性評價(jià)，約有95.8%完整基因元件，說明大多數(shù)保守基因組裝較完整，組裝結(jié)果較可靠。在NR數(shù)據(jù)庫注釋得到110 181條序列，分別比對到1 373個物種，其中與美洲海螯蝦（Homarus americanus）基因相似的序列最多，為48 433 條。與GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，統(tǒng)計(jì)注釋到結(jié)合和催化活性功能最多，分別為14 327和13 344個。KOG功能注釋分為25個功能組分，其中，一般功能預(yù)測最多，為20 269個。KEGG注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的代謝通路注釋的基因數(shù)最多，為12 277個。本研究過程中組裝并獲得完整良好的序列，與功能數(shù)據(jù)庫比對得出序列的功能特性，可為探究克氏原螯蝦的功能基因、免疫響應(yīng)和相關(guān)代謝通路等提供可靠的基因組資源。

關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦；轉(zhuǎn)錄組；三代測序；功能注釋

中圖分類號：S917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）12-0187-08

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）別稱淡水小龍蝦，屬于甲殼綱、十足目、螯蝦科水生動物［1］?？耸显r是一種富含人體所必需的多種礦物質(zhì)和不飽和脂肪酸的低脂肪、高蛋白的優(yōu)質(zhì)淡水蝦［2-3］。隨著克氏原螯蝦的人工養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大，其病害問題日益增多。因此，通過探究病原菌侵入克氏原螯蝦先天免疫系統(tǒng)的分子機(jī)制，可為防治病原侵害提供科學(xué)依據(jù)。

目前，以illumina平臺等二代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)進(jìn)行序列功能研究的仍占據(jù)大多數(shù)，其測序結(jié)果比真核生物RNA長度要短得多［4］。隨著轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)資源的不斷開發(fā)，全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)不僅為功能基因注釋提供一種更為全面的方法，同時，注釋結(jié)果也更加準(zhǔn)確［5］。以PacBio為代表的第三代測序技術(shù)具有較高的讀長性，能很好地解決二代測序中存在的讀長度不足而造成的不完全拼接問題［6-8］。

目前，有關(guān)無脊椎動物先天免疫分子機(jī)制研究的理論支持主要通過二代轉(zhuǎn)錄組測序分析，其測序方式揭示無脊椎動物的相關(guān)免疫功能基因非常有限。因此，利用三代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對克氏原螯蝦進(jìn)行基因組學(xué)分析，為進(jìn)一步探究克氏原螯蝦先天免疫分子機(jī)制提供更多的理論基礎(chǔ)。采用三代測序技術(shù)的PacBio平臺對克氏原螯蝦全長轉(zhuǎn)錄組測序。通過生物信息學(xué)手段，進(jìn)行序列拼接、分類、功能注釋和代謝途徑分析，獲得豐富的功能序列信息，為后續(xù)研究克氏原螯蝦系列功能基因及深入探究基因組學(xué)等提供理論支持和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

克氏原螯蝦（15～20 g/尾），購買自內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市友誼瑞福海鮮市場，預(yù)養(yǎng)1周后進(jìn)行哈維氏弧菌免疫刺激，每尾蝦注射量為100 μL，細(xì)菌濃度為 2×107 CFU/mL，利用無菌注射器從蝦腹部第2～3體節(jié)肌肉處進(jìn)行緩慢注射。24 h后，隨機(jī)挑選活力較強(qiáng)的克氏原螯蝦3～6尾進(jìn)行解剖取樣，分別取血淋巴、肝胰腺、鰓、腸組織、淋巴器官和肌肉組織適量進(jìn)行充分混合，之后混合樣品放入-80 ℃冰箱中保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取

取低溫凍存的無菌條件下采集的哈維氏弧菌免疫刺激的克氏原螯蝦的血淋巴、肝胰腺、鰓、腸組織、淋巴器官和肌肉組織的混合組織樣品，使用TRIzol法提取總RNA。為保證RNA質(zhì)量，提取完成后利用NANO Drop 2000儀測量RNA濃度。

1.3 文庫構(gòu)建與測序

先混合組織樣品的總RNA，再用UMI base PCR cDNA Synthesis Kit試劑盒合成第一鏈cDNA，通過PCR擴(kuò)增合成第二條鏈cDNA。雙鏈DNA在二次PCR擴(kuò)增后，要進(jìn)行連接SMRT啞鈴型接頭形式的全長cDNA的末端修復(fù)，用于SMRT bell建庫和測序［9］。后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組序列測定工作由北京華大基因科技有限公司完成。

1.4 全長轉(zhuǎn)錄組測序及序列分析

測序獲得的原始下機(jī)數(shù)據(jù)，利用SMRT分析套件進(jìn)行插入片段識別［Reads of insert（ROI）］，Reads分類（Classify），Reads聚類和校正（Cluster、Quvier），最終得到高質(zhì)量的全長一致性序列（circular consensus sequence，CCS）。通過對全長序列的聚類，得到了聚類一致性序列，并對其進(jìn)行改良，從而得到較高質(zhì)量的一致性序列，供以后進(jìn)一步深入研究。

1.5 全長轉(zhuǎn)錄組序列功能注釋及結(jié)構(gòu)分析

通過使用CD-HIT軟件，將改良后的一致序列進(jìn)行去冗余分析，并將其與現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，通過對其序列的相似性分析，最終確定了最相似性的蛋白質(zhì)。利用公共數(shù)據(jù)庫NR、NT、SwissProt、KOG、GO、Pfam及KEGG對克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋。

1.6 數(shù)據(jù)獲取

本研究報(bào)告的數(shù)據(jù)保存在中國科學(xué)院北京基因組研究所中國國家生物信息中心（CNCB），網(wǎng)址為：https：//www.cncb.ac.cn/，項(xiàng)目編號：PRJCA017033。在CNCB數(shù)據(jù)庫OMIX資源庫中，網(wǎng)址為：https：//ngdc.cncb.ac.cn/omix，編號：OMIX004094-07。

2 結(jié)果與分析

2.1 全長轉(zhuǎn)錄組測序與組裝分析結(jié)果

2.1.1 測序結(jié)果與數(shù)據(jù)組裝

由圖1可知，通過PacBio測序平臺對克氏原螯蝦血淋巴、肝胰腺、鰓、腸、淋巴器官和肌肉組織混合樣進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)處理后共獲得39 945 085個子序列，為 73.25 GB，平均子序列長度為1 833.71 bp，N50為 1 977 bp。利用ZMW孔中的子序列得到CCS聚類之后的序列數(shù)為887 123個，平均序列長度為 2 011 bp。將CCS拆分成2個部分，依據(jù)其是否含有完整的5′端primer、poly（A）尾巴、3′端primer，分別為全長非嵌合序列（full-length non- chimeric read，F(xiàn)LNC）、非全長序列（non-full-lenth）。ROI處理后最終僅有FLNC進(jìn)入后續(xù)分析。全長非嵌合序列有885 164個，序列的平均長度為1 974 bp。全長轉(zhuǎn)錄組得到改良后一致序列149 213個，序列平均長度為2 213 bp。

2.1.2 BUSCO組裝評價(jià)結(jié)果

利用BUSCO單拷貝同源數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行評價(jià)，并將其與保守基因進(jìn)行對比，可以了解其組裝的完整性［10］。一般來說，如果藍(lán)色部分complete的比例gt;70%，則認(rèn)為組裝效果較好。由圖2可知，約有95.8%的完整基因元件，說明大多數(shù)保守基因組裝得比較完整，組裝結(jié)果的也比較可靠。S值表示檢測到的完整單拷貝同源基因，約占91.42%，M值表示被過濾掉的序列，僅為3.96%，說明誤裝的比例非常低，本次的組裝非常完整。

2.2 Unigene功能注釋

2.2.1 注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)

去冗余完畢后，由表1可知，對去冗余得到的Isoform進(jìn)行七大功能數(shù)據(jù)庫（NR、NT、GO、KOG、Pfam、KEGG和SwissProt）注釋。

由圖3可知，在NR數(shù)據(jù)庫中，將轉(zhuǎn)錄組獲得的單基因簇序列進(jìn)行比對，共獲得注釋Unigenes 110 181 個，比對到1 373個物種，其中，美洲螯龍蝦（Homarus americanus）的同源序列最多，為48 433個，占注釋序列總數(shù)約43.96%，推測克氏原螯蝦與美洲螯龍蝦同源性較高；其次比對較多的前幾個物種包括日本對蝦（Penaeus japonicus）4 413個，占總數(shù)4%、南美白對蝦（Penaeus vannamei）3 551個，占總數(shù)3%、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）2 739個，占總數(shù)3%、嗜熱四膜蟲（Tetrahymena thermophila）2 676個，占總數(shù)2%、灰眼雪蟹（Chionoecetes opilio）2 483個，占總數(shù)的2%。

2.2.2 GO功能注釋結(jié)果

GO是用來描述基因在分子、細(xì)胞和組織水平的功能體現(xiàn)，分為基因的生物過程（biological process，BP）和參與的生物過程、基因所在位置的的細(xì)胞組成（cellular component，CC）、基因進(jìn)行表達(dá)的分子功能（molecular function，MF）三大類。對獲得的序列進(jìn)行GO注釋，結(jié)果顯示，有25 272條unigenes獲得GO注釋，占總數(shù)的16.95%，注釋到生物過程（BP）有32 453個、細(xì)胞組分（CC）有49 922個、分子功能（MF）有33 192個，分別注釋了26、19、14個亞類。

由圖4可知，在生物過程中，有9 693個序列片段參與細(xì)胞過程（cellular process），占生物過程的29.87%、新陳代謝過程（metabolic process）有7 356個，占22.67%、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）有 2 988 個，占9.21%。在細(xì)胞組分中，主要跟膜結(jié)構(gòu)（membrane）有8 933個、膜部分（membrane part）有8 272個和細(xì)胞（cell）有8 249個有關(guān)，分別占總unigenes的17.89%、16.57%和16.52%。在分子功能中，主要跟結(jié)合（binding）、催化活性（catalytic activity）和轉(zhuǎn)運(yùn)活性（transporter activity）有關(guān)，分別有14 327、13 344、2 215個，占總數(shù)的43.16%、40.2%和6.67%。

2.2.3 KOG 分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果

由圖5可知，將克氏原螯蝦單基因簇利用KOG數(shù)據(jù)庫對比，共得到 136 690 個注釋信息，可分成四大類，分別是細(xì)胞過程和信號、信息存儲和處理、代謝及特征不佳。四大類包含25個功能組分，一般功能預(yù)測是25個功能組分中獲得注釋較多的功能組分，有20 269個，占總數(shù)的14.83%，其次是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，有18 195個，占總數(shù)的13.31%，注釋信息中還包括翻譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白，共有11 035個，占總數(shù)的8.07%。

2.2.4 KEGG功能注釋結(jié)果

由圖6可知，通過KEGG數(shù)據(jù)庫對克氏原螯蝦單基因簇對比，注釋到六大類45小類，六大類包括：細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、代謝和有機(jī)體系統(tǒng)。其中，細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理中的基因數(shù)量分別有21 121、16 167、14 823個，人類疾病中的基因數(shù)量有48 669個，代謝中的基因數(shù)量有29 262個，有機(jī)體系統(tǒng)中的基因數(shù)量有36 990個。最終發(fā)現(xiàn)，在人類疾病中的基因數(shù)被注釋最多。其中，基因數(shù)量較多的代謝通路有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 12 277 個，全局和概覽圖有11 231個，耐藥性抗腫瘤藥最少，僅有1個。

2.3 CDS預(yù)測結(jié)果

采用TransDecoder軟件，對Isoform中的候選編碼區(qū)進(jìn)行識別，首先提取最長的開放閱讀框，再使用Blast比對SwissProt數(shù)據(jù)庫和Hmmscan進(jìn)行Pfam蛋白同源序列的檢索，并對其進(jìn)行編碼預(yù)測。

由圖7可知，被認(rèn)為是蛋白編碼區(qū)的基因片段一共有91 080個，這些片段的大小主要在300～3 000 bp。

2.4 SSR檢測結(jié)果

使用MISA對Isoform進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)存在 75 892 個SSR位點(diǎn)，分布在46 092個Unigene中。由圖8可知，從單核苷酸到三核苷酸重復(fù)數(shù)最多，是總SSR位點(diǎn)數(shù)量的96.42%。其中，以AC/GT堿基數(shù)最多，為18 322個；AG/CT和AT/AT次之，分別為 6 130 和4 899個；CG/CG堿基數(shù)最少，為78個。

2.5 lncRNA分析結(jié)果

使用3款預(yù)測軟件及1個數(shù)據(jù)庫對轉(zhuǎn)錄本的編碼能力進(jìn)行預(yù)測，區(qū)分mRNA和lncRNA。3個軟件分別為CPC、txCdsPredict及CNCI；數(shù)據(jù)庫為pfam。利用CD-HIT軟件去冗余得到的基因進(jìn)行編碼能力預(yù)測。由圖9可知，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對后預(yù)測其編碼能力，綜合不同算法最終共預(yù)測獲得61 417條lncRNA。

2.6 轉(zhuǎn)錄因子分析結(jié)果

通過使用動物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫animal TFDB 2.0對結(jié)果進(jìn)行鑒定， 由圖10可知， 得到的轉(zhuǎn)錄因子有19 115個， 從屬于66個轉(zhuǎn)錄因子家族中。 其中，zf-C2H2家族、bHLH家族、Homeobox家族、HMG家族分別有6 055、2 555、1 524、923個，是存在比較多的轉(zhuǎn)錄因子家族。而Family家族、NCU-G1家族、PAX家族最少，均僅有1個。

3 討論

克氏原螯蝦是一種重要的甲殼動物，其轉(zhuǎn)錄組特征和基因組信息研究還不夠深入。第三代高通量序列采用PacBio平臺，具有顯著的讀長優(yōu)勢［8］。李喜蓮等以紅螯螯蝦為研究對象，進(jìn)行Illumina Hi Seq測序，所有reads組裝后獲得了67 369個Unigene［11］。周錢森等以錦繡龍蝦為研究對象，進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了13 297條序列［12］。趙剛等以巖原鯉為研究對象，進(jìn)行全組織轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了83 252條序列［13］。Zhang等以肝胰腺、心胃、心臟、肌肉和幽門胃為材料，通過PacBio亞型測序（Iso-Seq）和Illumina配對末端短讀測序方法對凡納濱對蝦進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序，獲得72 648條高質(zhì)量序列，平均長度為2 545 bp［14］。Wang等通過對中國明對蝦雌雄性的肌肉和性腺進(jìn)行基于Illumina平臺的測序分析，獲得10 795條序列［15］。本研究中通過PacBio平臺的SMRT測序技術(shù)對克氏原螯蝦全長轉(zhuǎn)錄組測序，最終獲得了149 079條高質(zhì)量序列，相較于上述結(jié)果中的紅螯螯蝦、錦繡龍蝦、巖原鯉、凡納濱對蝦和中國明對蝦而言，獲得的序列數(shù)更多。

梁妃爽等利用第三代測序技術(shù)對波紋龍蝦進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序，為進(jìn)一步研究波紋龍蝦的基因功能和相關(guān)代謝途徑、信號通路等提供了數(shù)據(jù)支撐［16］。Zhang等利用二代與三代相結(jié)合的測序技術(shù)，篩選出施氏鱘性腺中早期配子發(fā)生的相關(guān)基因，為研究施氏鱘生殖調(diào)控的機(jī)制提供了理論依據(jù)［17］。Li等通過三代測序技術(shù)對中華絨螯蟹篩選可能參與睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的候選基因［18］。Shi等通過研究中國對蝦被WSSV感染后的測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)吞噬體、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、抗原處理和遞呈途徑等與免疫應(yīng)答有關(guān)的通路以及免疫基因被激活［19］。由于無脊椎動物沒有像脊椎動物一樣的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，因此它們不具有高度專一的適應(yīng)性免疫應(yīng)答系統(tǒng)［20］。然而，當(dāng)遇到病原微生物感染時，無脊椎動物機(jī)體卻能準(zhǔn)確迅速產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這一過程中先天性免疫便起到了重要的作用。本研究通過對克氏原螯蝦在哈維氏弧菌免疫刺激下進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)與生長發(fā)育、免疫相關(guān)的多種代謝通路和信號途徑，包括了糖酵解、TCA循環(huán)、戊糖磷酸途徑、JAK-STAT信號通路、Notch信號通路、cAMP信號通路等。

4 結(jié)論

本研究通過SMRT技術(shù)對克氏原螯蝦的全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，去冗余后，共產(chǎn)生149 079條高質(zhì)量序列。將對去冗余得到的Isoform進(jìn)行七大功能數(shù)據(jù)庫注釋。全長轉(zhuǎn)錄組測序可以獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄本，快速篩選出多個候選基因的全長序列，為基因功能研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。同時，通過序列組裝、功能注釋和代謝通路的分析，可以為以后的基因組序列提供依據(jù)，為今后的基因組研究奠定基礎(chǔ)。通過對克氏原螯蝦全長轉(zhuǎn)錄組的分析，極大地豐富了克氏原螯蝦的基因數(shù)據(jù)庫資源，為進(jìn)一步研究克氏原螯蝦的功能基因和免疫應(yīng)答機(jī)制提供了分子基礎(chǔ)。

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收稿日期：2023-06-20

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：32060834）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金-杰出青年培育基金（編號：2020JQ03）。

作者簡介：張明達(dá)（1999—），男，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，主要研究方向無脊椎動物的先天免疫。E-mail：1501643202@qq.com。

通信作者：杜志強(qiáng)，博士研究生，教授，主要研究方向無脊椎動物的先天免疫。E-mail：nmdzq1981@163.com。[HJ]