RNA干擾防控?zé)煵蔹S瓜花葉病毒的效果

摘要：煙草黃瓜花葉病毒病是危害煙草的重要病害之一，嚴(yán)重影響煙株田間生長發(fā)育。為防控?zé)煵蔹S瓜花葉病毒病，根據(jù)已經(jīng)構(gòu)建的靶向沉默黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）相關(guān)基因的VIGS載體，使用單個載體和混合載體沉默與CMV有關(guān)的CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP和CMV-CP這4個病毒編碼蛋白基因，測定基因沉默后CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP、CMV-CP相對表達(dá)量及CMV濃度，并評價VIGS對煙草黃瓜花葉病毒病的防治效果。結(jié)果表明：單獨接種和混合接種4種載體煙株均能有效沉默相應(yīng)靶基因的表達(dá)，單獨接種時，對CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP、CMV-CP的沉默效率分別為10.78%、60.36%、32.92%、58.95%，pTRV2-CMV-2a載體單獨接種對CMV-2a基因的沉默效率最高；混合接種對CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP、CMV-CP基因的沉默效率分別為18.78%、44.18%、28.33%、35.64%，混合接種也是對CMV-2a基因的沉默效率最高。接種VIGS-TRV載體的煙株在接種病毒后21 d內(nèi)，單獨接種和混合接種載體均有效下調(diào)CMV濃度，且混合接種的效果大于單一載體，有效地抑制煙株內(nèi)CMV的傳播，減輕煙草黃瓜花葉病毒病的發(fā)病率和病情指數(shù)，接種混合載體的效果最佳，為有效防控?zé)煵蔹S瓜花葉病毒提供了新的方法。

關(guān)鍵詞：煙草；VIGS；黃瓜花葉病毒?。幌鄬虮磉_(dá)量

中圖分類號：S435.72；Q789" 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）13-0139-06

黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）是雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的典型成員［1］，CMV的特點是宿主范圍廣，可感染全球100多個植物科，至少1 200種易感物種，包括農(nóng)作物、水果、蔬菜、觀賞植物、木本植物和其他具有重要經(jīng)濟意義的植物［2］。CMV極易通過植物汁液的摩擦接種傳播，主要是通過蚜蟲以非持久性的方式傳播，目前有70多種蚜蟲可進行CMV病毒的傳播，并且棉蚜和桃蚜是傳播CMV的主要種類［3］；CMV還可以通過受感染的種子、作物殘體、非媒介土壤、花粉等其他途徑傳播［4］。病毒感染植物后，通常會干擾葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能，從而誘發(fā)典型的光合作用相關(guān)癥狀，如萎黃和花葉等［5］。在整個煙草生育期內(nèi)煙草黃瓜花葉病毒病均可發(fā)生，其中旺長期發(fā)病最重。初期表現(xiàn)出輕微花葉，葉緣微向上卷曲，表面絨毛脫落，失去光澤；發(fā)病嚴(yán)重時煙株矮化，病葉上出現(xiàn)深綠的泡斑或褐色斑，葉片細(xì)長成“鼠尾狀”［6-7］。由CMV引起的煙草黃瓜花葉病毒病，不僅嚴(yán)重影響了煙葉產(chǎn)量，還使烤后煙葉顏色不均勻，化學(xué)成分不協(xié)調(diào)，香吃味降低，品質(zhì)下降［8］。目前防治黃瓜花葉病毒病的主要方法有農(nóng)業(yè)防治［9-12］、化學(xué)防治［13-16］、生物防治［17-19］、抗病育種防治［20-21］，最廣泛使用的是化學(xué)防治方法，但是化學(xué)藥劑的過度施用可能會使病毒或蚜蟲產(chǎn)生耐藥性，也會使防治效果變差，并且易造成藥劑殘留、環(huán)境污染等問題。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）是一種瞬時沉默，已經(jīng)成為一種極其強大的功能基因組學(xué)工具，用于沉默植物中靶基因的表達(dá)［22］，VIGS可以使用不同的病毒載體，其中煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）的優(yōu)點為沉默效率高、沉默持續(xù)時間長、侵染宿主范圍廣、病毒誘發(fā)的癥狀輕微等［23］，因此TRV載體被廣泛用于各種植物的基因沉默［24］，例如草莓［25］、棉花［26］、馬鈴薯［27］等。陳紫玉等利用VIGS技術(shù)沉默轉(zhuǎn)錄因子FcMYB114調(diào)控?zé)o花果果皮花青素合成［28］；李萌晗等在油棕中利用VIGS技術(shù)沉默油棕中二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGAT）基因?qū)τ妥嘏郀铙w進行優(yōu)化［29］。劉天波等將VIGS技術(shù)應(yīng)用到K326煙草品種的馬鈴薯Y病毒病防治中［30］。有研究表明，在不同作物中CMV發(fā)生的相關(guān)基因是不同的［31］，因此本研究根據(jù)筆者所在實驗室已經(jīng)構(gòu)建出的pTRV2-CMV-1a、pTRV2-CMV-2a、pTRV2-CMV-MP和pTRV2-CMV-CP 4這個載體，比較煙株接種單個載體和混合4種載體后煙株對CMV的反應(yīng)，以期篩選出大田中防控CMV的最適VIGS體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022年4—5月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)進行。參試烤煙品種：中煙100，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院育種實驗室提供。菌株和病毒：本研究所用CMV病毒葉片、pTRV1載體、pTRV2載體、pTRV2-CMV-1a載體、pTRV2-CMV-2a載體、pTRV2-CMV-MP和pTRV2-CMV-CP載體均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院育種實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank發(fā)布的CMV相關(guān)基因序列設(shè)計CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP、CMV-CP的擴增引物，并在VIGS-TRV載體沉默片段外的區(qū)域設(shè)計了擴增引物CMV-F/CMV-R，詳見表1。

1.2.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草

將構(gòu)建好的pTRV1、pTRV2、pTRV2-CMV-MP、pTRV2-CMV-1a、pTRV2-CMV-2a和pTRV2-CMV-CP載體分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)24 h，使用分光光度計調(diào)整濃度D600 nm為0.8～1.0，使用pTRV1分別與pTRV2和4種載體等比混合，取混合好的菌液裝入50 mL離心管中，離心，棄上清液，加入等體積的侵染緩沖液（0.1 mmol/L乙酰丁香酮、50 mmol/L MES、50 mmol/L MgCl2）重懸，避光保存2 h后使用。選取長勢均勻一致的6葉1心煙苗，用注射器注射侵染液于煙株心葉向下第2片葉及向下第3片葉背面，每株煙注射2片葉，每片葉注射面積約為直徑1 cm的硬幣大小。

1.3 試驗設(shè)計

為探究所構(gòu)建的沉默CMV相關(guān)基因VIGS載體的抗CMV效果，共設(shè)置7個處理：CK，不接種載體；空載， 接種含pTRV2空載體的農(nóng)桿菌液；C1， 接種含TRV-1a載體的農(nóng)桿菌液；C2，接種含TRV-2a載體的農(nóng)桿菌液；C3，接種含TRV-MP載體的農(nóng)桿菌液；C4，接種含TRV-CP載體的農(nóng)桿菌液；C，接種含TRV-1a、TRV-2a、TRV-MP、TRV-CP載體的農(nóng)桿菌液。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 CMV病毒累積量及基因沉默效果的測定

在接種病毒7 d后，分別隨機選取各處理3株長勢一致的煙株，取樣，充分消毒后提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在Quant Studio Tnl 6 Flex 熒光定量 PCR 儀器（ABI公司）上進行熒光定量檢測，以煙草26S rRNA為內(nèi)參基因，根據(jù)表1中引物，分析檢測結(jié)果中的CT值，采用2-ΔΔCT法分析CMV基因的相對表達(dá)量。沉默效率的計算公式為：（1-試驗組相對基因表達(dá)量）/試驗組相對基因表達(dá)量×100%。

1.4.2 病毒濃度的測定

各處理選擇發(fā)病情況一致的煙株，分別在接種CMV病毒后7、14、21 d取樣，保存至-80 ℃冰箱，使用ELISA方法測定煙株內(nèi)CMV濃度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，采用Duncans法多重比較，采用Excel 2010整理分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的沉默效果分析

在接種病毒7 d后，對上述7個處理的煙株取樣分析CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP、CMV-CP基因的表達(dá)量，結(jié)果見圖1、圖2。 從圖1可以看出，與對照相比，C1煙株的CMV-1a基因表達(dá)量有所降低，沉默效率為10.78%；C2的CMV-2a基因表達(dá)量顯著降低，沉默效率為60.36%；C3的CMV-MP基因沉默效率為32.92%；C4的CMV-CP基因沉默效率為58.95%。相比較而言，對TRV-2a、TRV-CP載體的沉默效果較好，TRV-MP次之，TRV-1a較差。

由圖2可知，將4個載體混合侵染煙株（C處理），對CMV-1a的基因沉默效率為18.78%，對CMV-2a的基因沉默效率最高，為44.18%，對CMV-MP的基因沉默效率為28.33%，對CMV-CP的基因沉默效率35.64%。結(jié)果表明，接種混合載體（C處理）對CMV各基因的沉默效果與采用單一VIGS-TRV載體（C1、C2、C3、C4處理）接種對目的基因的沉默效果相似，也是對CMV-2a、CMV-CP基因的沉默效果較好。

綜上分析證明：4個VIGS-TRV載體均能在一定程度上沉默對應(yīng)的靶基因，且TRV-2a載體對CMV-2a基因的沉默效率最高，能較大程度地干擾病毒RNA聚合酶的形成，進而抑制煙株內(nèi)CMV的復(fù)制過程。另一方面，無論是單獨使用各載體還是混合使用（TRV-1a、TRV-2a、TRV-MP和TRV-CP 4個載體混合），均能有效干擾目的基因CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP、CMV-CP的表達(dá)。

2.2 攜帶VIGS-TRV不同載體的煙草對細(xì)胞內(nèi)CMV病毒濃度的影響

分別在接種CMV病毒后7、14、21 d取樣，采用酶聯(lián)免疫分析試劑盒對參試的7個處理煙株內(nèi)CMV病毒濃度進行測定。由圖3可以看出，在接種CMV后，從各處理煙株體內(nèi)的病毒濃度變化可以看出，攜帶VIGS-TRV載體的煙株與CK相比，CMV的濃度顯著降低，這說明攜帶VIGS-TRV載體的煙株能夠有效降低CMV濃度。

在接種病毒7 d時，C1、C2、C3、C4煙株體內(nèi)的CMV病毒濃度與對照相比，分別降低了8.8%、32.8%、10.5%、18.4%，其中C2的降低幅度較大。在接種病毒14 d時，C1、C2、C3、C4煙株體內(nèi)CMV濃度與對照比分別降低了13.5%、 28.5%、23.9%、7.3%，其中還是C2的降低幅度較大。在接種病毒后21 d時，C1、C2、C3、C4處理煙株體內(nèi)CMV濃度與對照相比分別降低了6.6%、21.6%、9.6%、13.5%，依然是C2處理的降低幅度較大。

采用混合載體接種（C處理）的CMV病毒濃度同樣顯著低于對照，在接種CMV后7、14、21 d檢測，其CMV病毒濃度分別降低了45.6%、39.1%、36.3%，其降低幅度均大于C1、C2、C3、C4處理。這不僅說明采用混合載體接種對CMV的抑制有效，而且效果遠(yuǎn)大于單一載體的使用。由此可以推論，接種4種載體，在煙草體內(nèi)同時對CMV的4個基因位點進行沉默的效果優(yōu)于單獨1個位點沉默（C1、C2、C3、C4處理）的效果。

2.3 沉默CMV相關(guān)基因的VIGS-TRV載體的表型抗病效果分析

2022年4—5月，采用網(wǎng)室隔離方法，在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)進行模擬田間試驗，進一步驗證VIGS載體的表型抗病效果。試驗設(shè)置7個處理，CK1為不接種載體，不接種病毒的空白對照；CK2為不接種載體，接種病毒的處理；C1～C處理同“1.3”節(jié)。在接種病毒后7 d起，定株觀察煙株病癥發(fā)展情況，每5 d拍1次照片觀察表型抗病效果，結(jié)果列于圖4中。

從圖4可以看出，隨時間變化，各處理煙株葉片均出現(xiàn)了花葉癥狀，煙株發(fā)病情況均逐漸加重，但嚴(yán)重程度有所不同，其中C處理煙株葉片的花葉程度最輕微，病癥發(fā)展較為緩慢。CK2隨時間變化病癥逐漸加重，到后期葉片明顯失綠變形，葉片細(xì)長成鼠尾狀。與CK1相比，接種載體的煙株均沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的葉片變形癥狀，但有不同程度的花葉癥狀，其中C1處理煙株葉片的花葉癥狀最嚴(yán)重，C3、C4處理花葉癥狀較為嚴(yán)重，C1、C3處理出現(xiàn)花葉的速度較快，C2處理和C處理煙株出現(xiàn)花葉病癥和病癥發(fā)展速度較慢。結(jié)果表明，接種混合載體的煙株，同時沉默CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP和CMV-CP基因的表達(dá)，能夠提高對CMV病毒的抗性，延緩發(fā)病時間，可以很好地控制煙草黃瓜花葉病的病癥發(fā)展。

綜上，構(gòu)建TRV-1a、TRV-2a、TRV-MP、TRV-CP的4個VIGS載體不論是單獨使用還是混合使用，均能有效干擾CMV靶基因的表達(dá)；其中TRV-2a載體對CMV的干擾效果最好。將4個載體混合使用能夠較好地沉默CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP和CMV-CP基因的表達(dá)；在7、14、21 d有效降低煙株內(nèi)CMV病毒濃度；減輕煙草黃瓜花葉病毒病的發(fā)病率和病情指數(shù)。田間模擬試驗的結(jié)果也證明，盡管實驗室分析證明使用TRV-2a單一載體對CMV干擾效果較好，但仍然不能達(dá)到較好的防治效果；而采用混合載體接種煙草，對CMV的4個基因位點同時進行干擾沉默，能有效防控?zé)煵蔹S瓜花葉病毒病，延緩發(fā)病時間，控制煙草黃瓜花葉病的病癥發(fā)展。

3 討論

在煙草種植生產(chǎn)過程中，病毒病是主要病害之一。據(jù)研究，河南煙區(qū)黃瓜花葉病是病毒病的主要類型，占80%以上。但由于煙草屬內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）的抗病基因［32］，故抗CMV的育種一直是生物防治中的一個難題。本研究利用RNA干擾技術(shù)的原理，構(gòu)建出4個VIGS-TRV載體，完成了針對CMV防治的VIGS技術(shù)體系，探討了該技術(shù)在應(yīng)用方面的技術(shù)模式，目前在防治煙草病毒病領(lǐng)域利用生物技術(shù)手段的研究鮮有報道。筆者所在實驗室成功構(gòu)建出沉默CMV關(guān)鍵基因（CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP、CMV-CP）的TRV載體，即TRV-1a、TRV-2a、TRV-MP、TRV-CP。

本研究結(jié)果表明，TRV-2a和TRV-CP具有較好的沉默目標(biāo)基因效果，而TRV-1a和TRV-MP沉默對應(yīng)靶基因的效果較差。TRV-1a的靶基因片段大小最大（586 bp），TRV-MP（203 bp）最小。不同載體沉默對應(yīng)靶基因的效果不同［33］，可能是由于選取的片段大小不適宜，插入的靶基因片段如果過長會導(dǎo)致病毒載體在植物體內(nèi)不能有效復(fù)制，過小則不能有效沉默表達(dá)量較低的基因［34］，推測在CMV侵染普通煙草的過程中，CMV-2a和CMV-CP是起關(guān)鍵作用的致病基因，這與Wintermantel等的研究結(jié)果［35］相似。因此對于普通煙草的VIGS體系插入片段大小的選擇和CMV侵染普通煙草的關(guān)鍵致病基因還有待深入研究。

有研究表明，將不同基因片段同時組合到TRV病毒載體上，可顯著降低2個基因的表達(dá)量，說明VIGS可用于同時沉默2個目標(biāo)基因［36］。筆者將不同VIGS-TRV載體混合后接種到普通煙草上，發(fā)現(xiàn)接種混合載體的煙株對CMV的抗性好于接種單一載體的煙株。接種混合載體的煙株能夠有效沉默CMV各基因的表達(dá)，對CMV基因表達(dá)量和CMV病毒濃度具有較好的抑制效果，能夠更好地控制煙草黃瓜花葉病的病癥發(fā)生和蔓延。由于CMV是一個具有正義單鏈RNA基因組的三分體病毒，同時接種混合載體，可以同時沉默CMV基因組中4個基因的表達(dá)，干擾病毒復(fù)制酶和外殼蛋白的形成以及病毒在煙株內(nèi)的擴散。為此，筆者將混合載體-VIGS-CMV體系應(yīng)用到煙草黃瓜花葉病的田間防控中，結(jié)果表明，利用沉默CMV相關(guān)基因來防治煙草病毒病是一條可行的新途徑。

本試驗通過VIGS技術(shù)使用混合載體沉默CMV相關(guān)基因可以很好地防治煙草黃瓜花葉病，但是農(nóng)桿菌不易保存及運輸，下一步將解決農(nóng)桿菌液體的保存和運輸問題，有效防控田間煙草黃瓜花葉病。

4 結(jié)論

本研究表明，無論是單獨接種還是混合接種煙株均能有效沉默對應(yīng)靶基因的表達(dá)，單獨接種對CMV-2a基因的沉默效率最高，為60.36%，混合接種也是對CMV-2a基因的沉默效率最高，為44.18%。接種VIGS-TRV載體的煙株在接種病毒后21 d內(nèi)，能夠有效下調(diào)煙株的CMV基因表達(dá)量和病毒濃度，接種混合載體的效果最好，煙株的發(fā)病率和病情指數(shù)均最低，能夠延緩病害發(fā)生和蔓延。

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