摘要:基于特異性片段擴增(SCAR)和倍性鑒定蘭屬花卉,為雜交育種親本選配奠定基礎,以蘭屬花卉的27個大花蕙蘭和31個國蘭品種為試材,通過SCAR分子標記和流式細胞儀進行親緣關系和倍性檢測,構建系統(tǒng)進化樹。SCAR分子標記構建的系統(tǒng)進化樹結果顯示:58個品種聚為3支,第1支包括8個大花蕙蘭品種(福娘、523、紅袍等)和16個國蘭品種(碧龍紅素、汗血寶馬、出水芙蓉等),第2支為11個大花蕙蘭品種(金玉滿堂、日本香蘭、紅雙喜等)和6個國蘭品種(一代天驕、春蘭麻殼素、如意素荷等),第3支包括8個大花蕙蘭品種(616、黃金歲月、楊貴妃等)和9個國蘭品種(碧龍奇蓮、西蜀道光、大雪素等);倍性鑒定結果顯示:27個大花蕙蘭品種中有7個二倍體(日本櫻花、綠翡翠、夢境等)、16個三倍體(黃金歲月、蝶影、日本香蘭等)、4個四倍體(英雄、523、福娘等)。部分大花蕙蘭和國蘭品種親緣關系較近,可用作雜交育種親本,但由于大花蕙蘭倍性較為豐富。因此,大花蕙蘭作為雜交育種親本,選配時需進行倍性鑒定。綜上,SCAR分子標記能高效、全面和精準鑒別蘭屬花卉間的親緣關系,結合倍性鑒定,可為高效雜交育種奠定基礎。
關鍵詞:蘭屬花卉;SCAR分子標記;倍性鑒定;親本選配;大花蕙蘭
中圖分類號:S682.310.3" 文獻標志碼:A
文章編號:1002-1302(2024)13-0031-08
蘭花在我國擁有著2 000多年的栽培歷史,作為中國的十大名花之一,不僅擁有著重要的觀賞價值,還具有很高的藥用價值。蘭屬(Cymbidium)花卉包括地生蘭、附生蘭和腐生蘭,為草本植物。是蘭科下的一個屬。傳統(tǒng)意義上的中國蘭花僅指地生蘭,主要包括蘭屬中建蘭(C. ensifolium)、春蘭(C. goeringii) 、墨蘭(C. sinense)、寒蘭(C. kanran)、蕙蘭(C. faberi)、春劍(C. longibracteaturn)和蓮瓣蘭(C. lianpan),這7個品系的共同特點為株型矮小、緊湊,花清香、淡雅,花型花色豐富。大花蕙蘭(C. hybridum)作為近幾年熱銷的花卉之一,不僅用作鮮切花,還用于裝點室內(nèi)環(huán)境、饋贈親朋好友的禮儀盆花。其為蘭屬中以小花垂生種和大花附生種以及一些地生蘭為父母本,通過1個世紀的人工雜交,培育出色澤艷麗、植株強健、花朵碩大、花期較長的一類品種的統(tǒng)稱,即為品種群的統(tǒng)稱[1]。目前,在我國市場上大花蕙蘭的主要用途是做盆花和切花[2]。由于蘭屬植物原生種間遠緣雜交較易成功,在英國皇家園藝學會(RHS)上已經(jīng)注冊了許多雜交種,包括春蘭、墨蘭、建蘭和紋瓣蘭等4個品系的蘭花。前人研究發(fā)現(xiàn),利用春蘭、墨蘭、寒蘭等地生小花類與大花蕙蘭進行雜交,可以改良大花蕙蘭的花香、花色、葉色、葉寬、株高、株形、冠幅等性狀[3-4]。
特定序列擴增(sequence characterized amplified regions,SCAR)分子標記是一種單基因位點多態(tài)性標記技術。由于其具有分析快速準確、操作簡單、方便、價格低廉、單位點多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、特異性及重復性較高等特點,因此,該技術已被廣泛應用于各種分子育種之中,包括輔助育種、種質(zhì)鑒定、抗病基因連鎖定位、高密度遺傳圖譜構建。近年來,SCAR分子標記技術已經(jīng)在天麻、石斛、白芨中得到應用[5-7]。除此之外,SCAR分子標記在蘭花上也有一定的應用,如蝴蝶蘭、大花蕙蘭和國蘭[8-11]。
多倍體是指具有2套以上完整染色體組的生物個體,其廣泛存在于動植物及微生物中[12-14]。多倍體植物在外形上主要具有花朵大、葉片顏色較深、葉厚、果實大、莖稈相對粗壯等特征;在生理上具有較強的適應性和抗性[15-17]。常見的多倍體有三倍體、四倍體、五倍體、六倍體以及八倍體等。大花蕙蘭是天然的雜合體,具有不同的倍性(二倍體、三倍體、四倍體、五倍體及六倍體)且以三倍體居多,其品種具有類型繁多、花朵大、顏色豐富、花期較長等特點[18]。國蘭作為我國十大名花之一,傳承著我國悠久而璀璨的蘭文化,其主要特征是花色素雅、花小而奇特、花香清而不濁,無論是株型、花型還是葉藝都具有很高的觀賞價值。蘭屬花卉中的國蘭、大花蕙蘭品種資源豐富,但其株型、花色花型及花香差異較大,用于新種質(zhì)創(chuàng)制的親本,可極大滿足市場需要。目前,利用SCAR分子標記及倍性檢測共同對物種進行研究的方法已經(jīng)在梨、柑橘和水稻等物種中有過運用[19-21]。然而尚未見對蘭屬進行過分子標記和大花蕙蘭植株倍性系統(tǒng)研究。因此,本研究以27個大花蕙蘭品種和31個國蘭品種為試材(表1),通過SCAR分子標記技術與倍性檢測,擬將為蘭屬花卉育種工作提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
供試的大花蕙蘭采集于云南省昆明市嵩明縣,國蘭采集于云南省大理州。試驗與2022年11月至2023年3月在云南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院實驗室進行。栽培環(huán)境條件:溫度范圍為5~30 ℃,空氣濕度為50%~80%,水pH值范圍為5.8~6.5,微酸性水(大花蕙蘭);適宜光照度為7 000~15 000 lx,避免直射強光,最佳溫度為15~25 ℃,最佳空氣相對濕度為65%~85%,具有通風設備(國蘭)。
1.2 試驗方法
1.2.1 27個大花蕙蘭和31個國蘭DNA提取
以27個大花蕙蘭和31個國蘭無病蟲害的新鮮植物葉片為材料,采用武漢納磁生物科技有限公司DNA提取試劑盒提取樣品DNA,取5 μL DNA樣品和 2 μL 凝膠加樣緩沖液(10×Loading Buffer)混勻后用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,電泳緩沖液是由三羥甲基氨基甲烷(Tris Base)、乙酸(Acetic Acid)和乙二胺四乙酸(EDTA)組成的緩沖液(1×TAE),電泳條件為120 V,25 min;電泳結束后將凝膠放入IQuant capture凝膠成像系統(tǒng)中,進行拍照觀察,根據(jù)所用marker估測樣品DNA的濃度和分子量,并將待檢測樣品DNA保存于-20 ℃冰箱備用。
1.2.2 SCAR分子標記的特異性條帶擴增
以提取的所有蘭花資源的DNA為模板進行PCR擴增,擴增的引物序列為SF: 5′-TGCGCCCTTCCATCACCTT-3′,SW: 5′-TGCGCCCTTCAATATTTTAAAGAA-3′[22]。在美國MJ Research 公司的 PTC-200 型 PCR儀上進行特異性條帶擴增,擴增體系總體積為25 μL,其中,1.0 μL DNA模板,0.25 μL TaqDNA聚合酶[5 U/μL,寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司)],1.5 μL 0.002 5 mol/L dNTPs,2.5 μL 10×PCR Buffer(含Mg2+),1.0 μL SF(0.01 mol/μL),1.0 μL SW(0.01 mol/μL),17.75 μL ddH2O。擴增程序為94 ℃預變性4 min;94 ℃變性40 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán);72 ℃末端延伸10 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后,產(chǎn)物送北京擎科生物科技股份有限公司完成測序。
1.2.3 構建系統(tǒng)進化樹
序列用BioEdit軟件的CLUSTAL W程序進行對位排列后,再進行手工校正。在MEGA 4.0軟件中,采用Kimura 2-參數(shù)距離方法,計算出國蘭和大花蕙蘭不同品種的遺傳距離[23]。分別用MEGA 4.0中的鄰接法(neighbor-joining method)構建rDNA ITS系統(tǒng)進化樹[24]。
1.2.4 倍性檢測
使用流式細胞儀(Partec CyFlow Space)及倍性分析試劑盒(Partec CyStain UV Precise P)對27個大花蕙蘭和31個國蘭樣本進行分析,由樣本的平均熒光強度判斷倍性。取待測蘭花新鮮植株葉片0.5 cm2置于培養(yǎng)皿中,取細胞核裂解液400 μL加于植物葉片之上并將葉片切碎:先橫向充分切碎后再縱向切碎,用裂解液提取1 min后,將液體用30 μm濾網(wǎng)過濾至樣品管中,加入1 500 μL染色液,避光染色1 min后用流式細胞儀進行檢測,確定植株倍性。
2 結果與分析
2.1 SCAR分子標記的特異性條帶擴增
檢測結果見圖1,從檢測的結果來看,每個品種提取的條帶清晰。說明用該試劑盒提取方法來提取蘭花基因組DNA是可行的。SCAR標記的引物PCR擴增結果見圖2,能夠清晰地看到蘭屬樣本中擴增出約為1 070 bp的特異性條帶,說明本試驗設計的擴增程序是可行的[25]。
2.2 SCAR分子標記序列系統(tǒng)進化樹
由圖3可知,從群體上看,所有樣本聚為3支。130、天之驕子、福娘、火炬、523、紅袍、碧龍紅素、中華奇珍、紅海棠、汗血寶馬、紫熹荷、冠神、紅玫瑰、荷之冠、出水芙蓉、大富貴、玉棠春、大元寶、鳳羽峽觀、奧迪牡丹、紅滿天、桃花、大鳳、紅河紅等24個品種聚為第1支(A1),包括8個大花蕙蘭品種和16個國蘭品種;紅酒之戀、金玉滿堂、日本櫻花、紅雙喜、紅酒、日本香蘭、一代天驕、春蘭麻殼素、肖梅、寬葉蓮瓣、如意素荷、領帶花、愛神、金光、福星、紅霞、繡球等17個品種聚為第2支(A2),包括11個大花蕙蘭品種和6個國蘭品種;616、夢境、蝶影、黃金歲月、英雄、光彩、楊貴妃、綠翡翠、寶晶、碧龍奇蓮、西蜀道光、太極圣梅、如意素、心心相印、大雪素、素牡丹、黃花素心等17個品種聚為第3支(B),包括8個大花蕙蘭品種和9個國蘭品種,說明部分大花蕙蘭和國蘭品種親緣關系較近。
2.3 大花蕙蘭倍性檢測結果
由圖4可知,由樣本的平均熒光強度確定材料的倍性,主峰表示相對核DNA含量, 因標樣主峰表示2C相對核DNA含量,且主峰峰值遠大于側峰的值,出現(xiàn)在92,則三倍體主峰在138,表示3C相對核DNA含量,四倍體主峰在184,表示4C相對核DNA含量。其中二倍體有616、桃花、紅雙喜、大鳳、日本櫻花、綠翡翠、夢境7個品種,三倍體有紅袍、火炬、紅酒之戀、繡球、天之驕子、紅酒、紅霞、楊貴妃、金玉滿堂、130、黃金歲月、蝶影、日本香蘭、福星、愛神、金光16個品種,四倍體有英雄、523、福娘、光彩4個品種。27個大花蕙蘭品種倍性的確定為雜交親本選育奠定了基礎。
3 討論與結論
蘭屬(Cymbidium)隸屬于蘭科(Orchidaceae)花卉植物,具有重要文化和觀賞價值,其包括附生蘭或地生蘭,罕有腐生蘭。蘭屬類群受外界的環(huán)境變化、生長時期,以及人工引種馴化、雜交等綜合因素的影響,每年都有大量的新品種產(chǎn)生,其中人工選育的大花蕙蘭目前已有上萬個新品種[26]。大花蕙蘭品種繁多,區(qū)分的標準也較多,可根據(jù)花色、花朵大小、花期早晚區(qū)分,根據(jù)花朵顏色來區(qū)分,可分為粉色類、綠色類、白色類和黃色類。多倍體植物具有花大色艷、根莖粗壯、葉厚而寬、抗性良好等特點[27]。大花蕙蘭品種多倍體有助于保護育種者權益,目前市場上受歡迎的大花蕙蘭品種以多倍體居多。因此,本研究基于SCAR分子標記和倍性鑒定開展蘭屬花卉的研究,擬為大花蕙蘭新品種選育提供科學指導。
目前,相關蘭屬花卉種間雜交報道較多。大花蕙蘭倍性復雜,在進行雜交育種時,一般不會選用三倍體的大花蕙蘭作為親本,因為三倍體的大花蕙蘭品種育性較差,用于雜交育種成功率極低[28]。陳和明等的研究表明,蝴蝶蘭與近緣屬雜交,雜交組合成功率不高,但可以成功,而與墨蘭(C. sinense)和碧玉蘭(C. Lowianum)等非蝴蝶蘭近緣屬雜交,則難以成功[29-30]。綜上,在進行雜交育種工作時,不僅需要確定父母本的倍性,而且雜交父母本之間親緣關系的遠近同樣是影響成功率的重要因素。如今,由于商業(yè)型的大花蕙蘭品種具有不同的倍性(二倍體、三倍體、四倍體、五倍體及六倍體)且三倍體居多,但將其用作母本進行雜交育種時成功率極低[31-32]。不同倍性的父母本在進行雜交時,若受精情況不良、合子胚發(fā)育不正常及正常胚極少等都會導致果實敗育。除此之外生殖隔離及不同倍性父母本雜交導致不能產(chǎn)生正常配子也會對雜交果實的結莢率產(chǎn)生很大影響[33]。前人研究發(fā)現(xiàn),蘭科植物同一屬中不僅存在多種染色體基數(shù)的情況,而且時常伴隨著倍性的變化而發(fā)生改變[34-35]。
SCAR分子標記技術是一種單基因位點多態(tài)性標記技術。其原理是對基因作RAPD(隨機擴增多態(tài)性DNA)分析后,對目的DNA片段進行克隆和末端測序,根據(jù)目的基因前后兩端序列設計引物。再以此引物對目的DNA片段進行特異PCR擴增,可以鑒別與原RAPD片段相對應的單一位點[36]。目前SCAR分子標記技術已經(jīng)成功地運用在植物育種方面。張子君等在番茄抗病基因Ty-3的SCAR標記及檢測中表示SCAR分子標記是與抗病基因 Ty-3 緊密連鎖的共顯性標記,可用于番茄抗病基因Ty-3的鑒定與抗病材料的篩選[37]。李敏等利用SCAR分子鑒定標記中藥白術的篩選和克?。?8]。本研究供試的27個商業(yè)化大花蕙蘭,部分品種的形態(tài)特征上明顯表現(xiàn)出花朵有中小型花,部分有香味的特點,SCAR分子標記顯示27個品種分別與不同國蘭品種同處于一個數(shù)系圖分支,聚為3支。同時,大花蕙蘭是由多國選育的蘭屬中的不同花色、不同花型和不同冠幅大小等經(jīng)過1個多世紀的人工雜交、選育形成的雜種群,推測這些品種有國蘭血統(tǒng),它們是經(jīng)過數(shù)代與國蘭雜交后形成的新品種[39]。
倍性圖的主峰表示相對核DNA含量,且主峰峰值遠大于側峰,其側峰相對核DNA含量的峰可能有3個來源,第一是細胞染色體復制時期的G2期細胞;第二是可能存在內(nèi)源多倍體;第三在樣品制備過程中沒有形成單細胞狀態(tài),存在細胞粘連現(xiàn)象[40]。Arditti多年研究蘭科植物的雜交栽培種,并認為大部分蘭科植物應為四倍體[41]。但本研究發(fā)現(xiàn),大花蕙蘭品種大多為三倍體,這與朱根發(fā)等的研究結果[42]是一致的。眾所周知,用三倍體大花蕙蘭品種作為母本進行雜交育種時成功率極低[43]。因此,建議在蘭屬花卉親本選配時,可將商業(yè)化價值高的三倍體大花蕙蘭作為父本,可能會獲得種子。
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