二氮嗪對冠心病大鼠心肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響及作用機(jī)制研究

摘要" 目的： 探討線粒體三磷酸腺苷（ATP）敏感性鉀離子通道（mito-KATP）開放劑二氮嗪對冠心病大鼠心肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響及作用機(jī)制。方法：SD大鼠構(gòu)建冠心病模型后分為模型組、二氮嗪低劑量組、二氮嗪中劑量組、二氮嗪高劑量組，正常大鼠作為空白對照組，二氮嗪低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠分別灌胃給予二氮嗪3、5、7 mg/kg，治療14 d后檢測大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）水平。蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠心肌組織損傷。蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測心肌組織Bax、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、核因子-κB（NF-κB）、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR γ）相對表達(dá)水平。結(jié)果：與模型組比較，二氮嗪低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6、TG、TC、LDL-C、HDL-C、HMGR水平明顯降低，心肌細(xì)胞損傷明顯減少，并且凋亡相關(guān)蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)明顯上調(diào)，p-NF-κB表達(dá)明顯降低，PPARγ表達(dá)明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：二氮嗪可明顯緩解冠心病大鼠心肌損傷，其機(jī)制可能與調(diào)控PPARγ和NF-κB信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞" 冠心?。欢?；心肌細(xì)胞凋亡；炎癥反應(yīng)；血脂；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.19.011

Effect of Diazoxide on Myocardial Cell Apoptosis and Inflammatory Response in Rats with Coronary Heart Disease and Its Mechanism

XIE Yuxia， WU Gang， LIANG Cheng， LIU Wenning， WANG Xinbin

Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， Xinjiang， China

Corresponding Author" WU Gang， E-mail： 15545959@qq.com

Abstract" Objective：To investigate the effect of" diazoxide on cardiomyocyte apoptosis and inflammatory response in rats with coronary heart disease（CHD）.Methods：SD rats were divided into model group，diazoxide low-dose group，diazoxide medium-dose group，and diazoxide high-dose group.Normal rats served as the blank control group，and the rats in diazoxide low-dose group，medium-dose group，high-dose group were administered 3，5，and 7 mg/kg of diazoxide by gavage respectively.After 14 days of treatment，serum levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin（IL）-1β，IL-6，triglyceride（TG），total cholesterol（TC），low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C），high-density lipoprotein cholesterol（HDL-C），and 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase （HMGR） were measured.Hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe myocardial tissue injury.Western Blot was used to detect Bax，Cleaved Caspase-3，Bcl-2， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH），nuclear factor-κB（NF-κB）， phosphorylated NF-κB（p-NF-κB），peroxisome proliferator-activated receptor γ （PPARγ）.Results：Compared with the model group， the serum levels of IL-1β，IL-6，TG，TC， LDL-C，HDL-C，and HMGR were significantly lower in the diazoxide low-dose group，middle dose group，and high-dose group.Additionally，myocardial cell damage was significantly reduced and the expression of apoptosis-related proteins Bax and Cleaved Caspase-3 was down-regulated.The expression of Bcl-2 was significantly up-regulated while the expression of p-NF-κB was significantly decreased. Furthermore，the expression of PPARγ was significantly up-regulated（P＜0.05）.Conclusion：Diazoxide can significantly alleviate myocardial injury in CHD rats，and its mechanism may relate the regulation of PPAR γ and NF- κ B signal pathway.

Keywords" coronary heart disease; diazoxide; myocardial apoptosis; inflammatory response; blood lipid; experimental study

冠心?。╟oronary artery heart disease）是一類冠

基金項目" 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院院級課題（No.ZYY2019ZD03）

作者單位" 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院（烏魯木齊 830000）

通訊作者" 武剛，E-mail：15545959@qq.com

引用信息" 謝玉霞，武剛，梁鋮，等.二氮嗪對冠心病大鼠心肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響及作用機(jī)制研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（19）：3524-3528.

狀動脈發(fā)生器質(zhì)性或功能性病變而引起的心臟疾病，多發(fā)病于中老年人群，但是近年來其發(fā)病率逐漸年輕化［1］。冠心病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究表明，其病理進(jìn)程主要與心肌細(xì)胞凋亡、炎癥、纖維化、氧化應(yīng)激等密切相關(guān)，抑制心肌細(xì)胞的凋亡和心肌組織炎癥可緩解冠心病的病理進(jìn)程［2-3］。線粒體三磷酸腺苷（ATP）敏感性鉀離子通道（mitochondrial ATP sensitive potassium channels，mito-KATP）多表達(dá)于平滑肌的細(xì)胞膜，在臟器和血管分布廣泛，通過感受胞內(nèi)ATP的濃度而調(diào)控鉀離子的流動［4-5］。二氮嗪是mito-KATP的一種，能夠有效調(diào)控心肌缺血再灌注損傷［6］，但其對冠心病心肌組織的影響及機(jī)制研究尚不完善，本研究探討二氮嗪對冠心病大鼠心肌組織凋亡及炎癥的影響，旨在為mito-KATP的臨床應(yīng)用及研究提供幫助。

1" 材料與方法

1.1" 材料

6周齡無特定病原體（SPF）級SD雌性大鼠30只，體質(zhì)量（200±20）g，購自浙江省動物實(shí)驗(yàn)中心；高脂飼料購自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；垂體后葉素購自上海源葉生物科技有限公司；Bax、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、核因子-κB（NF-κB）、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR γ）抗體、山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2" 實(shí)驗(yàn)動物分組與給藥

將SD大鼠分為空白對照組、模型組、二氮嗪低劑量組、二氮嗪中劑量組、二氮嗪高劑量組，每組6只，模型組、二氮嗪低劑量組、二氮嗪中劑量組、二氮嗪高劑量組大鼠連續(xù)6周給予高脂飲食喂養(yǎng)后，以30 μg/kg的劑量注射垂體后葉素，連續(xù)注射3 d，構(gòu)建冠心病模型。造模后，二氮嗪低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠以3、5、7 mg/kg的劑量灌胃給予二氮嗪，每天給藥1次，給藥14 d?？瞻讓φ战M、模型組灌胃生理鹽水。

1.3" 大鼠血清炎性因子及血脂水平檢測

給藥結(jié)束后解剖大鼠，每只大鼠腹主動脈取血約7 mL于抗凝管中，然后將抗凝管室溫條件下靜置4 h，以3 000 r/min離心15 min，收集血清。使用生化分析儀檢測血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）水平。根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.4" 病理檢測

解剖取大鼠的心臟，于無菌培養(yǎng)皿中將心臟沖洗干凈，按壓擠出組織中的血液，然后距心尖2 mm 處橫向切開，取2 mm寬的組織用4%多聚甲醛固定24 h，然后進(jìn)行石蠟包埋盒切片，切片分別進(jìn)行脫蠟、蘇木精染色細(xì)胞核、伊紅染色細(xì)胞質(zhì)、脫水封片，顯微鏡下觀察。

1.5" 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測凋亡相關(guān)蛋白及NF-κB信號通路的激活

取大鼠心肌組織50 mg，加入500 μL的RIPA蛋白裂解液，研磨均勻，冰上裂解30 min，然后4 ℃，12 000 r/min離心10 min。取蛋白10 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后將聚偏二氟乙烯（PVDF）膜與Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、PPARγ、p-NF-κB、NF-κB抗體4 ℃孵育過夜，洗膜后，與山羊抗兔IgG抗體共孵育1.5 h，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒曝光并拍照，使用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.6" 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad prism 7 進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2" 結(jié)" 果

2.1" 各組大鼠心肌組織損傷比較

空白對照組心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，可見橫紋。模型組心肌纖維排列紊亂，間隙增寬，部分組織結(jié)構(gòu)不清，心肌細(xì)胞水腫，可見較多核固縮，間質(zhì)出血，較多炎細(xì)胞散在或灶狀浸潤。與模型組比較，二氮嗪低劑量組、中劑量組、高劑量組心肌纖維紊亂程度降低，細(xì)胞水腫及退變程度減輕，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤數(shù)量減少；二氮嗪高劑量組心肌病變改善情況優(yōu)于二氮嗪中劑量組、低劑量組。詳見圖1。

2.2" 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

與空白對照組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6水平明顯增加（P＜0.05），TNF-α水平升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，二氮嗪中劑量、高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6水平明顯降低（P＜0.05），TNF-α水平無明顯變化（P＞0.05）。詳見表1。

2.3" 各組大鼠血脂及HMGR水平比較

模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、HMGR水平明顯高于空白對照組（P＜0.05），說明冠心病大鼠體內(nèi)脂代謝異常。二氮嗪低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、HMGR水平明顯低于模型組（P＜0.05），說明二氮嗪可緩解冠心病大鼠體內(nèi)血脂水平異常。詳見表2。

2.4" 各組心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

與空白對照組比較，模型組大鼠心肌組織Bax、Cleaved Caspase-3相對表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），Bcl-2表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，二氮嗪低劑量組、中劑量組、高劑量組Bax、Cleaved Caspase-3相對表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），Bcl-2表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。說明二氮嗪可緩解冠心病大鼠心肌細(xì)胞凋亡。詳見圖2、表3。

2.5" 各組大鼠心肌組織PPARγ表達(dá)和NF-κB磷酸化水平比較

與空白對照組比較，模型組大鼠心肌組織中PPARγ蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），p-NF-κB表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，二氮嗪低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌組織PPARγ蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05），NF-κB磷酸化水平均明顯降低（P＜0.05）。說明二氮嗪可調(diào)控心肌細(xì)胞PPARγ和NF-κB信號通路。詳見圖3、表4。

3" 討" 論

冠心病一類缺血性心肌疾病，為冠狀動脈粥樣硬化所引起的血管堵塞或狹窄，進(jìn)而導(dǎo)致心肌供血不足和缺氧，受遺傳、環(huán)境、壓力等多種因素的影響，冠心病近年來的發(fā)病率不斷年輕化，雖然臨床上冠心病能夠得到有效的控制，但是不能根治，中老年病人死亡率高。冠心病的發(fā)病與心肌細(xì)胞的凋亡、炎癥、自噬等相關(guān)［7-9］。Li等［10］研究表明，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可緩解冠心病的發(fā)生發(fā)展。有研究指出，全身炎癥指標(biāo)可預(yù)測冠心病病人冠狀動脈狹窄的嚴(yán)重程度［11］。Antonopoulos等［12］研究表明，血管炎癥標(biāo)志物可作為心血管疾病預(yù)后的評價指標(biāo)。調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)有助于緩解冠心病的發(fā)生發(fā)展，本研究使用高脂飲食聯(lián)合垂體后葉素構(gòu)建了冠心病大鼠模型進(jìn)行研究。

mito-KATP是一類存在于血管和平滑肌表面的鉀離子通道，該通道的開放受胞內(nèi)ATP調(diào)控，mito-KATP開放可激活心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，調(diào)控胞內(nèi)線粒體代謝和損傷，為心肌細(xì)胞的代謝提供能量［13］。二氮嗪是mito-KATP的一種，Velez等［14］研究表明，二氮嗪可明顯緩解豬局部心肌缺血模型的心肌損害。Chen等［15］研究表明，二氮嗪可通過激活低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）/缺氧反應(yīng)元件（HRE）信號通路而誘導(dǎo)缺氧/再氧合心肌細(xì)胞的心肌保護(hù)。本研究發(fā)現(xiàn)，冠心病大鼠灌胃給予二氮嗪后心肌組織病變明顯緩解，說明二氮嗪能夠有效緩解冠心病癥狀。 Zhang等［16］研究表明，TC、TG、LDL-C水平異常與不良心血管事件的發(fā)生密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，給予二氮嗪后，冠心病大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、HMGR水平明顯降低，說明mito-KATP開放劑可緩解冠心病大鼠血脂異常。PPARγ信號通路是參與調(diào)控血脂代謝和葡萄糖代謝的關(guān)鍵信號通路，本研究發(fā)現(xiàn)，二氮嗪干預(yù)后冠心病大鼠心肌組織PPARγ表達(dá)明顯下調(diào)，說明二氮嗪可通過調(diào)控PPARγ通路而影響血脂代謝。在細(xì)胞凋亡檢測中，二氮嗪治療后，冠心病大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少，促凋亡相關(guān)蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達(dá)明顯下調(diào)，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯增加，細(xì)7胞凋亡緩解。Jing等［17］研究表明，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可促進(jìn)冠心病的病理進(jìn)程。Yang等［18］研究表明，多酚I通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和心肌細(xì)胞凋亡改善冠心病心肌損傷。

炎癥反應(yīng)與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，多種炎性因子調(diào)控冠心病的病理進(jìn)程，其中，IL-1β和IL-6能夠促進(jìn)動脈斑塊的生成進(jìn)而發(fā)生血栓，冠心病引發(fā)的高血脂又可誘導(dǎo)IL-1β的生成，TNF-α 可使黏附分子釋放促進(jìn)斑塊形成［19-20］，因此，IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子被認(rèn)為是冠心病治療的重要靶點(diǎn)。本研究亦發(fā)現(xiàn)二氮嗪治療后冠心病大鼠血清炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α濃度下降，炎癥相關(guān)通路NF-κB信號通路被明顯抑制，說明二氮嗪可通過抑制NF-κB信號通路緩解冠心病大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)。

綜上所述，mito-KATP開放劑二氮嗪可明顯緩解心肌細(xì)胞凋亡以及全身的炎癥反應(yīng)，從而緩解冠心病大鼠心肌損傷，其機(jī)制與PPARγ通路和NF-κB通路相關(guān)。

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（收稿日期：2023-04-26）

（本文編輯郭懷?。?/p>