?微生物菌劑添加對豬糞堆肥氮素轉(zhuǎn)化的影響?

摘要：為探索豬糞與水稻秸稈混合堆肥過程中貝萊斯芽孢桿菌LH-3對氨氣減排及氮素保留的促進(jìn)作用，研究設(shè)置接種LH-3菌劑的試驗(yàn)組與未接種菌劑的對照組，分析菌劑添加對堆肥腐熟及氮素轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果顯示：兩組堆肥均能達(dá)到高溫?zé)o害化處理標(biāo)準(zhǔn)，且LH-3菌劑的添加對堆體溫度無顯著影響；試驗(yàn)組較對照組提前5 d達(dá)到腐熟標(biāo)準(zhǔn)，且最終產(chǎn)品的種子發(fā)芽指數(shù)提升了21.56%，顯示出更優(yōu)的腐熟質(zhì)量；堆肥過程中，添加LH-3菌劑減少了33.42%的氨氣排放，并使最終產(chǎn)品的全氮含量增加了11.46%；LH-3菌劑在堆肥高溫階段顯著提升了氨單加氧酶基因和羥胺氧化還原酶基因的豐度，從而提高了該階段的硝化作用強(qiáng)度?？傮w而言，貝萊斯芽孢桿菌LH-3是一種能有效促進(jìn)豬糞好氧堆肥腐熟的生物添加劑，可以減少堆肥過程中的氨氣排放，并提高堆肥的全氮含量，從而提升堆肥產(chǎn)品整體質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：豬糞堆肥；貝萊斯芽孢桿菌LH-3；氮素變化；微生物菌劑

中圖分類號：S141.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）09-0049-05

Microbial Inoculum Influences Nitrogen Transformation During Pig Manure Composting

XIE Li-juan1，CHEN Wei1，WANG Zhen1，TANG Bing-xuan1，GUO Zhao-hui1，CHEN Ran-bing2，

YIN Hong-mei1，LIU Biao1

（1. Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， PRC; 2. Hunan Provincial Product Evaluation Center，

Changsha 410000， PRC）

Abstract： This study aims to evaluate the effects of Bacillus velezensis LH-3 on ammonia emission and nitrogen retention during the aerobic composting process of pig manure with rice straw. A treatment group with the inoculation of LH-3 and a control group without strain inoculation were designed. The results showed that the compost in both groups met the high-temperature sanitization treatment standard， and the inoculation of LH-3 did not significantly alter the temperature of the compost pile. Notably， the LH-3 group completed the composting five days earlier than the control group. Moreover， the final product in the LH-3 group increased the seed germination index by 21.56% compared with that in the control group， demonstrating higher quality. Furthermore， LH-3 reduced the cumulative ammonia emission during the composting process by 33.42% and increased the total nitrogen in the final compost by 11.46%. In addition， LH-3 enhanced the abundance of the ammonia monooxygenase gene （amoA） and the hydroxylamine oxidoreductase gene （hao）， thereby strengthening nitrification during the high-temperature composting stage. In conclusion， B. velezensis LH-3 serves as an effective biological additive that promotes the aerobic composting of pig manure， reduces ammonia emissions， and enhances nitrogen retention and overall quality of the compost product.

Key words： pig manure composting; Bacillus velezensis LH-3; nitrogen transformation; microbial inculum

畜禽糞便好氧堆肥技術(shù)是一種經(jīng)濟(jì)環(huán)保的處理技術(shù)，不僅能對畜禽糞便進(jìn)行無害化處理，還能實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化再利用，因此在養(yǎng)殖場和有機(jī)肥廠得到了廣泛應(yīng)用[1-2]。好氧堆肥是通過微生物的代謝活動，對有機(jī)物進(jìn)行分解，使其礦質(zhì)化、腐殖化的過程。隨著畜禽糞便中含氮有機(jī)物的分解轉(zhuǎn)化，氮素?fù)p失是堆肥不可避免的問題[3]。堆肥中氮素?fù)p失的主要原因是氨氣揮發(fā)，氨氣揮發(fā)導(dǎo)致的損失占總氮損失的79%～94%[4]。氨氣的大量釋放不僅降低了堆肥產(chǎn)品中氮素的含量，影響其養(yǎng)分含量，還造成了空氣污染。因此，如何減少堆肥氨氣釋放，提高堆肥氮素含量成為了科研人員的研究熱點(diǎn)。

調(diào)整堆肥過程的初始碳氮比、pH值、水分含量及通氣量等關(guān)鍵工藝參數(shù)，可以有效減少氨氣的排放量[5]。然而，這些參數(shù)的優(yōu)化需維持在特定范圍內(nèi)，以確保堆肥的正常腐熟過程不受影響。因此，盡管這些方法能夠在一定程度上減少堆肥過程中的氮素?fù)p失，但其效率仍受到一定的限制。大量研究表明，利用堆肥添加劑可顯著減少氨氣的釋放，根據(jù)理化性質(zhì)可將添加劑分為物理添加劑、化學(xué)添加劑、微生物添加劑[4]。與不添加生物炭相比，家禽糞便堆肥中添加10%的生物炭，氨氣釋放總量可減少60%，堆肥終產(chǎn)物總氮含量可提高51%[6]。Jiang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在以豬糞和小麥秸稈為原料的堆肥中添加5.26%的過磷酸鈣，較不添加過磷酸鈣處理，其氨氣釋放量減少了89.83%，總氮含量提高了24%。然而，大部分物理、化學(xué)類添加劑價格昂貴，不可循環(huán)利用，長期使用還可能會影響土壤理化性質(zhì)，不利于農(nóng)作物生長。相比而言，微生物添加劑成本低，對環(huán)境影響更友好，因此微生物添加劑的應(yīng)用逐漸成為堆肥工藝技術(shù)研究的重要內(nèi)容。一些研究聚焦于堆肥除臭菌株的篩選及除臭工藝的研發(fā)，發(fā)現(xiàn)微生物除臭劑具有高效穩(wěn)定的除臭作用，并能減少堆肥肥效損失[8-10]。Zhang等[5]研究顯示，添加微生物菌劑對減少堆肥氮素?fù)p失的效果不及物理、化學(xué)類添加劑，因此，急需篩選降氨保氮效果更優(yōu)的微生物菌種資源。

硝化微生物在堆肥過程中能夠?qū)@態(tài)氮有效氧化為硝態(tài)氮，顯著降低銨態(tài)氮的濃度，進(jìn)而有效減少堆肥過程中氨氣的排放量[4-5]。因此，研究考慮將具有硝化能力的菌株作為微生物添加劑進(jìn)行堆肥降氨保氮技術(shù)的研究。在前期研究中，課題組分離篩選到1株具有硝化能力的貝萊斯芽孢桿菌LH-3。該研究擬以LH-3菌株為材料，探討在豬糞堆肥過程中添加微生物菌劑對堆肥產(chǎn)品氮素含量的影響，以期為畜禽糞便堆肥過程中氨氣的減排和氮素的保留提供微生物資源和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

堆肥原料為豬糞和水稻秸稈，豬糞取自湖南湘潭某生豬養(yǎng)殖場，水稻秸稈取自附近農(nóng)場，使用前切成2～3 cm小段，原料的基本理化性質(zhì)如表1所示。貝萊斯芽孢桿菌LH-3為實(shí)驗(yàn)室前期研究分離所得，經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，調(diào)節(jié)發(fā)酵液活菌數(shù)至1.0×109 CFU/mL備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

堆肥試驗(yàn)于2023年9月在110 L的模擬堆肥反應(yīng)器[11]中進(jìn)行，周期為25 d。將豬糞和水稻秸稈按鮮重質(zhì)量比為4∶1的比例均勻混合，調(diào)節(jié)堆體的初始碳氮比至25∶1，調(diào)節(jié)初始含水量至60%。試驗(yàn)設(shè)置2個不同處理，對照組不接種外源菌劑；試驗(yàn)組接種5%（體積質(zhì)量比）LH-3菌株發(fā)酵液，每個處理重復(fù)3次。保持堆肥通風(fēng)速率為0.2 L/min，試驗(yàn)周期的前15 d每天翻堆物料30 min，后10 d每隔5 d翻堆物料30 min。分別于堆肥當(dāng)天和堆肥后5、10、15、20、25 d取樣。每個樣品分為2份，1份于4℃保存，用于測定理化參數(shù)；1份冷凍干燥后于-80℃保存，用于樣品中功能基因的定量分析。

1.3 檢測分析

1.3.1 溫度和種子發(fā)芽指數(shù)檢測 每天上午10：00通過堆肥反應(yīng)器的溫度傳感器測定各處理堆體的溫度。參照NY/T 525—2021標(biāo)準(zhǔn)測定種子發(fā)芽指數(shù)（GI）。稱取10 g堆肥鮮樣，加入100 mL蒸餾水，150 r/min振蕩1 h后靜置30 min；使用濾紙過濾，取8 mL濾液加入到鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中均勻放置10粒蘿卜種子，25℃避光培養(yǎng)48 h；測量各培養(yǎng)皿中種子發(fā)芽后的根長，計算種子發(fā)芽率，根據(jù)公式（1）計算種子發(fā)芽指數(shù)。

（1）

1.3.2 氨氣釋放量和全氮含量檢測 利用硼酸溶液吸收堆肥過程產(chǎn)生的氨氣，用0.1 mol/L標(biāo)準(zhǔn)硫酸溶液滴定，根據(jù)所消耗的硫酸溶液計算氨氣的釋放量。參照NY/T 525—2021標(biāo)準(zhǔn)測定全氮含量。稱取約0.6 g風(fēng)干后的堆肥樣品，加入5 mL濃硫酸和2 mL過氧化氫浸泡過夜后，高溫加熱至硫酸冒煙時，冷卻補(bǔ)充過氧化氫溶液，直至溶液呈無色或淡黃色；利用凱氏定氮儀將消解后溶液中的銨態(tài)氮蒸餾出來，用硼酸溶液吸收，以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定，再計算樣品的全氮含量。

1.3.3 硝化功能基因豐度的定量分析 通過實(shí)時熒光定量PCR對氨單加氧酶基因（amoA）和羥胺氧化還原酶基因（hao）進(jìn)行絕對定量分析。將堆肥初始（0 d）、高溫期（5、10 d）、降溫期（15 d）、腐熟期（25 d）的樣品冷凍干燥后，提取基因組DNA，通過熒光定量PCR進(jìn)行定量分析。amoA擴(kuò)增正向引物和反向引物分別為5'-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3'、5'-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3'，hao擴(kuò)增正向引物和反向引物分別為5'-TCAACATAGGCACGGTT

CATCGGA-3'、5'-ATTTGCCGAACGTGAATCGGAA

CG-3'。qPCR反應(yīng)體系（10 μL）：2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 5 μL，正反向引物各0.4 μL，50×ROX Reference Dye 0.2 μL，雙蒸H2O 3 μL，模板DNA 1 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性5 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，40個循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形繪制，使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥溫度和種子發(fā)芽指數(shù)變化

堆肥溫度直觀反映了堆肥的進(jìn)程，是衡量堆肥無害化的重要指標(biāo)。根據(jù)圖1可知，對照組和試驗(yàn)組的堆體溫度呈現(xiàn)相同的變化趨勢，均經(jīng)歷了升溫期、高溫期、降溫期、腐熟期。對照組、試驗(yàn)組均在堆肥第3天達(dá)到高溫期（＞50℃），堆肥最高溫分別為59.1、59.7 ℃，高溫期維持時間分別為9、10 d，均達(dá)到GB/T 36195—2018標(biāo)準(zhǔn)的要求。在整個堆肥過程中，對照組與試驗(yàn)組的溫度無明顯差異，說明堆肥原料中含有足夠數(shù)量的土著微生物，微生物生長繁殖過程中產(chǎn)生的熱量可以維持堆體的高溫。

種子發(fā)芽指數(shù)是評價堆肥腐熟度的重要生物學(xué)指標(biāo)，根據(jù)NY/T 525—2021標(biāo)準(zhǔn)可知，當(dāng)GI≥70%時，認(rèn)為堆肥產(chǎn)品達(dá)到腐熟水平，對植物無明顯毒害作用。由圖2可知，隨著堆肥進(jìn)行，各堆體浸提液處理的種子發(fā)芽指數(shù)不斷升高，植物毒性逐漸降低。對照組和試驗(yàn)組堆體浸提液處理的種子發(fā)芽指數(shù)分別在堆肥后20、15 d時達(dá)到70%以上，且堆肥結(jié)束時，兩組堆體的種子發(fā)芽指數(shù)分別為95.1%、115.6%，說明菌劑LH-3的添加縮短了堆肥腐熟的周期，提升了堆肥的腐熟度。

2.2 氨氣釋放量和全氮含量變化

堆肥過程中各時期氨氣釋放量及整個堆肥周期累積量如圖3所示。氨氣排放主要集中在高溫期，后期隨著溫度的降低，氨氣的釋放量顯著減少。在堆肥高溫期，試驗(yàn)組的氨氣釋放量顯著低于對照組；整個堆肥周期對照組和試驗(yàn)組氨氣累積釋放量分別為19.21、12.79 g，菌劑添加減少了33.42%的氨氣排放。

氮是植物生長與代謝最重要的營養(yǎng)元素之一，氮素含量是衡量堆肥產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)。由圖4可知，對照組和試驗(yàn)組堆體的全氮含量在整個堆肥周期表現(xiàn)出相同的變化趨勢，全氮含量在堆肥前期降低，中期升高，后期基本保持穩(wěn)定。堆肥結(jié)束時，試驗(yàn)組的全氮含量提升至2.14%，相較于對照組的1.92%，增幅達(dá)到了11.46%。這表明適量接種菌劑LH-3能有效促進(jìn)豬糞和水稻秸稈堆肥過程中氮素營養(yǎng)的積累與保留，從而提升堆肥產(chǎn)品的氮素含量。

2.3 硝化功能基因豐度變化

amoA基因編碼的氨單加氧酶和hao基因編碼的羥胺氧化還原酶是催化銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮的兩種關(guān)鍵酶。圖5結(jié)果顯示，各組堆肥后期amoA基因和hao基因的豐度均明顯高于堆肥初始期、高溫期的豐度，原因可能是堆體中的硝化微生物對溫度敏感，堆體高溫會抑制其生長繁殖[12]。

在初始堆肥階段，對照組與試驗(yàn)組的amoA基因豐度水平相似；堆肥進(jìn)行至第5天和第10天時，試驗(yàn)組的amoA基因豐度顯著高于對照組；進(jìn)入堆肥的降溫-腐熟階段后，兩組的amoA基因豐度差異不顯著。兩組的hao基因豐度在堆肥前期和后期無顯著性差異，而在堆肥第10天和第15天時，試驗(yàn)組的hao基因顯著高于對照組。以上結(jié)果表明，菌劑LH-3可以顯著提高堆肥高溫期-降溫期的amoA和hao基因豐度，從而增強(qiáng)該階段硝化作用的強(qiáng)度，促進(jìn)銨態(tài)氮向亞硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化，從而降低堆體銨態(tài)氮濃度，減少氨氣的釋放。

3 討論與結(jié)論

通過接種外源微生物菌劑改變堆肥氮素轉(zhuǎn)化是一種低成本、易操作的減少堆肥氮素?fù)p失的方法[4]。Chen等[9]在雞糞與小麥秸稈混合堆肥中添加10%的特定微生物菌群CMMC，有效降低了21.8%的氨氣排放量。該研究中LH-3菌劑添加組堆肥氨氣排放量減少了33.42%，展現(xiàn)出了更優(yōu)的氨氣減排性能。與其他研究類似，堆肥期間氨氣釋放主要集中在高溫期，這是因?yàn)槎逊食跗诎被⑸锎x活躍，將有機(jī)氮分解產(chǎn)生大量的銨態(tài)氮，在堆體高溫和高pH值環(huán)境下，氨氣大量逸出[13]；堆肥后期隨著有機(jī)氮的消耗，銨態(tài)氮的產(chǎn)生量越來越少，同時后期硝化作用強(qiáng)度增加，銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮速率增大，因此氨氣釋放量顯著減少。

硝化微生物在堆肥過程可以顯著減少氨氣釋放，然而值得注意的是，這些微生物的引入可能會加劇堆體內(nèi)的反硝化作用，促使硝酸鹽等形態(tài)的氮轉(zhuǎn)化為N2O、NO等氣體，導(dǎo)致堆肥中的氮素含量下降。鑒于此，為了全面評估微生物菌劑在降低氨氣釋放與保持氮素含量方面的平衡能力，研究對堆肥的全氮含量進(jìn)行了分析。該研究中，兩組堆體全氮含量變化趨勢相似，前期全氮含量不斷減少是高溫期氨氣的大量釋放導(dǎo)致的，中期物料大量降解消耗，并且其消耗速率大于氮素?fù)p失的速率，導(dǎo)致出現(xiàn)了相對濃縮效應(yīng)[14]，因此全氮含量不斷增加。

堆肥中硝化作用是由微生物介導(dǎo)的生物氧化過程，包括氨態(tài)氮轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯鯌B(tài)氮和亞硝態(tài)氮轉(zhuǎn)變?yōu)橄鯌B(tài)氮兩個階段。其中第一階段是硝化作用的限速環(huán)節(jié)，該階段分為兩步，首先銨態(tài)氮在氨單加氧酶（由amoA基因編碼）的催化作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榱u胺，接著羥胺在羥胺氧化還原酶（由hao基因編碼）的催化作用下氧化為亞硝態(tài)氮[15]。因此，堆體中amoA基因和hao基因的豐度在一定程度上能夠反應(yīng)堆肥硝化作用的強(qiáng)度。堆肥第5天和第10天試驗(yàn)組的amoA基因豐度顯著高于對照組，堆肥第10天和第15天試驗(yàn)組的hao基因顯著高于對照組，表明菌劑LH-3可以顯著提高堆肥高溫期-降溫期硝化作用的強(qiáng)度，減少氨氣的釋放。

綜上所述，在豬糞與水稻秸稈混合堆肥中接種貝萊斯芽孢桿菌LH-3，可以加速堆肥的腐熟進(jìn)程，提升最終產(chǎn)品的腐熟度，減少堆肥氨氣排放量，提高肥料的全氮含量。關(guān)鍵硝化功能基因的定量分析揭示了LH-3菌劑的作用機(jī)制：在堆肥高溫階段，該菌劑顯著提高了amoA和hao基因的豐度，提高了堆體內(nèi)的硝化反應(yīng)強(qiáng)度，有效降低了高溫時期銨態(tài)氮的含量，進(jìn)而從源頭上減少了氨氣的釋放。

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（責(zé)任編輯：王婷）