??一株具有殺松材線蟲活性的馬尾松內(nèi)生菌分離及鑒定?

摘要：為獲得具有殺松材線蟲活性的菌株，在湖南省瀏陽市采集了健康馬尾松、感染松材線蟲病但尚未死亡的馬尾松以及感染松材線蟲病致死的馬尾松材料，從中分離得到了27株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行殺線活性的測定，并對高效拮抗菌株進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明：從感染但尚未死亡的松樹分離得到的細(xì)菌H-4都具有較高的殺線活性；在發(fā)酵液處理48 h后，菌株H-4的殺松材線蟲活性最高，松材線蟲校正死亡率和消解率分別達(dá)到97.1%和89.2%。綜合考慮菌株H-4的形態(tài)學(xué)特征、生理生化測定結(jié)果以及16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果，確定菌株H-4為暹羅芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：松材線蟲；內(nèi)生細(xì)菌；暹羅芽孢桿菌

中圖分類號：S763 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）09-0073-05

Isolation and Identification of an Endophyte with Killing Effect on Pine Wood Nematodes from Pinus massoniana

HUANG Wen-jing1，LI Zhen1，XIA Yong-gang2，TAN Ze-bao1，XIAO Qin1，ZHU Huan-wu1，LUO Kun1

（1. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC; 2. Hunan Academy of Forestry，

Changsha 410018， PRC）

Abstract： To obtain the strains capable of killing pine wood nematodes， we collected the healthy plants， the plants infected with pine wood nematodes but still alive， and the plants infected with pine wood nematodes and dead of Pinus massoniana from Liuyang City， Hunan Province. A total of 27 strains of endophytic bacteria were isolated and subjected to assessment of their nematocidal effects. Furthermore， the efficient antagonistic strains were identified. The results showed that strain H-4 isolated from the infected but still alive plants exhibited a high nematocidal activity. The treatment with the fermentation broth of strain H-4 for 48 h achieved the highest killing effect on pine wood nematodes， with the corrected mortality and clearance rates of pine wood nematodes reaching 97.1% and 89.2%， respectively. Strain H-4 was identified as Bacillus siamensis according to the morphological， physiological， and biochemical characteristics and the phylogenetic tree built based on the 16S rRNA sequence.

Key words： pine wood nematode; endophytic bacteria; Bacillus siamensis

松材線蟲病，又稱松樹萎蔫?。≒ine wilt disease，

PWD），是由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）引起的具有毀滅性的的森林檢疫性病害[1]。1982年，我國在江蘇省南京市中山陵的黑松上首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲病[2]。松材線蟲病傳染性強(qiáng)、危害重[3]，據(jù)2022年的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，松材線蟲病覆蓋19個(gè)省，發(fā)生面積達(dá)151.15萬hm2[4-5]。松材線蟲的防治包括物理防治、化學(xué)防治和生物防治。物理防治對控制技術(shù)要求高，使用范圍相對較窄[6]；化學(xué)防治容易造成有害物質(zhì)殘留，且易導(dǎo)致植物產(chǎn)生抗性。因此，松材線蟲的生物防治備受關(guān)注[7-8]。

植物內(nèi)生菌和宿主植物聯(lián)系緊密[9]。研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生菌具有殺線蟲、抗病菌、抗氧化和分解糖類的作用[8，10]。例如：從松樹內(nèi)提取的內(nèi)生真菌Esteya vermicola具有很強(qiáng)的殺線蟲活性[11]，說明部分松樹的內(nèi)生菌對松材線蟲病存在抗性。松樹內(nèi)生菌在松材線蟲病的抑制防控方面具有巨大的潛力[12]，有望為松材線蟲病的生物防治提供新的方法[5，13]。而且，相較化學(xué)防治而言，利用內(nèi)生菌進(jìn)行防治更符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)防治的要求，因而近年來已成為生防菌劑開發(fā)的熱點(diǎn)[14]。該研究在湖南省瀏陽市采集了健康馬尾松、感染松材線蟲病但尚未死亡的馬尾松以及感染松材線蟲病致死的馬尾松材料，對其內(nèi)生菌進(jìn)行分離鑒定，探究從不同材料提取的內(nèi)生菌對松材線蟲的殺線蟲活性，以期為松材線蟲病的生物防治提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在湖南省瀏陽市葛家鎮(zhèn)的松材線蟲感染區(qū)采集健康馬尾松、感染松材線蟲病但尚未死亡的馬尾松以及感染松材線蟲病致死的馬尾松作為試驗(yàn)材料；供試松材線蟲由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所的茆振川課題組提供；培養(yǎng)基包括牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（NA）、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（NB）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和LB固體培養(yǎng)基。

1.2 研究方法

1.2.1 內(nèi)生菌株的分離純化 采用組織培養(yǎng)法對馬尾松內(nèi)生菌株進(jìn)行分離純化。去除采集的馬尾松樹干的外表層，每種材料取2 cm×2 cm的木質(zhì)組織薄片5片，75%酒精浸泡1 min，6%次氯酸鉀浸泡1 min，

無菌水沖洗3次，進(jìn)行表面消毒。將消毒后的材料剪成2 mm×2 mm的小木塊，每5塊為1組，均勻放置于PDA和LB培養(yǎng)基中，每種樣品接種3個(gè)平板。將平板置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗條件下培養(yǎng)，當(dāng)木塊周圍長出菌落時(shí)，用接種環(huán)挑取少量菌落在新的PDA和LB培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，多次重復(fù)此操作，直至單菌落出現(xiàn)。

1.2.2 內(nèi)生菌株培養(yǎng)液的制備 將純化好的內(nèi)生菌株分別接種至50 mL的NB培養(yǎng)基中，在28℃、160 r/min條件下培養(yǎng)3 d，得到菌株發(fā)酵液。將菌株發(fā)酵液在4℃、8 000 r/min條件下離心10 min，將離心后的上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，得到菌株發(fā)酵濾液[15-16]。

1.2.3 松材線蟲懸浮液的制備 在超凈工作臺中，將灰葡萄孢菌餅倒置接種在PDA培養(yǎng)基平板中，在28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)7 d。當(dāng)菌絲長滿平板時(shí)，再接種松材線蟲[17]?；移咸焰呔z被松材線蟲完全取食后，用無菌水清洗平板，以收集平板中的松材線蟲，混合后配制成濃度為5 000條/mL的線蟲懸液[15，18]。

1.2.4 松材線蟲拮抗細(xì)菌的篩選 分別取200 μL NB培養(yǎng)基（CK）、內(nèi)生菌發(fā)酵液加至細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后各加入200 μL線蟲懸浮液（約1 000條線蟲），搖晃均勻，每個(gè)處理重復(fù)3次[19]。在室溫下避光靜置48 h后分別吸取50 μL混合溶液（約125條線蟲）在顯微鏡下觀察松材線蟲存活情況并計(jì)數(shù)[20]，計(jì)算校正死亡率和消解率[15，21-22]。利用相同方法對篩選出的高效拮抗菌株的發(fā)酵液、發(fā)酵濾液進(jìn)行試驗(yàn)，分別處理24、48 h后，計(jì)算校正死亡率和消解率。

1.2.5 拮抗細(xì)菌的鑒定 對篩選出的拮抗細(xì)菌進(jìn)行菌株大小、邊緣、形狀和顏色等表面特征的觀察，并對其進(jìn)行革蘭氏染色，測定其生理生化指標(biāo)[23-24]。參照賀麗娜等[23]的方法，以細(xì)菌通用引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取部分PCR產(chǎn)物檢測有無條帶，出現(xiàn)目的條帶后委托北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行測序；獲得測序序列后，使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌的分離純化及其殺線蟲活性測定

采用組織分離法從健康、感染松材線蟲病但尚未死亡和感染松材線蟲病致死等3種馬尾松莖桿材料內(nèi)分別分離得到5、9、13株細(xì)菌。對分離得到的27株細(xì)菌的發(fā)酵液進(jìn)行初步的殺線活性測定，發(fā)現(xiàn)從感染但尚未死亡的馬尾松分離得到的細(xì)菌H-4的殺線活性最高（表1）。選取殺線能力最強(qiáng)的細(xì)菌H-4開展后續(xù)試驗(yàn)，對H-4的發(fā)酵液、發(fā)酵濾液進(jìn)行殺線活性測定。由表2可知，細(xì)菌H-4發(fā)酵液的校正死亡率和消解率均高于對應(yīng)的發(fā)酵濾液。發(fā)酵液靜置處理48 h后，松材線蟲的校正死亡率和消解率分別達(dá)到97.1%和89.2%。菌株H-4發(fā)酵液處理48 h后，可以發(fā)現(xiàn)松材線蟲蟲體形態(tài)發(fā)生明顯變化，體壁被溶解，顯微鏡視野已觀察不到完整的線蟲蟲體（圖1）。

2.2 細(xì)菌H-4的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征與生理生化測定 蘸取H-4菌液在LB固體平板上劃線，在細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察其菌落形態(tài)（圖2），發(fā)現(xiàn)H-4菌落表面光滑、呈圓形、乳白色、有黏性且不透明。進(jìn)行生理生化測定發(fā)現(xiàn)，H-4的V-P測定、明膠液化、硝酸鹽還原、淀粉水解和纖維素酶試驗(yàn)呈陽性，甲基紅、硫化氫、溶磷和蛋白酶試驗(yàn)呈陰性。

2.2.2 細(xì)菌H-4 16S rRNA測序分析 菌株H-4的序列總長為1 880 bp，PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果如圖3所示。根據(jù)測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖4可知，菌株H-4與芽孢桿菌屬（Bacillus）關(guān)系較近密切，并且與暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）的相似性最高；再綜合考慮菌株H-4的形態(tài)學(xué)特征和生理生化測定結(jié)果，確定菌株H-4為暹羅芽孢桿菌。

3 討論與結(jié)論

松材線蟲病不僅嚴(yán)重威脅松林生態(tài)系統(tǒng)，而且會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和不可估量的生態(tài)損失[25-28]。松材線蟲病會受到環(huán)境條件與人類活動等各種因素的影響[29]，松材線蟲可以通過松墨天牛進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，生存定殖造成寄主植物的枯萎死亡[30]。松材線蟲病嚴(yán)重影響了林業(yè)發(fā)展，至今仍難以對其進(jìn)行全面而有效的控制[31-32]。研究發(fā)現(xiàn)，一些真菌、細(xì)菌對松材線蟲有抑殺性，能有效防治松材線蟲病[33-34]，

而且，生物防治是目前較為環(huán)保且有效的一種防治手段[35-36]。

Shanmugam等[37]分離出一株具有殺松材線蟲活性的內(nèi)生細(xì)菌Raoultella ornithinolytica MG，并發(fā)現(xiàn)該菌株存在一些可能與殺線蟲活性相關(guān)的基因。Marques-Pereira等[38]發(fā)現(xiàn)，某些沙雷氏菌的發(fā)酵上清液和特定的氨基脂質(zhì)對松材線蟲有較高的殺線蟲活性。李恩杰等[39]篩選到一株對松材線蟲有較高殺滅活性的蘇云金芽孢桿菌，且該菌株的發(fā)酵液具有較好的熱穩(wěn)定性。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)某些貝萊斯芽孢桿菌[40]、放線菌[41]、真菌[42]也對松材線蟲具有較高的殺滅活性。

該研究從3種松樹材料中分離純化得到27株細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)從感染但尚未死亡的松樹分離得到的細(xì)菌H-4具有較高的殺線蟲活性。菌株H-4發(fā)酵液處理48 h時(shí)殺線活性最高，通過顯微鏡進(jìn)行觀察，可以發(fā)現(xiàn)部分線蟲發(fā)生了溶解，其內(nèi)含體流出，推測菌株H-4發(fā)酵液中的某種物質(zhì)可以破壞松材線蟲的體壁。發(fā)酵液中的次生代謝物質(zhì)復(fù)雜，后續(xù)研究中考慮對其進(jìn)行分離純化，探究發(fā)酵液對線蟲的抗性機(jī)制。

利用松樹內(nèi)生菌對松材線蟲病進(jìn)行預(yù)防和控制，可以為松材線蟲病的防治提供新的微生物資源[43]，也有利于擴(kuò)大生物防治技術(shù)的使用面。鑒于菌株H-4是從感染但尚未死亡的松樹中分離出來的，推測提高該細(xì)菌在松樹內(nèi)的豐度可以提高松樹對松材線蟲病的抗性，或者使感病松樹恢復(fù)健康狀態(tài)。該研究采集的松樹材料來自湖南地區(qū)，分離得到的細(xì)菌H-4可能主要針對湖南地區(qū)流行的松材線蟲病，其對其他地區(qū)的松材線蟲病的抑制情況仍有待探究。

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（責(zé)任編輯：王婷）