?沙塘鱧腸道致病菌G-2全基因組測(cè)序及信息分析?

摘要：為探明造成養(yǎng)殖沙塘鱧腸道出血的病原菌G-2的特性，對(duì)G-2進(jìn)行全基因組測(cè)序和分析?；蚪M組分分析和基因功能注釋結(jié)果顯示：G-2的總基因數(shù)為5 134個(gè)，其中蛋白編碼基因4 977個(gè)，非蛋白編碼基因157個(gè)，非編碼基因中tRNA基因107個(gè)，rRNA基因42個(gè)，sRNA基因8個(gè)；分別有5 109、3 339、3 362、2 543個(gè)基因在對(duì)應(yīng)的Nr、SwissProt、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫中獲得注釋；毒力基因分析表明G-2含有多種腸毒素和溶血素基因、InhA蛋白、磷脂酶及蛋白質(zhì)毒素，解釋了該菌造成養(yǎng)殖沙塘鱧腸道出血的原因?；贕-2菌株的16S rRNA序列信息構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定其為蘇云金芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：沙塘鱧；全基因組測(cè)序；蘇云金芽孢桿菌

中圖分類號(hào)：S943 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2024）09-0008-07

Whole Genome Sequencing and Bioinformatics Analysis of a Pathogenic Strain G-2 in the Gut of Odontobutis potamophila

ZHAO Yan-hua1，2，XIA Ai-jun1，2，JIANG Hu-cheng1，2，XUE Hui1，2，LIU Guo-xing1，2

[1. Jiangsu Provincial Freshwater Fisheries Research Institute， Nanjing 210017， PRC; 2. Low-Temperature Germplasm Bank of

Important Economic Fish of Jiangsu Provincial Science and Technology Resources （Agricultural Germplasm Resources）

Coordination Service Platform， Nanjing 210017， PRC]

Abstract： Whole genome sequencing and bioinformatics analysis were carried out to characterize the pathogenic strain G-2 causing gut bleeding of cultured Odontobutis potamophila. The results showed that the genome of strain G-2 contained 5 134 genes， including 4 977 coding genes and 157 non-coding genes （107 tRNA genes， 42 rRNA genes， and 8 sRNA genes）. In Nr， SwissProt， COG， and KEGG， 5 109， 3 339， 3 362， and 2 543 genes， respectively， were annotated. Strain G-2 carried multiple enterotoxin and hemolysin genes and the genes encoding InhA protein， phospholipase， and protein toxins， which explained the gut bleeding caused by this strain. The phylogenetic tree built based on the 16S rRNA gene sequence identified strain G-2 as Bacillus thuringiensis.

Key words： Odontobutis potamophila; whole genome sequencing; Bacillus thuringiensis

全基因組測(cè)序（Whole genome sequencing）是對(duì)未知基因組序列的物種進(jìn)行個(gè)體的基因組測(cè)序，通過將生物的基因組打斷、測(cè)序和拼接獲得較為完整的基因組序列，繼而進(jìn)行序列分析和功能基因注釋，最終從基因水平深入了解生物的各項(xiàng)機(jī)理[1-2]。1986年，Renato Dulbecco等科學(xué)家最早提出人類基因組測(cè)序計(jì)劃。1995年，流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）成為第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的自由生存生物[3]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和測(cè)序成本的降低，目前全基因組測(cè)序已經(jīng)經(jīng)歷了三代技術(shù)發(fā)展，對(duì)任何生物的基因組進(jìn)行測(cè)序成為可能[4-5]。在病害防控領(lǐng)域，全基因組測(cè)序技術(shù)可以有效獲取病原菌較為完整的基因組序列，再結(jié)合功能基因組學(xué)和生物信息學(xué)手段，為快速了解致病菌的致病機(jī)理和耐藥機(jī)制提供了極大的幫助[3]。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，可做微生物源殺蟲劑，以胃毒作用為

主[6]。其中，蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis）是一種低毒殺蟲劑，會(huì)在芽孢形成過程中產(chǎn)生名為δ-內(nèi)毒素的殺蟲伴孢晶體蛋白，殺蟲晶體蛋白分為Cry和Cyt兩大類[7]。Cyt蛋白具有溶血和溶細(xì)胞特性，對(duì)脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物均有溶解細(xì)胞的毒害作用[8-10]。蘇云金芽孢桿菌也是典型的昆蟲病原菌，對(duì)多種昆蟲、線蟲和螨類等具有特異性的毒殺活性，在生物農(nóng)藥領(lǐng)域占據(jù)重要地位，是目前世界上研究最深入、應(yīng)用最廣泛的微生物殺蟲劑[11-12]。

為探明造成養(yǎng)殖沙塘鱧腸道出血的病原菌G-2的特性，解析G-2的致病機(jī)理，該研究結(jié)合三代PacBio RS II測(cè)序技術(shù)和二代Illumina HiSeq 2000測(cè)序技術(shù)，對(duì)病原菌G-2進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，并對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行Nr（Non-Redundant Protein Sequence

Database）、Swiss-Prot、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）、GO（Gene Ontology）、COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）、VFDB（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria）數(shù)據(jù)庫注釋及分析，明確其基因組遺傳特性，為沙塘鱧的病害防控提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1 供試材料

1.1.1 致病菌 菌株G-2來自江蘇省揚(yáng)中市沙塘鱧養(yǎng)殖基地，由江蘇省淡水水產(chǎn)研究所病害防治研究室分離、鑒定及保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 CTAB試劑（廣州化學(xué)試劑廠），Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱生物科技有限公司），DNA提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]，瓊脂糖凝膠電泳儀（北京六一生物科技有限公司），NanoDrop微量分光光度計(jì)（美國賽默飛世爾科技公司），移液器（德國艾本德股份公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 G-2的復(fù)蘇及擴(kuò)大培養(yǎng) 將實(shí)驗(yàn)室凍存的G-2菌株于室溫條件下解凍，并用移液槍吸取100 mL菌液加入腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，置于同樣培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h；挑取長勢(shì)良好的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，1 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集菌體。

1.2.2 基因組提取、測(cè)序及組裝 使用CTAB法提取基因組DNA，將基因組DNA置于-20℃冰箱保存。對(duì)提取的DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，DNA樣品檢測(cè)合格后，進(jìn)行文庫構(gòu)建和文庫檢測(cè)，庫檢合格后，送至廣州基迪奧科技服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。結(jié)合三代PacBio RS II測(cè)序技術(shù)和二代Illumina HiSeq 2000測(cè)序技術(shù)[13]，對(duì)病原菌G-2進(jìn)行全基因組測(cè)序分析。使用三代測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，保證基因組組裝的完整性；使用二代測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行校正，保證組裝結(jié)果的準(zhǔn)確性；使用Fastp軟件對(duì)二代測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，基于校正后的組裝結(jié)果進(jìn)行基因組組分分析。

1.2.3 基因組組分分析 使用NCBI數(shù)據(jù)庫（National Center for Biotechnology Information）進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，使用RNAmmer軟件預(yù)測(cè)基因組中的rRNA基因[14]，使用tRNAscan-SE軟件預(yù)測(cè)基因組中的tRNA基因，基于Rfam數(shù)據(jù)庫使用CMScan軟件預(yù)測(cè)基因組中的sRNA基因[15-16]，使用tRNAscan-SE軟件預(yù)測(cè)tRNA區(qū)域和tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)[17]，使用RepeatMasker軟件預(yù)測(cè)基因組重復(fù)序列，使用TRF軟件預(yù)測(cè)基因組的串聯(lián)重復(fù)序列[18]，使用CRISPRfinder軟件預(yù)測(cè)基因組的CRISPR區(qū)域，使用在線工具IslandViewer 4對(duì)基因組進(jìn)行基因島預(yù)測(cè)。

1.2.4 基因功能注釋 使用KEGG數(shù)據(jù)庫（http：//www.genome.jp/kegg/）進(jìn)行編碼基因功能預(yù)測(cè)，查找基因所在的生物學(xué)通路[19-20]；使用GO數(shù)據(jù)庫（http：//geneontology.org/）對(duì)基因和蛋白質(zhì)功能進(jìn)行限定和描述[21]；基于COG數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.

nih.gov/COG/）使用DIAMOND軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)，進(jìn)行蛋白功能分類；利用VFDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.mgc.ac.cn/）進(jìn)行BLAST比對(duì)，預(yù)測(cè)毒力因子[22]。

1.2.5 G-2系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 基于G-2菌株的16S rRNA序列信息，從GenBank中選取親緣關(guān)系較近的10個(gè)序列，利用MEGA 4軟件進(jìn)行序列比對(duì)，采用鄰接法分析同源性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 G-2基因組測(cè)序及組裝分析

使用三代測(cè)序平臺(tái)（PacBio RS II）對(duì)G-2進(jìn)行測(cè)序，G-2過濾后的有效reads數(shù)為1 618 433條，平均測(cè)序讀長為4 359.5 bp，N50為6 698 bp，組裝后總長度為5 270 034 bp，GC含量為35.36%。

2.2 G-2基因分析及預(yù)測(cè)

使用二代測(cè)序?qū)θ鷾y(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，最終獲得一條4 400 748 bp的環(huán)狀染色體基因組（圖1）。該基因組的總基因數(shù)為5 134個(gè)，其中蛋白編碼基因4 977個(gè)，編碼區(qū)域長度為4 327 191 bp，占總長度的98.3%；非蛋白編碼基因157個(gè)，其中tRNA基因107個(gè)，rRNA基因42個(gè)，sRNA基因8個(gè)。rRNA基因中23S_rRNA基因14個(gè)，16S_rRNA基因14個(gè)，5S_rRNA基因14個(gè)?；蜷g隔區(qū)域長度為73 557 bp，占總長度的1.7%。菌株G-2基因組的GC-depth分布圖如圖2所示，發(fā)現(xiàn)其散點(diǎn)分布較為集中，無雜菌污染。由G-2的基因長度分布圖（圖3）可知，基因長度小于1 000 bp的基因出現(xiàn)頻率較高，基因長度為2 500～3 000 bp的基因出現(xiàn)的頻率較低。

2.3 基因功能注釋分析

2.3.1 數(shù)據(jù)庫注釋比對(duì) 菌株G-2全基因組測(cè)序共獲得5 134個(gè)編碼基因，具有明確生物學(xué)功能的編碼基因5 110個(gè)。如圖4所示，將獲得的編碼基因與相應(yīng)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，分析結(jié)果顯示：有5 109個(gè)基因在對(duì)應(yīng)的Nr數(shù)據(jù)庫獲得注釋，有3 339個(gè)基因在對(duì)應(yīng)的SwissProt數(shù)據(jù)庫獲得注釋，有3 362個(gè)基因在對(duì)應(yīng)的COG數(shù)據(jù)庫獲得注釋，有2 543個(gè)基因在對(duì)應(yīng)的KEGG數(shù)據(jù)庫獲得注釋。

2.3.2 KEGG代謝通路分析 菌株G-2在KEGG數(shù)據(jù)庫中得到注釋的基因有2 543個(gè)。由圖5可知，在代謝類中，有12種通路得到注釋，其中全局總覽的基因個(gè)數(shù)最多，有803個(gè)；其次為氨基酸代謝通路和碳水化合物代謝通路，分別有270和249個(gè)基因；甘氨酸生物合成和代謝通路最少，只有43個(gè)基因。在遺傳信息處理類中，有4種通路得到注釋，其中翻譯通路的基因有92個(gè)，轉(zhuǎn)錄通路的基因有5個(gè)。在環(huán)境信息處理類中，有2種通路得到注釋，其中膜運(yùn)輸通路有155個(gè)基因。在細(xì)胞過程類中，有3種通路得到注釋，其中原核生物基因數(shù)量最多，為107個(gè)，細(xì)胞生長和死亡通路最少，只有16個(gè)基因。2種生物系統(tǒng)類通路得到注釋，環(huán)境適應(yīng)性和免疫系統(tǒng)的基因分別為4、3個(gè)。

2.3.3 GO注釋 GO數(shù)據(jù)庫是用于描述基因和蛋白質(zhì)功能的標(biāo)準(zhǔn)化分類系統(tǒng)，包括生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3種基因功能[23]。對(duì)蘇云金芽孢桿菌G-2的基因進(jìn)行GO注釋和分類，判斷其基因參與的主要功能。如圖6所示，共有4 130個(gè)基因在GO數(shù)據(jù)庫中得到注釋，在生物過程中，有3 792個(gè)基因得到注釋，分類到細(xì)胞過程中的基因占比最多；在細(xì)胞組分分類中，有2 706個(gè)基因得到注釋，分類到細(xì)胞和細(xì)胞組成中的基因占比最多；在分子功能分類中，有3 767個(gè)基因得到注釋，分類到催化活性中的基因占比最多。

2.3.4 COG功能分類 由圖7可知，COG分類的蛋白編碼基因共3 362個(gè)，其中，常規(guī)功能預(yù)測(cè)類基因608個(gè)，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝類基因444個(gè)，轉(zhuǎn)錄類基因365個(gè)，無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝類基因264個(gè)，輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝類基因244個(gè)。

2.3.5 VFDB注釋 通過VFDB數(shù)據(jù)庫對(duì)比，發(fā)現(xiàn)G-2含有多種腸毒素及溶血素基因，如溶血素BL、非溶血性腸毒素基因A、腸毒素C等，還含有InhA蛋白（即免疫抑制因子A）、磷脂酶Phospholipase C precursor和蛋白質(zhì)毒素Perfringolysin O precursor。溶血素通過溶解紅細(xì)胞損害宿主，InhA蛋白通過水解宿主的抗細(xì)菌蛋白來增強(qiáng)自身的毒性，磷脂酶則通過水解磷脂酞膽堿、磷脂酞絲氨酸和磷脂酞乙醇破壞宿主腸道，蛋白質(zhì)毒素Perfringolysin O的編碼基因主要存在于產(chǎn)氣夾膜梭菌中，具有膜穿孔的能力[24]。

2.4 G-2系統(tǒng)發(fā)育樹分析

由圖8可知，G-2與蘇云金芽孢桿菌IAM 12077聚為一支，自展值為61%，因此可以確定菌株G-2為蘇云金芽孢桿菌。

3 討論與結(jié)論

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的集約化發(fā)展，高密度養(yǎng)殖和抗生素的大量使用造成了養(yǎng)殖魚類的細(xì)菌性病害日益嚴(yán)重。黃志堅(jiān)等[25]研究發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌與凡納濱對(duì)蝦肝胰腺壞死癥暴發(fā)密切相關(guān)，凡納濱對(duì)蝦感染蘇云金芽孢桿菌后，其鰓和腸道的Lv-JAK基因和Lv-STAT基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，而JAK基因和STAT基因與天然免疫密切相關(guān)。楊灣等[26]研究表明，蘇云金芽孢桿菌能夠感染甲魚，造成甲魚脖子和脾臟腫脹并使其肝臟呈土黃色。

該研究中蘇云金芽孢桿菌G-2會(huì)造成養(yǎng)殖沙塘鱧腸道出血，鰓部及頭部潰爛[27]，對(duì)G-2進(jìn)行全基因組測(cè)序，獲得了一條4 400 748 bp的環(huán)狀染色體基因組，總基因數(shù)為5 134個(gè)，其中蛋白編碼基因

4 977個(gè)，非蛋白編碼基因157個(gè)，非蛋白編碼基因中tRNA基因107個(gè)，rRNA基因42個(gè)，sRNA基因8個(gè)。rRNA中23S_rRNA基因14個(gè)，16S_rRNA基因1 4個(gè)，5S_rRNA基因14個(gè)。Schnepf等[7]發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌染色體為環(huán)狀DNA，GC含量一般為32%～35%，基因組大小2.4～5.7 Mb不等，與該研究測(cè)序得到的結(jié)果相似。

蘇云金芽孢桿菌G-2有2 543個(gè)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中得到注釋，代謝類的子條目和基因數(shù)量都是最多的，其中氨基酸代謝通路和碳水化合物代謝通路分別有270和249個(gè)基因。總體而言，菌株G-2代謝活動(dòng)比較豐富，需要與外界進(jìn)行能量交換來維持自身生命活動(dòng)。GO注釋結(jié)果表明，菌株G-2蛋白功能主要集中在生物過程中的代謝過程和分子功能中的催化活性功能。蛋白質(zhì)COG分析結(jié)果表明G-2碳水化合物代謝和氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)較多，表明該菌株的基礎(chǔ)代謝較高、生理活動(dòng)比較豐富。VFDB注釋可以分析不同病原菌的毒力因子構(gòu)成以及基因組的分布特點(diǎn)，從基因水平上解釋病原菌的入侵機(jī)制。通過數(shù)據(jù)庫對(duì)比發(fā)現(xiàn)，G-2含有多種腸毒素和溶血素基因，這也解釋了為什么感染該菌株的沙塘鱧的主要癥狀為腸道出血。同時(shí)該菌株還含有InhA蛋白、磷脂酶和蛋白毒素；與華中農(nóng)業(yè)大學(xué)測(cè)序的蘇云金芽孢桿菌YBT-1520比較發(fā)現(xiàn)，YBT-1520和G-2都含有腸毒素、溶血素、磷脂酶和InhA蛋白；但YBT-1520還含有蛋白酶Enhancin和幾丁質(zhì)酶Chitinase，可以提高殺蟲活性，G-2則含有蛋白質(zhì)毒素Perfringolysin O，能夠溶解紅細(xì)胞。

目前國內(nèi)針對(duì)蘇云金芽孢桿菌的全基因組測(cè)序研究相對(duì)較少，為探明造成養(yǎng)殖沙塘鱧腸道出血的病原菌蘇云金芽孢桿菌G-2的特性，該研究對(duì)G-2進(jìn)行了全基因組測(cè)序，從基因組學(xué)上分析了該菌的基因功能，并進(jìn)行毒力基因分析，解釋了該菌造成養(yǎng)殖沙塘鱧腸道出血的原因，以期為沙塘鱧的病害防控提供科研基礎(chǔ)。

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