煙葉醇化初期烤甜香風(fēng)味物質(zhì)形成規(guī)律

摘要通過跟蹤測定煙葉中淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶活力，以及美拉德反應(yīng)底物、美拉德反應(yīng)中間體和典型烤甜香風(fēng)味物質(zhì)等在醇化初期的變化，探究烤甜香風(fēng)味物質(zhì)的形成規(guī)律。結(jié)果表明：煙葉中淀粉酶活力、纖維素酶活力、總還原糖和美拉德中間體總量在180d醇化期呈先升高后降低的變化規(guī)律，蛋白酶活力、游離氨基酸總量、蔗糖、葡萄糖和果糖呈逐漸降低的趨勢，而糠醇、5-甲基糠醛、麥芽酚、呋喃酮、3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮5種典型的烤甜香風(fēng)味物質(zhì)含量呈逐漸升高的趨勢。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，游離氨基酸和葡萄糖與美拉德中間體變化均呈正相關(guān)，美拉德中間體總量和烤甜香風(fēng)味物質(zhì)總量變化呈負相關(guān)。在醇化初期，煙葉中淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶的活力對美拉德中間體的形成和烤甜香風(fēng)味物質(zhì)的增加有重要影響。

關(guān)鍵詞煙葉；醇化；烤甜香；美拉德中間體；形成規(guī)律

中圖分類號TS41+1"文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2024）24-0158-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.035

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

TheFormationRulesofFlavorSubstancewithRoastedSweetAromainLeavesDuringtheEarlyStageofAging

CHAIYing，QIAOYue-mei，GUOChun-shengetal

（TechnicalCenter，InnerMongoliaKunmingCigaretteCo.，Ltd.，Hohhot，InnerMongolia010000）

AbstractThroughtrackinganddetectingtheactivitiesofamylase，protease，andcellulase，aswellasthechangesinMaillardreactionsubstrates，Maillardreactionintermediates，andtypicalroastedsweetflavorsubstancesintobaccoleavesduringtheearlystageofaging，theformationrulesofflavorsubstanceswithroastedsweetaromawereexplored.Theresultsshow：theactivitiesofamylase，cellulase，totalreducingsugarandMaillardintermediatesintobaccoleavesincreasedfirstandthendecreasedduringthe180dagingperiod.Theactivitiesofprotease，totalfreeaminoacids，sucrose，glucoseandfructosedecreasedgradually.Thecontentsoffivetypicalflavorsubstances，suchasfurfurylalcohol，5-methylfurfural，maltol，furanoneand3-methyl-2-cyclopentene-1-ketone，increasedgradually.ThefreeaminoacidsandglucosearepositivelycorrelatedwithMaillardintermediates，whilethereisanegativecorrelationbetweenthetotalamountofMaillardintermediatesandthetotalamountofroastedsweetflavorsubstances.Sointheearlystageofaging，theactivityofamylase，cellulase，andproteaseintobaccoleaveshasasignificantimpactontheformationofMaillardintermediatesandtheincreaseofroastedsweetflavorsubstances.

KeywordsTobaccoleaves;Age;Roastedsweetaroma;Maillardintermediates;Formationrules

煙草是一種以吸食為主要目的的特殊經(jīng)濟作物，也是我國重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟作物之一。煙草中主要化學(xué)成分的含量和比值影響著煙草的吸食品質(zhì)，進而決定了煙草的工業(yè)使用價值，而醇化是煙葉吸食品質(zhì)形成的重要環(huán)節(jié)^［1］。醇化過程根據(jù)處理條件和方法不同，分為自然醇化和人工發(fā)酵2種^［2］。自然醇化是將烤煙放置在醇化庫中，在自然條件下借助生化作用發(fā)生成分變化進而改善質(zhì)量的過程，是目前煙草行業(yè)主要的生產(chǎn)工藝。人工發(fā)酵法是將新煙放在發(fā)酵室內(nèi)，通過控制溫度、濕度條件來加速煙葉的生化作用，在短時間內(nèi)（一般為 12～15 d）改善煙葉品質(zhì)^［3-4］。

在煙葉醇化過程中，美拉德反應(yīng)是其品質(zhì)提高的主要原因之一。重要的香味前體物質(zhì)——美拉德反應(yīng)中間體（Amadori化合物和Heyns化合物）在這個反應(yīng)中形成，主要為1-氨基-1-脫氧-2-酮糖類化合物^［5-7］。美拉德反應(yīng)中間體常溫下化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定，但加熱后易裂解產(chǎn)生吡嗪類、呋喃類及糠醛類等化合物，這些化合物中的糠醇、5-甲基糠醛、麥芽酚、呋喃酮、3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮等物質(zhì)是煙葉烤甜香風(fēng)味形成的典型組分^［8-10］。

烤甜香是評價煙葉質(zhì)量的重要指標之一，優(yōu)質(zhì)煙葉要求烤甜香氣充足，余味舒適，吸食安全性高。近年來，有學(xué)者也證實了煙葉中烤甜香風(fēng)味物質(zhì)對煙葉的感官有重要貢獻^［11］，并通過添加這些物質(zhì)開發(fā)了具有甜香風(fēng)格的煙草制品^［12］。但目前關(guān)于醇化期間煙葉中淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶的酶活力變化與美拉德反應(yīng)進程之間的關(guān)系，以及最終對烤甜香風(fēng)味物質(zhì)形成的影響尚不清晰，有待進一步研究。

筆者以復(fù)烤后的煙葉為原料對其進行醇化處理，并對180d醇化期間煙葉中淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶的酶活力變化，美拉德反應(yīng)的主要底物、中間體和典型烤甜香風(fēng)味物質(zhì)進行測定和分析，以期為后續(xù)煙葉新工藝的開發(fā)優(yōu)化奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1儀器、試劑與材料

1.1.1儀器。

超高效液相色譜儀-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（型號：1290-6460）：美國Agilent公司。精密電子pH計（型號：PB-10）：賽多利斯科學(xué)有限公司。Sigma高速離心機（型號：3-18KS）：上海成貫儀器有限公司。恒溫恒濕培養(yǎng)箱（型號：BPS-100CL）：上海恒一科學(xué)儀器有限公司。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（型號：DHG-9053A）：上海恒一科學(xué)儀器有限公司。紫外可見分光光度計（型號：T6）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。氨基酸自動分析儀（型號：LA8080）：日立高新科學(xué)公司。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（型號：7890B-7000C）：美國Agilent公司。液相色譜儀（型號：1200）：美國Agilent公司。

1.1.2試劑。

3，5-二硝基水楊酸（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。Whatman1號濾紙條（定性濾紙）：格來賽生命科技（上海）有限公司。Folin試劑（分析純）：北京酷來搏科技有限公司。酪蛋白（分析純）：北京酷來搏科技有限公司。L-酪氨酸（分析純）：北京酷來搏科技有限公司。麥芽糖（分析純）：北京酷來搏科技有限公司。氨基葡萄糖（2-氨基-2-脫氧葡萄糖、純度99％）、Fru-Val（FructoseValine、果糖-纈氨酸、純度98％）、Fru-Pro（Fructose-proline、果糖-脯氨酸、純度98％）、Fru-Ile（Fructose-isoleucine、果糖-異亮氨酸、純度97％）、Fru-Phe（Fructose-phenylalanine、果糖-苯丙氨酸、純度98％）、Fru-Leu（Fructose-leucine、果糖-亮氨酸、純度98％）、Fru-Asn（Fructose-asparagine、果糖-天冬氨酸、純度98％）、Fru-Ala（Fructose-alanine、果糖-丙氨酸、純度96％）、Fru-Trp（Fructose-tryptophan、果糖-色氨酸、純度98％）：加拿大TRC公司。甲酸（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。乙腈（色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。果糖（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司。葡萄糖（色譜純）：Dr.EhrenstorferGmbH。乳糖（色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司。半乳糖（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司。蔗糖（色譜純）：Dr.EhrenstorferGmbH。麥芽糖（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司?？反肌?-甲基糠醛、3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮、4-羥基-2，5-二甲基-3（2H）-呋喃酮、麥芽酚（色譜純）：上海甄準生物科技有限公司。

1.1.3供試煙葉。煙葉：云南昆明C2F等級，復(fù)烤未醇化，2020年份。

1.2試驗方法和條件

1.2.1淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶活力的測定。

將煙葉放置于恒溫恒濕箱中（溫度25 ℃，相對濕度55%），于2020年10月開始進行醇化，在醇化期間每隔30 d采樣1次，共6次。淀粉酶活力采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定^［13］；結(jié)合國標GB/T 28715—2012，采用福林-酚法測定蛋白酶活力；結(jié)合國標GB/T 23881—2009，以濾紙為底物測定纖維素酶活力。

1.2.2總還原糖含量的測定。

總還原糖含量的參照文獻［14］，用紫外分光光度法進行測定。

1.2.3主要糖類含量的測定。

結(jié)合文獻［15］，采用高效液相色譜法通過示差折光檢測器對果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖進行測定。

樣品前處理：將煙葉粉碎，過40目篩，準確稱取樣品2.0g，加蒸餾水混合均勻并定容于50mL容量瓶中，搖勻，靜置30min后再搖勻，取溶液超聲30min，再取超聲后溶液于離心管中，在4℃、8000r/min下離心3min，取上清液過0.45μm水相濾膜，供液相色譜分析。

1.2.4游離氨基酸含量的測定。采用氨基酸分析儀（茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀）測定煙葉中游離氨基酸的含量。

樣品前處理：將煙葉粉碎，過40目篩，準確稱取樣品2.0g，加入200mL沸水沖泡，沸水浴加熱10min，每隔5min搖勻1次。然后進行抽濾，濾液冷卻后定容至250mL，定容后取2mL用0.22μm水相濾膜過濾備用。

1.2.5美拉德中間體的測定。

結(jié)合文獻［16-17］，采用WatersAcquityPDA檢測器和ESI+模式的質(zhì)譜儀對美拉德中間體化合物進行分析。

樣品前處理：將煙葉粉碎，過40目篩，準確稱取樣品1.0g，加入50"mL水超聲提取20min，提取后的樣品在13000r/min離心機中離心10min。取上清液2mL過C18小柱，用3"mL超純水洗脫并定容至10"mL。然后過0.22μm濾膜，上機待測，進樣量為2μL。

1.2.6典型烤甜香風(fēng)味物質(zhì)的測定。

結(jié)合文獻［18］，采用頂空固相微萃取氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜對樣品中的典型烤甜香風(fēng)味物質(zhì)進行分析。樣品前處理：將煙葉粉碎，過40目篩，稱取4g，置于20mL頂空瓶子，在120℃下預(yù)熱20min，將手動spme裝置插到頂空瓶子并推出萃取頭，頂空吸附80min，然后在GC/MS中進行熱脫附和解析。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)使用SPSS19.0軟件處理，以平均值±標準偏差的形式表示。所有試驗樣品設(shè)置3個平行，P＜0.05表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1淀粉酶活力

煙葉自然醇化的時間為1～3年，考慮到該研究的目的是為提升烤甜香風(fēng)味及縮短醇化周期的工藝開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，因此醇化初期的變化規(guī)律更加重要。筆者將跟蹤測定酶和相關(guān)成分變化的時間范圍定在醇化初期。對于煙葉中的淀粉酶來講，其水解淀粉產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖、短鏈糊精和寡糖等產(chǎn)物，提供了美拉德反應(yīng)第一階段反應(yīng)底物中的還原糖。由圖1可知，醇化初期淀粉酶活力總體呈先升高后降低的變化規(guī)律，30～60 d淀粉酶活力顯著增加（Plt;0.05），60 ～90 d淀粉酶活力變化不顯著（Pgt;0.05），120～180 d呈顯著降低趨勢（Plt;0.05）。呈現(xiàn)這樣變化規(guī)律的原因可能是在醇化初期煙葉表面滋生的微生物分泌了淀粉酶，隨著時間的延長，煙葉表面的微生物數(shù)量逐漸減少，分泌到煙葉表面的酶也逐漸減少^［19］。

2.2蛋白酶活力

煙葉中蛋白酶把蛋白質(zhì)水解成低分子的肽和氨基酸，提供了美拉德反應(yīng)第一階段形成美拉德中間體底物需要的氨基酸。從圖2可見，醇化初期蛋白酶活力在貯藏期呈降低趨勢。貯藏期30～180d，蛋白酶活力顯著降低（Plt;0.05）。到180d蛋白酶活力從422.00U/g降至46.10U/g。

2.3纖維素酶活力

從圖3可見，醇化初期纖維素酶活力呈先升高后降低的變化規(guī)律，30～60d纖維素酶活力顯著增大（Plt;0.05）。60～180d纖維素酶活力顯著降低（Plt;0.05），到180d纖維素酶活力只有1.94U/g。這種變化現(xiàn)象可能是由煙葉表面微生物的變化所引起。

2.4還原糖含量

還原糖是煙葉的重要組成部分，醇化期煙葉的淀粉和非還原糖被淀粉酶水解會造成煙葉還原糖的增加。隨著醇化時間的延長，煙葉自身消耗增加，并與還原糖和氨基酸作用產(chǎn)生美拉德中間體，導(dǎo)致還原糖含量降低。由圖4可知，醇化初期還原糖呈先升高后降低的變化趨勢，30～90d還原糖含量增加顯著（Plt;0.05），含量從137.54mg/g增加到156.51mg/g。120～180d還原糖含量變化顯著降低（Plt;0.05），含量從156.32mg/g降低到131.22mg/g?？傔€原糖含量的變化與淀粉酶活力和纖維素酶活力變化趨勢一致，但在時間上有所滯后，說明總還原糖含量受到煙葉中淀粉酶和纖維素酶活力的影響。

2.5主要糖類含量

對醇化初期煙葉中主要的還原糖和蔗糖進行高效液相色譜分析，結(jié)果見表1。由表1可知，在被檢測的幾種糖中，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和果糖被檢出，半乳糖和乳糖未達到檢出下限。隨著醇化時間的延長，蔗糖、葡萄糖和果糖呈下降趨勢，麥芽糖呈先降低后升高的趨勢，在60d顯著低于其他階段含量（Plt;0.05），為12.1g/kg，180d含量最高，達21.3g/kg。

2.6游離氨基酸含量

煙葉中富含多種氨基酸，在醇化期煙葉中共檢測到11種氨基酸，分別為天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、脯氨酸。由表2可知，醇化期游離氨基酸含量顯著降低（Plt;0.05），從8.12mg/g降低到3.76mg/g。其中脯氨酸是煙葉中含量最高的氨基酸，到180d含量顯著降低（Plt;0.05）。隨著時間的延長，煙葉中游離氨基酸總量與蛋白酶活力都呈現(xiàn)逐漸降低的變化趨勢，說明游離氨基酸含量受煙葉中蛋白酶活力的影響。

2.7美拉德中間體

利用LC-MS分析醇化初期煙葉中9種美拉德中間體的含量變化，結(jié)果如圖5所示。醇化初期9種美拉德中間體平均含量從高到低分別為Fru-Pro 6 327.68 mg/kg、Fru-Asn 1 868.37 mg/kg、Fru-Ala 1 506.32 mg/kg、Fru-Phe 727.24 mg/kg、Fru-Trp 211.20 mg/kg、Fru-Val 192.50 mg/kg、葡萄糖胺 58.34 mg/kg、Fru-Ile 37.81 mg/kg、Fru-Leu 28.06 mg/kg。9種美拉德中間體總含量在醇化初期呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，30～180 d美拉德中間體總含量分別為11 897.19、12 257.36、10 998.06、10 544.63、10 003.16、10 044.70" mg/kg。美拉德中間體在美拉德反應(yīng)第一階段產(chǎn)生，還原糖和氨基酸的種類、含量和組成都會影響美拉德反應(yīng)速率^［20-21］。根據(jù)前述淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶的活力，以及還原糖和氨基酸含量的變化趨勢，分析美拉德中間體總含量變化的原因可能是在醇化初期淀粉酶和纖維素酶活力的升高，提供了美拉德中間體合成的還原糖底物，導(dǎo)致其總含量增加^［22］。隨著醇化時間的延長，淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶活力下降，還原糖和氨基酸被消耗，美拉德中間體的合成減少，同時一部分美拉德中間體進入了美拉德反應(yīng)的第二階段，相對穩(wěn)定的美拉德中間體在高溫或長期貯存過程中會發(fā)生脫水，并進一步裂解轉(zhuǎn)化成二羰基化合物，導(dǎo)致其總含量降低。

2.8典型烤甜香風(fēng)味物質(zhì)

風(fēng)味物質(zhì)是美拉德反應(yīng)的重要特征產(chǎn)物，煙葉在醇化期發(fā)生的美拉德反應(yīng)會產(chǎn)生糠醇、5-甲基呋喃醛、麥芽醇、呋喃酮、3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮等具有濃郁的烤甜香物質(zhì)。利用頂空固相微萃取氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定不同醇化期煙葉5種烤甜香風(fēng)味物質(zhì)的含量，結(jié)果如圖6所示。醇化初期5種典型烤甜香風(fēng)味物質(zhì)含量呈逐漸升高的趨勢，到180d5種典型烤甜香風(fēng)味物質(zhì)含量顯著高于前30～150d，分別為糠醇2.42mg/kg、5-甲基呋喃醛0.52mg/kg、麥芽醇3.83mg/kg、呋喃酮2.76mg/kg、3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮0.03mg/kg。

2.9美拉德中間體與相應(yīng)底物的相關(guān)性

由于氨基酸分析儀檢測到的游離氨基酸種類有限，因此選擇9種美拉德中間體中游離氨基酸能覆蓋到的4種來分析其與相應(yīng)底物的相關(guān)性。Fru-Ala與葡萄糖和Ala、Fru-Val與葡萄糖和Val、Fru-Phe與葡萄糖和Phe、Fru-Pro與葡萄糖和Pro的相關(guān)性分析結(jié)果見表3所示。由表3可知，這4種美拉德中間體與其底物均呈正相關(guān)。

進一步對總氨基酸、葡萄糖、9種美拉德中間體總量和5種烤甜香風(fēng)味物質(zhì)總量進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。由表4可知，總氨基酸和葡萄糖與美拉德中間體總量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.98和0.94，這與前述的4種美拉德中間體與其底物的相關(guān)性分析結(jié)果相符，也符合化學(xué)合成反應(yīng)的變化趨勢，即底物濃度的增大有助于產(chǎn)物合成的增加。這與煙葉烘烤前后及黑蒜中葡萄糖、果糖、氨基酸和美拉德中間體的變化規(guī)律一致^［23-24］，說明煙葉中葡萄糖和氨基酸的增加有助于促進美拉德中間體的形成。美拉德中間體總量和烤甜香風(fēng)味物質(zhì)總量呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.92，這2類物質(zhì)量的變化趨勢符合化學(xué)分解反應(yīng)的方向，即隨著美拉德中間體的分解，濃度降低，其產(chǎn)物烤甜香風(fēng)味物質(zhì)含量會增加。

3結(jié)論

在醇化期，煙葉內(nèi)參與烤甜香風(fēng)味物質(zhì)形成的相關(guān)成分變化呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性。其中，煙葉總還原糖受煙葉內(nèi)淀粉酶和纖維素酶活力的影響，均呈先升高后降低的變化規(guī)律；游離氨基酸含量受蛋白酶活力的影響，均呈逐漸降低趨勢。美拉德中間體總量變化與總還原糖變化的趨勢相同，且與其底物游離氨基酸和葡萄糖均呈正相關(guān)，而與其產(chǎn)物——被檢測的5種典型的烤香甜風(fēng)味物質(zhì)呈負相關(guān)，結(jié)合5種典型的烤香甜風(fēng)味物質(zhì)含量逐漸升高的趨勢及各成分在美拉德反應(yīng)中的作用，表明在醇化初期，煙葉中淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶的活力對美拉德中間體的形成和烤甜香風(fēng)味物質(zhì)的增加有重要影響，這為后續(xù)煙葉新加工工藝的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

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