微衛(wèi)星分析廣西沙塘鱧群體遺傳多樣性

摘要利用10對微衛(wèi)星分析廣西欽州市（QZ）、河池市（HC）及柳州市（LZ）沙塘鱧群體遺傳多樣性，結(jié)果表明：3個(gè)沙塘鱧群體樣本均能獲得清晰穩(wěn)定的擴(kuò)增條帶，顯示出不同程度的多態(tài)性。10個(gè)位點(diǎn)有效等位基因數(shù)量為0.9266～4.2130，平均為2.1621，期望雜合度為0.1068～0.8431，平均為0.4751，觀測雜合度在0.1491～0.8034，平均為0.4868，多態(tài)性信息含量在0.0811～0.5984，平均為0.3310。3個(gè)群體的有效等位基因數(shù)量表現(xiàn)為HCgt;LZgt;QZ，觀測雜合度表現(xiàn)為HCgt;LZgt;QZ，群體期望雜合度表現(xiàn)為HCgt;LZgt;QZ，群體多態(tài)信息含量表現(xiàn)為HCgt;LZgt;QZ。HC、LZ、QZ3個(gè)不同群體存在中等遺傳分化，平均基因分化系數(shù)為0.1003，表明有10.03%的遺傳分化來自3個(gè)不同地理群體之間，89.97%的遺傳分化來自沙塘鱧內(nèi)部個(gè)體之間。

關(guān)鍵詞沙塘鱧；微衛(wèi)星；遺傳多樣性分析；遺傳分化

中圖分類號S917.4"文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2024）24-0072-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.017

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

MicrosatelliteAnalysisofGeneticDiversityinthePopulationofOdontobutisobscurusinGuangxi

CHENZi-gui，LIHua，ZHOUDa-yanetal

（GuangxiAquacultureIntroductionandBreedingCenter，Nanning，Guangxi530031）

AbstractThisstudyused10pairsofmicrosatellitestoanalyzethegeneticdiversityoftheOdontobutisobscuruspopulationinGuangxi.ClearandstableamplifiedbandswereobtainedinsamplesfromthreeOdontobutisobscuruspopulationsinQinzhouCity（QZ），HechiCity（HC），andLiuzhouCity（LZ），showingvaryingdegreesofpolymorphism.Theeffectiveallelesfor10locirangefrom0.9266to4.2130，withanaverageof2.1621andanexpectedheterozygosityof0.1068to0.8431，withanaverageof0.4751，theobservedheterozygosityisbetween0.1491and0.8034，withanaverageof0.4868.Thepolymorphisminformationcontentisbetween0.0811and0.5984，withanaveragepolymorphisminformationcontentof0.3110.ThenumberofeffectiveallelesinthethreepopulationsisHCgt;LZgt;QZ，theobservedheterozygosityvalue"isHCgt;LZgt;QZ，theexpectedheterozygosityvalue"isHCgt;LZgt;QZ，andthepopulationpolymorphisminformationcontentisHCgt;LZgt;QZ.ThereismoderategeneticdifferentiationamongthethreedifferentpopulationsofHC，LZ，andQZ，withanaveragegenedifferentiationcoefficientof0.1003，indicatingthat10.03%ofgeneticdifferentiationcomesfromamongthethreedifferentpopulationsinthefield，and89.97%ofgeneticdifferentiationcomesfromwithinindividualsoftheOdontobutisobscurus.

KeywordsOdontobutisobscurus;Microsatellites;Geneticdiversityanalysis;Geneticdifferentiation

沙塘鱧屬鱸形目，沙塘鱧科，沙塘鱧屬，俗稱土憨巴，呆虎魚，是分布我國福建、廣西、浙江等地特有的小型肉食性經(jīng)濟(jì)魚類。因其肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富，深受百姓的喜愛。沙塘鱧生長一齡性成熟，每年4—6月為產(chǎn)卵季節(jié)，產(chǎn)卵地多數(shù)選擇靜止、隱蔽性很強(qiáng)的水域底層。中華沙塘鱧為名特優(yōu)品種，在廣西主要分布在柳州、河池、欽州等自然水域。

微衛(wèi)星分子標(biāo)記（SSR）因共顯性具有遺傳性、可重復(fù)性好、高度多態(tài)性的特點(diǎn)，在魚類種質(zhì)分析中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，最早應(yīng)用于畜牧遺傳育種方面，近年來，微衛(wèi)星分子標(biāo)記在水產(chǎn)分子輔助育種方面得到了迅速發(fā)展。Reid等^［1］利用SSR分析了虹鱒群體的遺傳多樣性，魯翠云等^［2］利用SSR技術(shù)進(jìn)行鏡鯉家系構(gòu)建，孫效文等^［3］對鏡鯉的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析并確定了與性狀相關(guān)的等位基因，邢新梅等^［4］對鏡鯉的體形性狀的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，其他研究人員對SSR技術(shù)在魚類遺傳結(jié)構(gòu)上也做了諸多研究^［5-9］。

中華沙塘鱧野生資源的枯竭和消費(fèi)市場需求的不斷增長，市場對中華沙塘鱧苗種需求非常旺盛，而隨著近年來?xiàng)⒌厣鷳B(tài)位的破壞和人為捕撈等因素的影響，中華沙塘鱧種群的種質(zhì)資源日趨減少，遺傳多樣性喪失。為進(jìn)一步了解廣西相對封閉自然水體沙塘鱧遺傳結(jié)構(gòu)，合理開發(fā)利用和保護(hù)廣西沙塘鱧種質(zhì)資源，筆者基于微衛(wèi)星技術(shù)探討廣西沙塘鱧不同地理群體遺傳參數(shù)與遺傳分化水平，以期為群體遺傳研究、種質(zhì)資源保護(hù)及開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

該研究所用的沙塘鱧試驗(yàn)材料來自廣西欽州市（QZ）、河池市（HC）和柳州市（LZ）。試驗(yàn)材料于2023年7月分別從以上3個(gè)地區(qū)的天然水域采集群體樣本進(jìn)行研究，每個(gè)群體取30尾魚作為試驗(yàn)樣本。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA的提取。

從沙塘鱧魚尾柄抽取50μL/尾血液，利用ACD快速抗凝，用上海生工生產(chǎn)的DNA試劑盒提取DNA，用核酸蛋白分析儀測定沙塘鱧血液DNA濃度，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，再次稀釋DNA至50ng/μL，并置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2微衛(wèi)星引物。

試驗(yàn)所用微衛(wèi)星引物為江蘇省生物多樣性與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行開發(fā)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，從25對引物中篩選出多態(tài)性較好的10對微衛(wèi)星引物進(jìn)行遺傳多樣性分析。10對引物序列以及退火溫度見表1。

1.2.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)、電泳及檢測。

PCR包括dNTP（10mmol/L）0.2μL、10×EasyTaqBuffer緩沖液1.0μL，F(xiàn)/R引物（20mmol/L）各0.2μL，模板1.2μL（50ng/μL），EasyTaqDNA聚合酶0.1μL，其余以去離子水補(bǔ)至10μL，總反應(yīng)體系為10μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火溫度30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。用8.0％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳儀功率20W，電泳電流80mA，電壓220V，PAGE電泳采用雙垂直電泳槽，用0.1%硝酸銀染色15min，用主要成分為NaOH、Na2CO3、甲醛等混合顯色液對凝膠顯色。

1.3數(shù)據(jù)分析處理

用PopGene1.32分析計(jì)算出各群體各位點(diǎn)有效等位基因數(shù)（Ne），等位基因數(shù)（A），平均觀測雜合度，實(shí)際觀測到的雜合子在樣本中所占比例的平均值（Ho），期望雜合度（He），平均多態(tài)信息含量（PIC），用populations計(jì)算群體間遺傳距離（geneticdistance，D）。

2結(jié)果與分析

2.1遺傳參數(shù)

等位基因控制著數(shù)量性狀，豐度越高，多樣性越豐富，根據(jù)Barker等微衛(wèi)星選擇標(biāo)準(zhǔn)，等位基因數(shù)大于4才能較好地用于群體遺傳多樣性的評估^［10］。10對微衛(wèi)星的電泳圖結(jié)果顯示，樣本個(gè)體能夠獲得清晰穩(wěn)定的擴(kuò)增條帶，顯示出不同程度的多態(tài)性。由表2可知，10個(gè)位點(diǎn)有效等位基因?yàn)?.926 6～4.213 0 ，平均為2.162 1，期望雜合度為0.106 8～0.843 1，平均為0.475 1，觀測雜合度為0.149 1～0.803 4，平均為0.486 8，多態(tài)信息含量（PIC）為0.081 1～0.598 4，平均為0.331 0。

QZ群體平均等位基因數(shù)量平均3.8，HC群體平均為5.0，LZ群體平均為4.5，可見，10對微衛(wèi)星在3個(gè)群體的檢測等位基因數(shù)量表現(xiàn)為HCgt;LZgt;QZ。HC有效等位基因在2.1675～4.2130，平均為2.8126，LZ有效等位基因在1.5462～2.5264，平均為1.9756，QZ有效等位基因在0.9266～2.5684，平均為1.6982，3個(gè)群體的有效等位基因數(shù)量大小表現(xiàn)為HCgt;LZgt;QZ。

HC群體觀測雜合度（H0）在0.4257～0.7974，平均為0.5911，LZ群體觀測雜合度（H0）在0.2432～0.8034，平均為0.5140，QZ群體觀測雜合度（H0）在0.1491～0.5869，平均為0.3553。3個(gè)群體的觀測雜合度（H0）數(shù)量大小表現(xiàn)為HCgt;LZgt;QZ。

HC群體期望雜合度（He）在0.3364～0.6870，平均為0.5023，LZ群體期望雜合度（He）在0.3176～0.8431，平均為0.5741，QZ群體期望雜合度（He）在0.1068～0.6537，平均為0.3491。群體期望雜合度（He）數(shù)量大小表現(xiàn)為HCgt;LZgt;QZ。

HC群體多態(tài)信息含量（PIC）在0.3089～0.5984，平均為0.4558，LZ群體多態(tài)信息含量（PIC）在0.1102～0.5679，平均為0.3074。QZ群體多態(tài)信息含量（PIC）在0.0811～0.5103，平均為0.2300?？梢?，群體多態(tài)信息含量（PIC）數(shù)量大小表現(xiàn)為HCgt;LZgt;QZ。結(jié)果表明，3個(gè)群體沙塘鱧的群體遺傳變異度較高，遺傳多樣性豐富，為中度多態(tài)性。

2.2遺傳分化

群體間遺傳分化系數(shù)（GST）被認(rèn)為是度量群體間基因分化相對大小的較好指標(biāo)^［11］，該研究通過對3個(gè)不同地理群體遺傳多樣性研究，檢測分析3個(gè)群體的基因分化系數(shù)和基因流，旨在了解廣西沙塘鱧野外生存群體間遺傳結(jié)構(gòu)。由表3可知，10個(gè)位點(diǎn)中，基因分化系數(shù)（GST）大于0.1的有3個(gè)位點(diǎn)，其中有2個(gè)位點(diǎn)為顯著遺傳分化，1個(gè)為極顯著遺傳分化，HC、LZ、QZ 3個(gè)不同群體平均基因分化系數(shù)為0.100 3，表明有10.03%的遺傳分化來自3個(gè)不同地理群體之間，89.97%的遺傳分化來自沙塘鱧內(nèi)部個(gè)體之間?；蛄髌骄鶠?.202 7，表明HC、LZ、QZ 3個(gè)不同群體之間有明顯的遺傳分化，基因流（Nm）和基因分化系數(shù)（GST）是負(fù)相關(guān)的。

2.3遺傳距離

HC、LZ、QZ3個(gè)群體的遺傳相似性系數(shù)及遺傳距離見表4，HC與LZ的遺傳相似度最高，為0.8034，LZ與QZ的遺傳相似度最低，為0.6631；HC與LZ的遺傳距離最小，為0.2367，LZ、QZ的遺傳距離最大，達(dá)0.3416。

3討論

3.1群體遺傳特征

微衛(wèi)星DNA標(biāo)記多態(tài)性高，呈共顯性遺傳， 在許多物種遺傳多樣性的研究中廣泛應(yīng)用，如用來鑒定種群間遺傳分化及親緣關(guān)系等遺傳特征。遺傳多樣性作為生物多樣性的重要組成部分，是物種多樣性、生態(tài)系統(tǒng)多樣性和景觀多樣性的基礎(chǔ)，也是生命進(jìn)化和適應(yīng)的基礎(chǔ)^［12-14］;種內(nèi)遺傳多樣性越豐富，物種對環(huán)境變化的適應(yīng)能力也越大，物種越能夠抵抗環(huán)境變化帶來的變化。等位基因數(shù)量是群體的遺傳多樣性衡量指標(biāo)之一，數(shù)量越多即表明遺傳多態(tài)性越高，控制不同性狀的基因座位越豐富。研究表明，10個(gè)位點(diǎn)中等位基因數(shù)呈拋物線分布，3個(gè)群體的平均等位基因數(shù)為4.43，廣西區(qū)內(nèi)沙塘鱧3個(gè)群體表現(xiàn)出等位基因位點(diǎn)的豐富性；群體基因位點(diǎn)雜合程度可以反映出群體的遺傳近交情況，3個(gè)群體期望雜合度值（He）平均為0.475 1，3個(gè)群體由于地理隔離因素沒有產(chǎn)生近交衰退趨向。多態(tài)信息含量（PIC）是衡量一個(gè)群體基因豐富程度的指標(biāo)，有效種群群體容量和地理生殖隔離是影響多態(tài)性信息含量的重要因素，有效群體小，極易發(fā)生遺傳漂變，增加某些性狀基因頻率，同時(shí)也使其他優(yōu)良基因容易喪失。該研究中，85%位點(diǎn)具有高度多態(tài)性，群體多態(tài)信息含量（PIC）平均為0.331 0，3個(gè)群體沙塘鱧的群體遺傳變異度較高，遺傳多樣性豐富，為中度多態(tài)性。這表明群體的生存力強(qiáng)，能適應(yīng)環(huán)境的變化。遺傳距離的大小反映了不同群體間的血緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，3個(gè)群體間遺傳距離小，相似系數(shù)大，說明群體間遺傳結(jié)構(gòu)更具有相似性。

3.2群體遺傳分化

Wright研究認(rèn)為，當(dāng)基因分化系數(shù)（GST）lt;0.05時(shí)，種群無遺傳分化；當(dāng)0.05≤GSTlt;0.15 時(shí)，種群發(fā)生中等水平遺傳分化；而GST≥0.15，則說明種群發(fā)生了高度的遺傳分化。生殖隔離是種群分化的必要條件，3個(gè)群體出現(xiàn)分化的外在因素是地理分布的隔絕，由于沙塘鱧屬于底棲性魚類，在廣西主要分布在不同水系的河流山溪，活動能力較弱，同時(shí)其生存環(huán)境變化，棲息地破碎化^［15-16］，有效群體變小，在遺傳漂變的壓力下導(dǎo)致基因頻率的改變，從而產(chǎn)生了群體間分化的現(xiàn)象。該研究顯示，10個(gè)位點(diǎn)中，80%的基因位點(diǎn)基因分化系數(shù)大于0.05，3個(gè)群體存在較低水平遺傳分化。其中基因分化系數(shù)（GST）大于0.1的有3個(gè)位點(diǎn)，只有2個(gè)位點(diǎn)為顯著遺傳分化。3個(gè)群體相互間所處生活環(huán)境的地貌、地形較為復(fù)雜，位點(diǎn)基因可能來自欽州群體，由于與其他群體地理位置較遠(yuǎn)而缺少交流。

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