基于轉錄組西施舌微衛(wèi)星標記開發(fā)及隱種鑒定

王雨吉，孟學平，易樂飛

( 江蘇海洋大學 海洋科學與水產(chǎn)學院，江蘇 連云港 222005 )

西施舌(Coelomactraantiquata)俗稱“海蚌”，是瓣鰓綱、蛤蜊科的一種雙殼貝類。其足大如舌，肉質飽滿肥嫩，與鮑、海參媲美，是國宴上的珍饈美饌。西施舌最初由Spengler于1802年在南海發(fā)現(xiàn)并命名[1]，長期以來，分布于太平洋西部(特別是我國沿海)的西施舌被視為同一個物種[2]。但是近十多年的研究發(fā)現(xiàn)，分布于我國北方和南方的西施舌形態(tài)不完全相似，而且彼此間存在較大遺傳差異。形態(tài)學多元統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，福建與江蘇的西施舌群體在5個數(shù)量性狀上均表現(xiàn)出顯著與極顯著差異[3]。生化水平等位酶的研究表明，福建、江蘇兩地西施舌有一定遺傳分化[4]；大量DNA水平分析表明，南、北西施舌遺傳差異已經(jīng)達到了種間差異水平[5-9]。比較分析發(fā)現(xiàn)，南、北西施舌間的差異甚至達到了四角蛤蜊(Mactraveneriformis)和中國蛤蜊(M.chinensis)的種間差異水平[7]。因此建議將我國西施舌劃分為2個物種或隱種，即分布于江蘇、山東的北方西施舌和分布于福建的南方西施舌[8]。物種的重新劃分迫切需要對2種西施舌的種質資源進行重新評估，為后續(xù)的開發(fā)、利用和保護提供理論基礎。2種西施舌的形態(tài)差異不大，不易區(qū)分。貝類幼體形態(tài)特征通常不明顯，成體形態(tài)特征易受環(huán)境影響，這也增加了鑒別難度。如何準確鑒別2種西施舌也是一個迫切需要解決的問題。

微衛(wèi)星序列，又稱簡單重復序列(SSR)，廣泛存在于真核生物基因組內，具有多態(tài)性高、保守性高、共顯性遺傳、檢測方便等特點[10]，已廣泛應用于遺傳圖譜構建、數(shù)量性狀位點定位、群體遺傳學、進化遺傳學、種質鑒定與輔助育種等研究領域[11-12]。在物種鑒定方面，微衛(wèi)星已經(jīng)成功應用于四大家魚[13]、黃顙魚屬(Pelteobagrus)[14]和扇貝[15]等水產(chǎn)生物的物種鑒別。來自轉錄組的微衛(wèi)星標記不僅具備上述特點，還與基因功能直接關聯(lián)，相應的微衛(wèi)星引物保守性高、通用性強[16]。所以基于轉錄組開發(fā)2種西施舌微衛(wèi)星分子標記有助于解決上述問題。

目前西施舌微衛(wèi)星分子標記的相關報道不多[17-18]，因此筆者以西施舌轉錄組數(shù)據(jù)為基礎，綜合利用多種生物信息學工具，挖掘西施舌微衛(wèi)星序列，并統(tǒng)計轉錄組中微衛(wèi)星序列的發(fā)生頻率、重復基元以及物種特異性微衛(wèi)星分子標記，為2種西施舌的鑒別，種質資源評估、開發(fā)、利用和保護提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 原始數(shù)據(jù)

西施舌轉錄組原始測序數(shù)據(jù)下載自NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)和GSA數(shù)據(jù)庫(https:∥bigd.big.ac.cn/gsa)。其中，南方西施舌個體取自福建福州(SRR7699535、SRR7700826)和福建長樂(SRR3107264)，北方西施舌個體取自江蘇啟東(SRR3107263)和山東日照(CRX028172、CRX 025974)。取每個西施舌個體的外套膜、閉殼肌和斧足組織，混合后用于RNA抽提、建庫和測序。為準確地獲得直系同源基因，從SRA數(shù)據(jù)庫中還下載了中國蛤蜊、四角蛤蜊和薄殼馬珂蛤(Mactrotomafragilis)轉錄組原始測序數(shù)據(jù)(SRR-1263980、SRR7876669、SRR7876670、SRR4431559、SRR4431558、SRR8217819)。

1.2 轉錄組組裝

轉錄組原始數(shù)據(jù)的預處理和從頭組裝參考文獻[8]的方法進行。首先使用Trimmomatic程序[19]去除原始數(shù)據(jù)中的低質量reads(Q≤20)、接頭以及小于50 nt的reads，然后使用Karaken程序[20]去除可能的污染序列，接著使用Trinity程序[21]軟件進行轉錄組的從頭組裝，最后使用TGICL程序[22]去除組裝產(chǎn)物中的冗余序列，從而獲得非冗余的轉錄本。

1.3 直系同源基因篩選

將中國蛤蜊、四角蛤蜊和薄殼馬珂蛤轉錄組與2種西施舌的轉錄組合并。使用OrthoFinder[23]從中搜索得到直系同源基因組。使用iqtree程序[24]在每個直系同源基因組內利用最大似然法構建系統(tǒng)進化樹，然后使用PhyloTreePruner程序[25]對樹進行解析，最后挑選出一對一關系的直系同源基因。

1.4 微衛(wèi)星序列篩選

使用MISA程序[26]進行微衛(wèi)星位點搜索。篩選標準為單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基重復，且各類型重復次數(shù)分別不小于10次、7次、5次、5次、5次、5次。若100 bp內出現(xiàn)2個或2個以上的微衛(wèi)星，則視為復合型微衛(wèi)星。將搜索結果導入到Excel軟件中，對微衛(wèi)星的基本信息進行統(tǒng)計分析。

1.5 試驗材料與DNA抽提

試驗材料共21個個體，其中南方西施舌樣本共10個，采集自福建漳州，北方西施舌樣本共11個，采集自山東日照。取閉殼肌，采用Ezup柱式動物組織基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]抽提21個個體的基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 微衛(wèi)星引物設計與篩選

隨機選取14組含有不同微衛(wèi)星序列的直系同源基因，采用Primer Premier 5程序在直系同源基因的保守區(qū)設計引物。從南方、北方西施舌中各隨機選擇2個個體的總DNA進行引物初篩。從中篩選出擴增條帶清晰且穩(wěn)定的4對引物(表1)用于后續(xù)樣品擴增，熒光標記引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 微衛(wèi)星引物信息Tab.1 SSR primers information

1.7 熒光PCR擴增及毛細管電泳檢測

PCR反應在25 μL體系中進行，體系中包含20～50 ng模板DNA，10 pmol正向、反向引物，10 pmol dNTP，1 U Taq DNA聚合酶[生工生物工程(上海)股份有限公司]。熒光PCR擴增采用兩步PCR擴增法。首先95 ℃預變性3 min；然后進行第1步PCR擴增：94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共10個循環(huán)；最后進行第2步PCR擴增：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行毛細管電泳檢測(3730XL，美國ABI公司)，利用GeneMarker分析軟件對原始數(shù)據(jù)進行分析，以確定PCR產(chǎn)物片段大小。

2 結 果

2.1 微衛(wèi)星數(shù)量及在轉錄組中的分布

原始數(shù)據(jù)拼接后，在北方西施舌轉錄組中得到272 074個unigene，N50為869 bp，從中檢測到18 611個微衛(wèi)星，復合型微衛(wèi)星為674個，分布于16 348條unigene中，平均每16.6個unigene中含有1個微衛(wèi)星，平均跨度為9.3 kb，出現(xiàn)頻率(含有微衛(wèi)星位點的unigene數(shù)量/unigene總數(shù)量)為6.0%，發(fā)生頻率(微衛(wèi)星個數(shù)/unigene總數(shù)量)為6.8%，有1758條unigene含有1個以上微衛(wèi)星。在南方西施舌轉錄組中得到287 887個unigene，N50為1297 bp，從中檢測到27 553個微衛(wèi)星位點，復合型微衛(wèi)星為1143個，分布于23 614條unigene中，平均每10.5個unigene中含有1個微衛(wèi)星，平均跨度為8.4 kb，出現(xiàn)頻率為8.2%，發(fā)生頻率為9.6%，有3189條unigene含有1個以上微衛(wèi)星。從分布情況來看，南方西施舌轉錄組中的微衛(wèi)星比北方西施舌更密集。

2.2 堿基重復類型

重復基元種類、數(shù)量以及優(yōu)勢重復基元在2種西施舌的轉錄組中存在差異(表2)。在北方西施舌的18 611個完美型微衛(wèi)星中共有63種重復基元，二至五堿基重復基元分別有3、10、24、24種；在南方西施舌的27 553個完美型微衛(wèi)星中共有89種重復基元，多于北方種，其二至五堿基重復基元分別為3、10、28、43種，此外，還發(fā)現(xiàn)了3種六堿基重復基元。在北方西施舌和南方西施舌轉錄組中二堿基重復中的優(yōu)勢基元均為AT/AT，分別有1119和2176個，占完美型微衛(wèi)星總數(shù)的6.01%和7.9%。三堿基重復中的優(yōu)勢基元不一致，分別為AAC/GTT和ATC/ATG，數(shù)量為1765個和2408個，占微衛(wèi)星總數(shù)的9.5%和8.7%。四堿基重復中的優(yōu)勢基元分別為AATC/ATTG和AAAC/GTTT，數(shù)量為137個和376個，占微衛(wèi)星總數(shù)的0.7%和1.4%。

表2 微衛(wèi)星重復基元出現(xiàn)情況Tab.2 The occurrence of different motifs of SRRs

2.3 堿基重復拷貝次數(shù)

在北方西施舌和南方西施舌轉錄組中，微衛(wèi)星重復拷貝次數(shù)最高為31和40次，最低均為5次。當微衛(wèi)星重復拷貝次數(shù)為10次時，微衛(wèi)星數(shù)量最多，豐度最大。含5～10次重復的微衛(wèi)星在2個種中最多，這些微衛(wèi)星在北方西施舌中有14 087個，占總微衛(wèi)星的75.7%，在南方西施舌中有20 139個，占總微衛(wèi)星的73.1%。

2.4 重復基元長度

在北方西施舌和南方西施舌轉錄組中微衛(wèi)星重復基元長度區(qū)間分別為10～75 bp和10～116 bp，其中最長的基元分別為五堿基的15次重復(75 bp)和四堿基的29次重復(116 bp)。在2個種中除了單堿基重復外，最常見的微衛(wèi)星長15 bp，分別有3552個和4581個，分別占完美型微衛(wèi)星總數(shù)的19.09%和16.6%，均為三堿基的5次重復。微衛(wèi)星的長度與發(fā)生頻率呈負相關。11～15 bp的短微衛(wèi)星數(shù)量最多，發(fā)生頻率為5.58%和7.35%；其次為16～20 bp的微衛(wèi)星，發(fā)生頻率為0.96%和1.52%；21～25 bp的微衛(wèi)星的發(fā)生頻率為0.26%和0.57%；大于26 bp的微衛(wèi)星的發(fā)生頻率0.04%和0.13%。

Temnykh等[27]按照堿基長度差異將微衛(wèi)星分成2類：當微衛(wèi)星長度≥20 bp時具有高度多態(tài)性(Ⅰ型)；微衛(wèi)星長度>12 bp且<20 bp時具有中等多態(tài)性(Ⅱ型)；而≤12 bp的微衛(wèi)星多態(tài)性較低，但具有突變潛能。本試驗中，在北方西施舌中，7240個微衛(wèi)星(38.90%)為Ⅰ型微衛(wèi)星，1293個微衛(wèi)星(6.95%)為Ⅱ型微衛(wèi)星；在南方西施舌中，10 867個微衛(wèi)星(39.44%)為Ⅰ型微衛(wèi)星，2718個微衛(wèi)星(9.86%)為Ⅱ型微衛(wèi)星。

2.5 含微衛(wèi)星序列的直系同源基因

在2個種的轉錄組中一共檢索出4916組一對一關系的直系同源基因。這些微衛(wèi)星被分為3類：第1類為兩者均無微衛(wèi)星的直系同源基因組，有3695組；第2類為只有一方有微衛(wèi)星的直系同源基因組，有911組；第3類為兩者均有微衛(wèi)星的直系同源基因組，有310組。第3類直系同源基因中，有252組在2個種中含有相同的微衛(wèi)星序列，不能用于區(qū)分西施舌的2個種。其余58組在2個種中含有不同的微衛(wèi)星重復次數(shù)。對這58組直系同源基因和第2類直系同源基因(合計969組)進行進一步的篩選，剔除單堿基重復微衛(wèi)星、旁側序列長度不足20 bp的直系同源基因后，余下409組。在這409組直系同源基因中，2個種間的微衛(wèi)星序列長度不同，但是微衛(wèi)星序列兩側序列相似，這種含微衛(wèi)星序列的直系同源基因有利于設計通用引物，使用這些通用引物可在2種西施舌中擴增出不同大小的條帶，進而可以作為潛在的物種特異性分子標記來區(qū)分2種西施舌。

2.6 直系同源基因中微衛(wèi)星位點的驗證

利用4對熒光標記微衛(wèi)星引物對21個西施舌個體進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳檢測后，每對引物在每個個體中均獲得了清晰、明確的DNA片段，且無雜峰(圖1顯示了部分結果)，4個微衛(wèi)星位點在21個個體上的基因型見表3。引物OG449和OG4144多態(tài)性較高，分別檢測到了10個和8個等位基因；引物OG2700和OG3080多態(tài)性較低，分別檢測到了5個和3個等位基因(表3)。在這4對微衛(wèi)星引物中，沒有1對微衛(wèi)星引物能單獨區(qū)分南方、北方西施舌，但是使用引物組合還是可以初步區(qū)分南方、北方西施舌。引物OG4144在北方西施舌中擴增產(chǎn)物大于380 bp，在南方西施舌中小于380 bp；引物OG3080在北方西施舌中擴增一定會出現(xiàn)489 bp的產(chǎn)物(圖1a)，在南方西施舌中一定會出現(xiàn)492 bp的產(chǎn)物(圖1b)。

表3 4個微衛(wèi)星位點基因型Tab.3 The genotypes at 4 SSRs loci

圖1 引物OG3080對南方、北方西施舌擴增產(chǎn)物的帶型Fig.1 Amplification bands in northern and southern lineage of surf clam C. antiquata using primer OG3080

3 討 論

3.1 西施舌微衛(wèi)星的發(fā)生頻率

筆者對2種西施舌轉錄組進行了微衛(wèi)星挖掘，北方西施舌每隔9.3 kb出現(xiàn)1個微衛(wèi)星，出現(xiàn)頻率為6.0%，南方西施舌每隔8.4 kb出現(xiàn)1個微衛(wèi)星，出現(xiàn)頻率為8.2%。與其他貝類相比，它們的微衛(wèi)星的出現(xiàn)頻率均高于馬氏珠母貝(Pinctadafucatamartensii)心臟(5.98%)[28]，均低于馬氏珠母貝血細胞(11.0%)[29]、“渤海紅”扇貝(A.irradians)(11.0%)、墨西哥灣扇貝(A.irradiansconcentricus)(9.0%)[30]、織錦巴非蛤(Paphiatextile)(10.0%)[31]轉錄組微衛(wèi)星出現(xiàn)頻率。這表明不同物種之間或同物種之間，甚至是同一物種不同組織間，因為物種和組織差異導致表達的mRNA種類、序列和豐度不同，因此挖掘出的微衛(wèi)星分布情況也隨之不同。

3.2 西施舌微衛(wèi)星的優(yōu)勢基元

大多數(shù)貝類的微衛(wèi)星主要以二堿基和三堿基重復為主要類型?？O蟶(Sinonovaculaconstricta)、“渤海紅”扇貝和墨西哥灣扇貝轉錄組微衛(wèi)星的優(yōu)勢基元為三堿基重復，分別占各自微衛(wèi)星位點總數(shù)的37.13%、46.66%和45.61%[30,32]；而蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)的優(yōu)勢重復類型為二堿基重復，占40.54%[33]。2種西施舌的優(yōu)勢重復類型均為三堿基重復，分別占各自微衛(wèi)星位點總數(shù)的25.5%和25.6%，占比少于上述物種。不同貝類的優(yōu)勢微衛(wèi)星重復類型有所不同，產(chǎn)生這種差異的原因可能是多樣的。這種差異可能是物種固有特性的體現(xiàn)，也可能是由分析方法和組學數(shù)據(jù)不同所致。轉錄組可以看作基因組的一個子集，所以基于不同的組學數(shù)據(jù)必然導致不同的結果；不同分析方法的算法基礎不同，所以基于不同的分析軟件也會導致不同的結果。

3.3 西施舌微衛(wèi)星標記與隱種鑒定

當近緣種形態(tài)差異不明顯時，微衛(wèi)星標記可有效鑒別近緣物種。這種鑒別技術往往依賴于通用性強且特異性高的幾對PCR引物。引物的通用性要求引物的結合位點必須位于基因的保守區(qū)，引物的特異性要求擴增產(chǎn)物必須位于基因的高變區(qū)。如果引物和被擴增片段都位于保守區(qū)，那么不能有效地區(qū)分物種；如果引物和被擴增片段均位于高變區(qū)，那么只能鑒別出物種內部的不同組群。在含有微衛(wèi)星的直系同源基因上設計引物能夠很好地實現(xiàn)引物的通用性和特異性。雖然使用非同源位置的微衛(wèi)星標記也可以鑒別近緣物種，但是這種擴增產(chǎn)物并不都是同源產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物大小與物種間的親緣關系無明顯的相關性。非同源產(chǎn)物和擴增產(chǎn)物大小異源同型會嚴重干擾系統(tǒng)發(fā)育、群體遺傳學和進化研究[34]，而使用直系同源基因內的微衛(wèi)星標記可以有效避免此類問題。將引物設計在直系同源基因的微衛(wèi)星側翼的保守序列上，僅擴增高變的微衛(wèi)星位點，可以有效鑒別這2種西施舌。有409組直系同源基因在2種西施舌中呈現(xiàn)了多態(tài)性的微衛(wèi)星序列，這些序列的發(fā)現(xiàn)為通用引物設計和西施舌物種鑒別奠定了基礎。

貝類微衛(wèi)星的挖掘傳統(tǒng)上采用磁珠雜交篩選、建立cDNA文庫的方式檢索微衛(wèi)星位點。李晶晶[17]用磁珠雜交篩選和表達序列標簽(EST)數(shù)據(jù)庫檢索2種方法從西施舌閉殼肌中鑒定出51條含微衛(wèi)星的序列，包含12種重復基元。朱立靜等[18]用生物素—磁珠吸附法從西施舌中篩選出38個微衛(wèi)星位點，包含5種重復基元。但是這些方法效率較低，信息獲取度也較低。隨著高通量測序的飛速發(fā)展，基于轉錄組數(shù)據(jù)檢索微衛(wèi)星的方法得到廣泛應用，這種方法獲得的微衛(wèi)星不僅具有一般分子標記的特點，而且信息量大、通用性好、快速高效[35]。因此，本試驗中，使用基于轉錄組的方法得到了很多微衛(wèi)星，顯著多于上述研究。這些微衛(wèi)星將為2種西施舌的鑒別，種質資源評估、開發(fā)、利用和保護奠定理論基礎。

4 結 論

在北方西施舌轉錄組中微衛(wèi)星出現(xiàn)頻率為6.0%，含63種重復基元；南方西施舌的微衛(wèi)星出現(xiàn)頻率為8.2%，含89種重復基元。在2個隱種的轉錄組中，除了單堿基重復外，優(yōu)勢重復類型均為三堿基重復，三堿基重復的優(yōu)勢基元分別為AAC/GTT和ATC/ATG，最常見的微衛(wèi)星長度均為15 bp。微衛(wèi)星的重復次數(shù)主要集中在5～10次。有409組直系同源基因在2個隱種中含有不同的微衛(wèi)星序列，可以作為潛在的物種特異性分子標記。