高溫應(yīng)激下維生素E對(duì)紅耳龜免疫指標(biāo)及消化酶的影響

雷金洪，劉天天，張廣武，傅麗容，史海濤

( 海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571158 )

紅耳龜(Trachemysscriptaelegans)具有食用、藥用及觀賞價(jià)值，自1987年引入我國以來，因生命力頑強(qiáng)，易飼養(yǎng)，價(jià)格低廉，一直受到養(yǎng)殖戶的青睞。紅耳龜最適養(yǎng)殖溫度為30 ℃，在集約化大規(guī)模養(yǎng)殖過程中，氣候變暖和極端天氣頻發(fā)的情況下，夏季高溫已成為影響龜鱉健康養(yǎng)殖的重要因素。研究顯示，高溫脅迫引發(fā)的熱應(yīng)激直接影響機(jī)體功能，導(dǎo)致代謝障礙、生長遲緩、免疫力下降，引發(fā)各種病害，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。因此緩解、降低熱應(yīng)激的不利反應(yīng)，是龜鱉養(yǎng)殖亟待解決的問題。

維生素E是一種有效的抗氧化劑和免疫增強(qiáng)劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已得到廣泛應(yīng)用。維生素E可以改善水生生物飼料利用率，提高水生生物的生長速度，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能[3]。在大量魚類的相關(guān)研究表明，缺乏維生素E會(huì)使魚營養(yǎng)不良，降低魚的應(yīng)激能力、生長率和成活率[4]。Alves等[5]研究發(fā)現(xiàn)，大西洋庸鰈(Hippoglossushippoglossus)在熱應(yīng)激情況下血糖、血清皮質(zhì)酮水平升高，熱應(yīng)激蛋白(Hsp70)基因的表達(dá)量升高；而飼料中添加維生素E能降低熱應(yīng)激狀態(tài)下大西洋庸鰈的血糖和血清皮質(zhì)酮水平，下調(diào)熱應(yīng)激蛋白基因的表達(dá)，說明維生素E是一種有效的抗應(yīng)激劑。維生素E的抗應(yīng)激效應(yīng)與添加量密切相關(guān)，不同種屬水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)維生素E的最適需求量有一定的差異，在適宜范圍內(nèi)有促進(jìn)作用[6]。點(diǎn)帶石斑魚(Epinepheluscoioides)幼魚[7]最適維生素E需求量為139.68～149.59 mg/kg；中華鱉(Pelodiscussinensis)[8]在養(yǎng)殖過程中補(bǔ)充維生素E 250～350 mg/kg，足以承受不利的環(huán)境，而高水平的維生素E抑制幼鱉的生長。高溫脅迫環(huán)境下能否通過添加維生素E增強(qiáng)紅耳龜幼龜?shù)目箲?yīng)激能力，提高生產(chǎn)性能，及維生素E的適用量范圍等相關(guān)研究未見報(bào)道。筆者擬在餌料中添加不同水平的維生素E，以(34±0.5) ℃水溫為應(yīng)激源，探討不同劑量維生素E對(duì)高溫應(yīng)激下紅耳龜血清中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性、丙二醛含量及腸道消化酶活性的影響，以期改善龜鱉動(dòng)物抵抗高溫環(huán)境的能力，為生產(chǎn)實(shí)踐中合理利用維生素E提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及馴化

試驗(yàn)用紅耳龜幼龜，購于?？谑袞|山泓旺養(yǎng)殖場(chǎng)，暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室玻璃缸中。每2 d于18：00投喂1次，所用飼料為龜鱉配合飼料(營養(yǎng)成分見表1)，將餌料加少量水和成面團(tuán)后投喂，投餌量以使動(dòng)物達(dá)到飽食并出現(xiàn)少量剩余為準(zhǔn)。馴養(yǎng)2周，使試驗(yàn)用龜充分適應(yīng)環(huán)境后，挑選健康個(gè)體開始試驗(yàn)。

表1 基礎(chǔ)日糧主要營養(yǎng)成分及其含量 %Tab.1 Approximate nutrient ingredient and contents of basal diet

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取40只紅耳龜幼龜健康個(gè)體，體質(zhì)量(108.42±19.56) g，隨機(jī)分為4組，每組2個(gè)平行，每個(gè)平行5只，各組間體質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)，置于48 cm×36 cm×10 cm的飼養(yǎng)箱中，試驗(yàn)期間條件控制與馴化相同。試驗(yàn)組動(dòng)物餌料中除維生素E添加量不同外，其他營養(yǎng)條件均與對(duì)照組相同，對(duì)照組不添加維生素E，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組飼料維生素E的添加量分別為150、250、350 mg/kg。試驗(yàn)30 d后，斷頸取血液樣品，4 ℃、3500 r/min(離心半徑8.56 cm)下離心獲得血清，用于測(cè)定超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性及丙二醛含量。同時(shí)，解剖取腸道組織，加入9倍體積的磷酸緩沖鹽溶液，制成勻漿液，用于測(cè)定腸道消化酶活性。

1.3 特定生長率測(cè)定

正式試驗(yàn)前測(cè)定紅耳龜幼龜初始體質(zhì)量(m1)，飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后稱量幼龜終末體質(zhì)量(m2)，試驗(yàn)周期為t，特定生長率(RSG，%/d)參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行計(jì)算：

RSG=(lnm2-lnm1)/t×100%

1.4 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)選用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，測(cè)定血清中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量。其中超氧化物歧化酶活性檢測(cè)采用羥胺法，過氧化氫酶活性選用可見光法測(cè)定，丙二醛含量則是通過硫代巴比妥酸法測(cè)定。

1.5 腸道消化酶活性測(cè)定

腸道消化酶活性測(cè)定過程中，淀粉酶選用碘—淀粉比色法，根據(jù)淀粉遇碘變藍(lán)原理，依據(jù)試劑盒說明書按要求分步加入樣品、相關(guān)試劑，混勻，在660 nm波長處測(cè)得吸光度，通過計(jì)算得出樣品淀粉酶活性；脂肪酶活性的測(cè)定采用甘油三酯法；蛋白酶活性的測(cè)定方法采用氨基酸法。3種酶均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒在37 ℃條件下進(jìn)行檢測(cè)，具體操作方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)值均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用F檢驗(yàn)或Bartletts檢驗(yàn)各組方差齊性，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，不同處理間多重比較采用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同維生素E水平對(duì)紅耳龜幼龜特定生長率的影響

高溫應(yīng)激環(huán)境中，未添加維生素E的對(duì)照組紅耳龜特定生長率最低，試驗(yàn)組飼喂日糧中添加維生素E可以促進(jìn)紅耳龜特定生長率的增長。由圖1可見，150 mg/kg試驗(yàn)組特定生長率比對(duì)照組高，但差異不顯著(P>0.05)，250、350 mg/kg試驗(yàn)組特定生長率升高明顯，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，說明維生素E可以緩解高溫應(yīng)激，有助于紅耳龜幼龜?shù)纳L。

圖1 飼料維生素E水平對(duì)紅耳龜特定生長率的影響Tab.1 Effect of vitamin E levels on specific growth rate (SGR) of red-eared turtle T. scripta elegans不同組別上標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05).Means with the same superscript in the different groups are not significant differences (P>0.05), and the means with different superscripts are significant differences (P<0.05).

2.2 不同維生素E水平對(duì)紅耳龜幼龜血清抗氧化指標(biāo)的影響

高溫脅迫環(huán)境下添加不同水平維生素E日糧飼喂紅耳龜幼龜，血清抗氧化酶活性有不同程度的提高，250 mg/kg試驗(yàn)組血清超氧化物歧化酶活性顯著高于對(duì)照組和150 mg/kg試驗(yàn)組，差異極顯著(P<0.01)；3個(gè)試驗(yàn)組血清過氧化氫酶活性升高幅度較大，約為對(duì)照組的3.5倍[F(3，36)=47.81，P<0.01]，各試驗(yàn)組間差異不顯著(表2)。丙二醛含量與抗氧化酶活性呈負(fù)相關(guān)，對(duì)照組含量最高，不同水平維生素E試驗(yàn)組的丙二醛含量均顯著低于對(duì)照組[F(3,36)=27.61，P<0.01]，各試驗(yàn)組間差異不顯著(P>0.05)，但250 mg/kg試驗(yàn)組降低幅度最大。說明高溫脅迫環(huán)境下，在紅耳龜幼龜日糧中添加一定水平的維生素E可以提高機(jī)體抗氧化能力，應(yīng)對(duì)高溫脅迫。

表2 飼料維生素E水平對(duì)紅耳龜抗氧化指標(biāo)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=10)Tab.2 Effect of vitamin E levels on antioxidant index of red-eared turtle T. scripta elegans (means±SD, n=10)

2.3 不同維生素E水平對(duì)紅耳龜幼龜腸道消化酶活性的影響

高溫應(yīng)激下日糧中添加不同水平的維生素E飼喂紅耳龜30 d后，試驗(yàn)組腸道3種消化酶出現(xiàn)不同程度的變化。與對(duì)照組相比試驗(yàn)組淀粉酶活性有所降低，但無差異顯著性[F(3,36)=1.15,P>0.05](表3)。試驗(yàn)組脂肪酶活性均顯著低于對(duì)照組[F(3,36)=6.58,P<0.01]，250 mg/kg試驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。蛋白酶活性變化與淀粉酶和脂肪酶活性變化相反，試驗(yàn)組蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組[F(3,36)=4.31,P<0.05]，250 mg/kg試驗(yàn)組蛋白酶活性最高，約為對(duì)照組的3.5倍(P<0.01)，350 mg/kg試驗(yàn)組蛋白酶活性下降，與對(duì)照組差異不顯著。說明不同水平的維生素E會(huì)影響紅耳龜幼龜消化功能。

表3 維生素E水平對(duì)紅耳龜消化酶活性的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=10) U/mgTab.3 Effect of vitamin E levels on the digestive enzyme activities of red-eared turtle T. scripta elegans (means±SD, n=10)

3 討 論

3.1 維生素E對(duì)紅耳龜幼龜生長性能的影響

夏季高溫常導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物產(chǎn)生熱應(yīng)激，熱應(yīng)激條件下體內(nèi)腎上腺素和皮質(zhì)醇大量分泌，使機(jī)體分解代謝加強(qiáng)，合成代謝減弱[9]，此外，應(yīng)激可能還通過減少食物的攝入、吸收和利用影響生長[10]。如果在動(dòng)物飼料中加入一定量的維生素E會(huì)使動(dòng)物快速生長[11]。在中華鱉的日糧添加維生素E，顯著提高中華鱉的質(zhì)量增加率、飼料利用率和蛋白利用率[12]。普遍認(rèn)為維生素E能促進(jìn)動(dòng)物腸道的發(fā)育，提高動(dòng)物的消化酶活性，從而促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高生長性能[13]。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述觀點(diǎn)，在高溫應(yīng)激情況下當(dāng)維生素E的添加量達(dá)250 mg/kg時(shí)，可促進(jìn)生長性能的提高，這可能與改善紅耳龜幼龜消化吸收功能有關(guān)。另外，環(huán)境高溫導(dǎo)致的熱應(yīng)激可直接影響消化道的結(jié)構(gòu)，寧章勇等[14]發(fā)現(xiàn)，持續(xù)34.5 ℃高溫導(dǎo)致肉雞腸絨毛斷裂，胃腸黏膜上皮細(xì)胞脫落及腺胃、十二指腸、空腸和回腸黏膜完整性損傷。鄭婷[15]研究表明，飼料中添加維生素E可促進(jìn)鯉(Cyprinuscarpio)腸上皮細(xì)胞的增殖，完善鯉腸上皮細(xì)胞的發(fā)育，并保護(hù)其功能和結(jié)構(gòu)的完整性。因此，本試驗(yàn)中，當(dāng)維生素E添加量達(dá)350 mg/kg時(shí)，紅耳龜消化酶活性下降，生長性能仍顯著提高，可能與維生素E對(duì)幼龜腸道的保護(hù)和修復(fù)，加強(qiáng)絨毛上皮細(xì)胞的吸收有一定的關(guān)系，但還需進(jìn)一步研究。

3.2 維生素E對(duì)紅耳龜幼龜抗氧化能力的影響

抗氧化酶是生物體內(nèi)保護(hù)預(yù)防相關(guān)的酶類，研究表明，當(dāng)動(dòng)物受到熱應(yīng)激侵害時(shí)，機(jī)體內(nèi)的過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性均會(huì)受到影響[16]。徐冬冬等[17]研究發(fā)現(xiàn)，褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)長期在海水中受高溫脅迫，肝臟組織超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性隨著脅迫溫度的上升而下降，存活率降低。脅迫環(huán)境下抗氧化酶活性降低，大量的自由基不能及時(shí)清除，會(huì)給組織和細(xì)胞造成氧化性損傷。本試驗(yàn)得到類似的結(jié)果，未添加維生素E的熱應(yīng)激組超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性最低，添加維生素E達(dá)適宜劑量時(shí)兩種酶活性顯著提高，丙二醛含量顯著減少，說明維生素E在終止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及消除自由基等方面表現(xiàn)出良好的效果。有學(xué)者認(rèn)為，維生素E可能會(huì)替代體內(nèi)和細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸與自由基反應(yīng)，從而使不飽和脂肪酸免受氧化，對(duì)維護(hù)生物膜的正常生理功能起到十分重要的作用[18]。

3.3 維生素E對(duì)紅耳龜幼龜消化能力的影響

消化酶是動(dòng)物機(jī)體對(duì)飼料中營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的關(guān)鍵物質(zhì)，其活性與動(dòng)物生長密切相關(guān)。高溫應(yīng)激會(huì)影響水生動(dòng)物消化酶的活性，羅祖娟等[19]研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下吉富羅非魚(OreochromisniloticusGIFT)腸道胃蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，隨脅迫時(shí)間的延長，呈先升后降的趨勢(shì)。維生素E對(duì)水生動(dòng)物消化功能的改善常見報(bào)道，伍曦等[20]研究表明，在高溫脅迫情況下，餌料中添加高水平的維生素E能促進(jìn)建鯉(C.carpiovar.Jian)幼魚生長和消化器官生長發(fā)育，并增強(qiáng)建鯉幼魚的消化吸收能力。對(duì)泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)的消化酶影響研究結(jié)果顯示，維生素E顯著提高泥鰍幼魚腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，達(dá)到適宜維生素E水平(195 mg/kg)腸蛋白酶和腸脂肪酶活性的變化幾乎相反[21]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加維生素E顯著影響紅耳龜幼龜?shù)鞍酌负椭久富钚裕鞍酌富钚燥@著提高，250 mg/kg試驗(yàn)組蛋白酶活性最高，脂肪酶的活性受到抑制，提示日糧中添加適量維生素E有利于蛋白酶的分泌。說明不同維生素E對(duì)動(dòng)物生長的影響存在種屬和劑量上的差異。由紅耳龜野外食性研究和人工飼養(yǎng)結(jié)果可知，紅耳龜成體屬雜食性，喜肉食餌料，幼體屬肉食性[22]，本試驗(yàn)結(jié)果提示，紅耳龜幼龜人工飼養(yǎng)條件下，日糧中添加維生素E可促進(jìn)蛋白質(zhì)的消化分解，同時(shí)餌料成分的配伍上應(yīng)加大蛋白質(zhì)占比，減少脂肪占比。

4 結(jié) 論

紅耳龜幼龜在34 ℃高溫應(yīng)激條件下，通過在餌料中添加維生素E 150、250、350 mg/kg，可在一定范圍內(nèi)顯著提高紅耳龜幼龜抗氧化能力，有助于腸道蛋白質(zhì)的消化吸收，促進(jìn)幼龜?shù)纳L。維生素E添加量在250 mg/kg時(shí)效果最明顯。