環(huán)境DNA技術(shù)在生物多樣性監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用及展望

摘 要 生物多樣性是人類賴以生存和發(fā)展的基礎(chǔ)，正呈持續(xù)下降趨勢(shì)，保護(hù)生物多樣性已成為21世紀(jì)人類面臨的重大挑戰(zhàn)。保護(hù)生物多樣性的重要基礎(chǔ)是進(jìn)行有效的物種監(jiān)測(cè)，準(zhǔn)確了解生物多樣性分布狀況。傳統(tǒng)的物種監(jiān)測(cè)方法存在耗時(shí)耗力且不夠高效、無法滿足大規(guī)模生物多樣性監(jiān)測(cè)需要等局限性。一種新的具有快速、低成本、高檢出率及對(duì)生物和環(huán)境破壞性小等特點(diǎn)的物種監(jiān)測(cè)方法——環(huán)境DNA技術(shù)（eDNA技術(shù)）正越來越受到重視和推廣應(yīng)用。綜述了eDNA技術(shù)在水環(huán)境、土壤環(huán)境、空氣環(huán)境生物多樣性監(jiān)測(cè)及入侵物種監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用，并對(duì)環(huán)境DNA技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞 環(huán)境DNA技術(shù)；生物多樣性；入侵物種；生物監(jiān)測(cè)

中圖分類號(hào)：X176；X835 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.21.024

生物多樣性是人類賴以生存和發(fā)展的基礎(chǔ)。然而，由于人類活動(dòng)、氣候變化等因素影響，生物多樣性正在持續(xù)下降，已成為21世紀(jì)面臨的重大挑戰(zhàn)之一[1]，保護(hù)生物多樣性已成為全球生態(tài)領(lǐng)域研究的重要課題。保護(hù)生物多樣性的基礎(chǔ)工作是進(jìn)行有效的物種監(jiān)測(cè)。只有通過監(jiān)測(cè)物種的種類、分布、數(shù)量和種群動(dòng)態(tài)等信息，準(zhǔn)確了解生物多樣性狀況，才能有針性地采取保護(hù)措施。傳統(tǒng)的物種監(jiān)測(cè)方法存在一定的局限性：1）通常需要長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)地觀察和手動(dòng)記錄，耗時(shí)耗力且不夠高效[2]；2）只能涵蓋有限的空間范圍和物種數(shù)量，無法滿足大規(guī)模生物多樣性監(jiān)測(cè)的需要[3]。

環(huán)境DNA技術(shù)，亦稱環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)（Environmental DNA Metabarcoding Technology，eDNA技術(shù)），是近年來逐漸被推廣應(yīng)用的生物多樣性監(jiān)測(cè)新技術(shù)。eDNA是指從環(huán)境樣本中獲取到的所有生物的總DNA[4]。通過從水、沉積物、土壤和空氣等環(huán)境樣品中收集提取生物的DNA片段，利用測(cè)序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定性或定量分析，從而揭示該生境中的生物分布狀況[5-6]。與形態(tài)學(xué)鑒定等傳統(tǒng)方法相比，eDNA技術(shù)具有快速[7]、低成本[8]、高檢出率[9-11]及對(duì)生物和環(huán)境破壞性小[12-13]等優(yōu)勢(shì)。如Shirey等[8]調(diào)查美洲紅點(diǎn)鮭（Salvelinus fontinalis），同時(shí)采用電氣捕獲和eDNA技術(shù)，eDNA技術(shù)只用采集水樣就可以檢測(cè)，取樣省時(shí)省力，可節(jié)省超過2/3的費(fèi)用。目前，eDNA技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于水環(huán)境、土壤環(huán)境、空氣環(huán)境等的物種監(jiān)測(cè)。本文綜述了eDNA技術(shù)在不同環(huán)境生物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用，展望未來發(fā)展趨勢(shì)。

1" 環(huán)境DNA技術(shù)在水環(huán)境中的監(jiān)測(cè)應(yīng)用

在生物多樣性監(jiān)測(cè)中，水環(huán)境被認(rèn)為是eDNA技術(shù)應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域，展現(xiàn)出比傳統(tǒng)調(diào)查方法更為準(zhǔn)確、便捷和對(duì)物種與棲息地干擾更小的優(yōu)勢(shì)[14]。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，魚類發(fā)揮著重要作用，參與物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)和生態(tài)穩(wěn)定性的維護(hù)[15]，eDNA技術(shù)在魚類監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用最為成熟。

1.1" 目標(biāo)物種監(jiān)測(cè)

目標(biāo)物種的空間分布與豐度對(duì)研究其生態(tài)習(xí)性和制定保護(hù)政策至關(guān)重要。水生生物的生存環(huán)境增加了監(jiān)測(cè)難度，特別是那些種群密度極小的物種，比如隱存種、瀕危種和稀有種，調(diào)查工作更加困難[16]。傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)方法往往難以捕獲到這些密度極小的種群，無法掌握其種群動(dòng)態(tài)。采用eDNA技術(shù)監(jiān)測(cè)，利用環(huán)境中存在的微量DNA可以推斷目標(biāo)物種的存在與分布。2020年，Marquez等[17]在西班牙北部娜龍河和薩拉河運(yùn)用eDNA技術(shù)監(jiān)測(cè)歐洲鰻鱺（Anguilla anguill），通過收集水樣分析其中的DNA，揭示了種群的存在及在特定區(qū)域的分布情況，為歐洲鰻鱺保護(hù)提供了數(shù)據(jù)支持。Hueriman等[18]在關(guān)島西部海域使用eDNA技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)路氏雙髻鯊（Sphyrna lewini）的監(jiān)測(cè)，并建立了相應(yīng)的監(jiān)測(cè)體系，不僅能夠跟蹤這種瀕危物種的活動(dòng)范圍，還可以評(píng)估其種群數(shù)量和分布變化，而傳統(tǒng)調(diào)查方法自1970年以來再未捕獲到路氏雙髻鯊，eDNA技術(shù)為保護(hù)這一瀕危物種提供了重要的參考依據(jù)。2022年，我國(guó)研究人員王夢(mèng)等[19]基于eDNA技術(shù)在長(zhǎng)江上游重慶段展開了多種珍稀特有魚類的本底調(diào)查，并檢測(cè)到了2種國(guó)家級(jí)保護(hù)魚類和10種長(zhǎng)江上游特有魚類。

1.2" 生物多樣性調(diào)查

生物多樣性調(diào)查是評(píng)價(jià)生物多樣性的重要手段。通過采集樣本并對(duì)其中的物種進(jìn)行鑒定和統(tǒng)計(jì)，分析不同物種的分布、豐度和動(dòng)態(tài)變化，明確生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性特征，從而對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況進(jìn)行監(jiān)測(cè)和評(píng)估[15]。2022年，李愛民等[20]在秦淮河利用eDNA技術(shù)開展水域內(nèi)魚類生物的多樣性檢測(cè)，不僅測(cè)出了該水域內(nèi)魚類生物的優(yōu)勢(shì)種，還將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與歷史數(shù)據(jù)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在物種豐度鑒定方面eDNA技術(shù)顯著高于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)。李旭文等[21]用eDNA技術(shù)開展了江蘇省魚類群落監(jiān)測(cè)，探索了eDNA技術(shù)應(yīng)用于超大范圍水生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)、評(píng)估和管理的適用性、可行性和易用性。除種類監(jiān)測(cè)外，eDNA技術(shù)還用于調(diào)查研究魚類群落時(shí)空分布的動(dòng)態(tài)變化[22]、各物種相對(duì)豐度[23]、系統(tǒng)發(fā)育多樣性[24]及功能多樣性等[25]。

1.3" 生物量評(píng)估

生物量是生態(tài)系統(tǒng)中維持種群數(shù)量和生態(tài)功能的關(guān)鍵因素，只有通過準(zhǔn)確評(píng)估水生生物類群的生物量，才能更好地了解和管理生物群落、保護(hù)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和功能[15]。對(duì)于水生生物類群來說，準(zhǔn)確評(píng)估其生物量具有挑戰(zhàn)性?，F(xiàn)有評(píng)估方法不僅費(fèi)用和人力要求高，還無法有效應(yīng)用于種群數(shù)量極小的物種。2012年，Doi等[26]首次采用環(huán)境eDNA技術(shù)評(píng)估水域中魚類的生物量，之后又運(yùn)用到鯉魚（Gprinus carpio）的生物量評(píng)估中，原理是通過分析水環(huán)境中魚類釋放的eDNA濃度與實(shí)際魚類生物量之間的關(guān)系，建立評(píng)估模型。2018年，F(xiàn)ukushima等[27]在日本北部以遠(yuǎn)東哲羅鮭（Parahucho Perryi）為研究對(duì)象，研究不同生長(zhǎng)階段的魚群釋放eDNA的濃度與其生物量之間的關(guān)系，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在魚類生物量恒定的情況下，無論魚大小如何，釋放的DNA濃度都是相等的。這一發(fā)現(xiàn)為eDNA技術(shù)在生物量評(píng)估上的應(yīng)用提供了有力支持，說明eDNA技術(shù)可以被廣泛應(yīng)用于水域生態(tài)系統(tǒng)中魚類等生物量的評(píng)估，為該領(lǐng)域的研究和保護(hù)工作帶來了新的突破和可能。

2" 環(huán)境DNA技術(shù)在土壤環(huán)境中的監(jiān)測(cè)應(yīng)用

2.1" 土壤動(dòng)物監(jiān)測(cè)

陸地環(huán)境的eDNA監(jiān)測(cè)技術(shù)目前主要用于土壤[28]。De Danieli等[29]利用eDNA技術(shù)對(duì)法國(guó)阿爾卑斯山發(fā)現(xiàn)的14種蚯蚓成功設(shè)計(jì)出引物并建立蚯蚓的線粒體DNA參考數(shù)據(jù)庫。Kershner等[30]使用COI基因與核糖體18S rRNA基因設(shè)計(jì)引物，成功鑒定了馬尼斯蒂國(guó)家森林的無脊椎動(dòng)物生物多樣性。Duckert等[31]根據(jù)18S rRNA基因的V9區(qū)域，對(duì)高山環(huán)境中的頂復(fù)動(dòng)物亞門（Apicomplexa）進(jìn)行調(diào)查，推測(cè)生態(tài)系統(tǒng)中無脊椎動(dòng)物的生物多樣性。eDNA技術(shù)在研究土壤動(dòng)物多樣性方面非常具有潛力。

2.2" 微生物與植物監(jiān)測(cè)

eDNA技術(shù)可以用來鑒定土壤中的微生物和區(qū)分不同植物根系。Murat等[32]利用eDNA技術(shù)調(diào)查了8種森林土壤中細(xì)菌和真菌的豐度與多樣性，研究結(jié)果超預(yù)期，展現(xiàn)出eDNA技術(shù)在土壤環(huán)境中的良好應(yīng)用前景。Hardy等[33]分別通過傳統(tǒng)方法和eDNA技術(shù)檢測(cè)根區(qū)疫霉菌（Phytophthora spp.），后者檢測(cè)到的疫霉菌遠(yuǎn)多于前者，表明eDNA技術(shù)對(duì)植物根系菌群檢測(cè)的有效性。植物根系研究在土壤學(xué)中有著重要作用，而其中讓人棘手的是準(zhǔn)確辨別出不同植物的根系。伴隨著高通量測(cè)序（NGS）技術(shù)的發(fā)展，eDNA技術(shù)也用于植物根系研究。瑞典科學(xué)家Winsley等[34]改變傳統(tǒng)的Trnl引物，成功辨別了極地苔原和溫帶大陸草原氣候的植物根系樣本。

2.3" 土壤環(huán)境狀況監(jiān)測(cè)

目前土壤環(huán)境狀況評(píng)價(jià)仍以理化指標(biāo)為主。eDNA技術(shù)的發(fā)展為開展土壤污染狀況和土壤生態(tài)修復(fù)效果評(píng)價(jià)提供了新的方法。eDNA技術(shù)可快速地開展土壤生物調(diào)查，精準(zhǔn)地辨別出不同污染程度的土壤生物群落結(jié)構(gòu)差異[35]，從而評(píng)估環(huán)境對(duì)土壤生物群落的影響和評(píng)價(jià)土壤健康狀況。黃湘云等[36]構(gòu)建eDNA物種敏感性分布法（eDNA-SSD），嘗試判斷有哪些關(guān)鍵因素導(dǎo)致土壤污染嚴(yán)重，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)即使在缺少污染基準(zhǔn)值的條件下，通過eDNA技術(shù)仍然可以做出對(duì)土壤污染狀況的綜合評(píng)價(jià)。Gellie等[37]利用eDNA技術(shù)對(duì)土壤中真菌進(jìn)行定量監(jiān)測(cè)分析，研究其對(duì)生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)的反應(yīng)，以評(píng)估恢復(fù)效果，結(jié)果表明eDNA技術(shù)在生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

3" eDNA技術(shù)在空氣環(huán)境中的監(jiān)測(cè)應(yīng)用

傳統(tǒng)空氣生物學(xué)一直以來依賴于培養(yǎng)基和顯微鏡來評(píng)估生物多樣性和物種豐度。這一方法存在局限性，如只能檢測(cè)出能夠在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物，而不能檢測(cè)出那些無法在體外培養(yǎng)的微生物；當(dāng)微生物處于死亡或休眠狀態(tài)，也無法被傳統(tǒng)方法檢測(cè)到。eDNA技術(shù)應(yīng)用到空氣環(huán)境微生物檢測(cè)，直接從空氣樣品中獲取微生物的遺傳信息，而不需要將其培養(yǎng)在特定的培養(yǎng)基上[38]，這就對(duì)空氣環(huán)境中微生物監(jiān)測(cè)、分類、評(píng)估提供了可能性。2012年，Bibby等[39]首次使用eDNA技術(shù)對(duì)一座5層建筑屋頂空氣中真菌的組成進(jìn)行研究，連續(xù)4個(gè)季節(jié)對(duì)空氣采樣進(jìn)行eDNA分析，結(jié)果顯示空氣中真菌的多樣性與土壤環(huán)境不相上下。在室內(nèi)空氣環(huán)境監(jiān)測(cè)中，Zou等[40]采取培養(yǎng)基法和eDNA技術(shù)對(duì)一間病房的微生物多樣性進(jìn)行檢測(cè)，包括真菌、古菌、細(xì)菌和病毒，eDNA技術(shù)提供了病房中完整的微生物分布情況，而傳統(tǒng)方法一次只能鑒定少量病原體。

除微生物外，eDNA技術(shù)還用于研究通過空氣傳播導(dǎo)致人或動(dòng)物過敏甚至感染的物質(zhì)。Ventayol等[41]運(yùn)用eDNA技術(shù)研究空氣中花粉顆粒的種類組成，使用該技術(shù)與電子顯微鏡相結(jié)合，鑒定并分析采集到的粉粒樣本，結(jié)果表明，相比于傳統(tǒng)的顯微鏡方法，eDNA技術(shù)更易識(shí)別出致人過敏的植物花粉源。在國(guó)內(nèi)，已經(jīng)有研究人員將空氣中的eDNA技術(shù)延用到了生物多樣性評(píng)估當(dāng)中，李應(yīng)等[42]在海南大學(xué)校園內(nèi)布設(shè)空氣eDNA提取器，改良提取方法使捕捉到的DNA序列更加符合要求，最后檢測(cè)到了遠(yuǎn)超過校方已有記錄的植物種類。

4" 環(huán)境DNA技術(shù)在生物入侵監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

外來物種入侵是全球關(guān)注的重大生態(tài)問題，是導(dǎo)致生物多樣性減少的主要影響因素之一。早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警對(duì)防控外來生物入侵愈發(fā)重要，然而部分外來生物具有隱蔽性強(qiáng)、容易擴(kuò)散的特點(diǎn)，使其難以及時(shí)被發(fā)現(xiàn)和防控[15]。eDNA技術(shù)具有高靈敏性和高效性特點(diǎn)，通過分析環(huán)境中的DNA，可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)到外來物種的存在，從而及時(shí)采取相應(yīng)的防控措施。

4.1" 入侵生物識(shí)別

在防控外來物種入侵過程中，如何快速精準(zhǔn)地發(fā)現(xiàn)入侵物種或潛在外來威脅物種非常關(guān)鍵。Taberlet等[43]在歐洲中部地區(qū)采集15個(gè)水體樣本，使用基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，檢測(cè)到了傳統(tǒng)方法未能發(fā)現(xiàn)的入侵物種美國(guó)牛蛙，打開了eDNA技術(shù)用于入侵生物早期監(jiān)測(cè)的思路。此后該技術(shù)逐漸被推廣用于魚類、軟體動(dòng)物等入侵生物的監(jiān)測(cè)。2011年，美國(guó)有研究報(bào)道在芝加哥水道可能存在外來魚類入侵風(fēng)險(xiǎn)。Chadderton等[44]通過分析水道中的環(huán)境DNA，檢測(cè)到鳙魚（Hypophthalmichthys nobilis）和鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）這兩種外來魚類的存在。瑞典研究人員Zaiko等[45]制訂了用于北美楔蛤（Rangia cuneate）監(jiān)測(cè)的特異性分子標(biāo)記法和eDNA監(jiān)測(cè)法，在北冰洋附近波羅的海和威斯佤銹湖實(shí)地檢驗(yàn)了該方法的有效性，在種群密度較小的情況下仍發(fā)現(xiàn)了北美楔蛤的蹤跡。Hopken等[46]在北美洲南部地區(qū)采集6個(gè)地方的水樣，用eDNA技術(shù)在其中5個(gè)地點(diǎn)檢測(cè)到了來自緬甸的兩棲動(dòng)物緬甸蟒（Python bivittatus），檢出率超過了90%，在當(dāng)年被稱為監(jiān)測(cè)緬甸蟒蛇分布的重大技術(shù)突破。

船舶壓艙水及其沉積物具有攜帶和傳播外來物種的風(fēng)險(xiǎn)。eDNA技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于壓艙水檢測(cè)，識(shí)別是否存在外來生物。Borrell等[47]在位于歐洲南部的西班牙港口中的6條貿(mào)易商船中檢測(cè)出了72種藻類，約22%是西班牙本土之外的物種，其中又有一半為有害種，會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境造成破壞。Zhan等[48]分別用淡水、半咸水和氯處理水對(duì)壓艙水中的生物進(jìn)行處理，用eDNA技術(shù)檢測(cè)三者的生物豐度，結(jié)果顯示，即使經(jīng)過氯消毒處理，仍不能減輕壓艙水中外來生物帶來的入侵風(fēng)險(xiǎn)。

除水環(huán)境外，eDNA技術(shù)在21世紀(jì)20年代開始用于農(nóng)林業(yè)的外來物種監(jiān)測(cè)。Rooyen等[49]在采摘葉片上檢測(cè)到了美洲斑潛蠅（Liriomyza sativae）留下的DNA痕跡，由于該昆蟲個(gè)體小且行動(dòng)迅速，相較于直接捕捉，通過對(duì)樹葉或農(nóng)作物植株殘留的痕跡進(jìn)行采樣分析則容易得多。

4.2" 生物入侵過程監(jiān)測(cè)

研究外來物種入侵，還需要搞清楚外來物種是通過何途徑進(jìn)入到所定居的生態(tài)系統(tǒng)中，eDNA技術(shù)已用于這方面研究。

Steinke等[50]對(duì)黑魚（Channa argus）進(jìn)行特異DNA標(biāo)記，再利用eDNA技術(shù)和GenBank大數(shù)據(jù)合并矩陣分析，結(jié)果在該黑魚捕撈地分支的49條河流或溪流中檢測(cè)到了相同的DNA，為該生物通過何種路徑入侵提供了的證據(jù)。Takahara等[51]在日本本島附近的19處海域發(fā)現(xiàn)了外來入侵魚類藍(lán)鰓太陽魚（Lepomis macrochirus），為弄清這種魚從何而來，采集本州島、四國(guó)島及九州島附近的70個(gè)水樣進(jìn)行eDNA分析，結(jié)果顯示該魚在本州島附近的密度最高，向外呈擴(kuò)散趨勢(shì)，其余地點(diǎn)則趨勢(shì)不明顯或密度很低。Uchida等[52]采取多重?zé)晒舛考夹g(shù)分別對(duì)3種本土魚和入侵魚進(jìn)行標(biāo)記，在各地的100個(gè)池塘分季節(jié)分時(shí)間段進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)不論是本土魚還是入侵魚均在夏至左右檢出率較高，且伴隨著人類活動(dòng)越頻繁的地方，3種外來入侵魚類的DNA要明顯高出本土魚。這些研究結(jié)果為弄清外來物種的擴(kuò)散入侵過程提供依據(jù)。

5" 環(huán)境DNA技術(shù)應(yīng)用中注意的問題與展望

在生物多樣性監(jiān)測(cè)中，eDNA技術(shù)作為新興調(diào)查技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，應(yīng)用潛力巨大，但目前eDNA技術(shù)仍未能取代傳統(tǒng)調(diào)查方式成為主流方法，多作為一種輔助調(diào)查手段，其存在的問題和不足亟需改進(jìn)和完善。

5.1" eDNA技術(shù)操作流程的標(biāo)準(zhǔn)化

最佳的eDNA技術(shù)操作流程與實(shí)驗(yàn)方案，可減少調(diào)查過程誤差，確保調(diào)查結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性；規(guī)范化的操作技術(shù)流程，可確保調(diào)查結(jié)果的一致性和可比性。目前在eDNA技術(shù)應(yīng)用方面，亟待制訂全球或國(guó)家范圍內(nèi)的統(tǒng)一技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)或操作流程技術(shù)規(guī)范，如從濾膜孔徑選擇到最后算法的整個(gè)環(huán)節(jié)，在全球或國(guó)家范圍內(nèi)統(tǒng)一技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和操作流程，規(guī)范采樣方法、實(shí)驗(yàn)流程和數(shù)據(jù)分析，為eDNA技術(shù)應(yīng)用提供參考。為推動(dòng)eDNA技術(shù)在魚類生態(tài)學(xué)研究中的標(biāo)準(zhǔn)化，一些國(guó)際組織已開始相關(guān)工作，如歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CEN）和日本分別在討論制訂eDNA技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化問題[53-54]。

5.2" DNA及rRNA數(shù)據(jù)庫的完善

在生物監(jiān)測(cè)中，eDNA技術(shù)廣泛推廣應(yīng)用面臨的一個(gè)重要問題是DNA序列參考數(shù)據(jù)庫的不完整性和錯(cuò)誤信息。進(jìn)行物種鑒定和分類注釋通常依賴于公共參考數(shù)據(jù)庫，如NCBI（美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫）、EMBL（歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫）、BOLD（生命條形碼數(shù)據(jù)庫）等[55]，目前這些數(shù)據(jù)庫中并非所有物種的DNA序列都得到了充分收錄，而且可能存在數(shù)據(jù)錯(cuò)誤或缺失。由于物種分布的地區(qū)差異，建立本土基因數(shù)據(jù)庫也非常重要。目前本土基因數(shù)據(jù)庫的物種覆蓋度仍然較低，使用已有的本土數(shù)據(jù)庫進(jìn)行研究時(shí)，存在無法檢測(cè)到一些物種的信息的情況[56]。與DNA相比，以12S rRNA作為靶向基因可以獲得更準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果，但在全球范圍內(nèi)，以12S rRNA為主的數(shù)據(jù)庫嚴(yán)重缺乏，未來需在不斷完善DNA序列數(shù)據(jù)庫的同時(shí)建立以12S rRNA為主的基因參考數(shù)據(jù)庫。

5.3" eDNA的假陽性和假陰性

應(yīng)用eDNA技術(shù)檢測(cè)時(shí)，常面臨假陰性和假陽性問題。假陰性指的是目標(biāo)物種DNA實(shí)際存在于樣品中，卻未能檢出；假陽性則指檢測(cè)出取樣環(huán)境中并不存在的物種或已經(jīng)死亡的物種[56]。

導(dǎo)致假陰性的原因有多種可能：1）目標(biāo)物種在樣品中的eDNA濃度過低，沒有達(dá)到檢測(cè)下限閾值，特別是低豐度物種在樣品中的eDNA濃度較低，很可能無法檢測(cè)到[57]；2）樣品本身的理化特性可能對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生抑制作用，影響目標(biāo)物種的檢測(cè)結(jié)果[58]；3）引物的通用性和分辨率也可能影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性，如果引物選擇不當(dāng)或低通用性，可能導(dǎo)致一些物種被遺漏或誤檢[59]。此外，PCR擴(kuò)增本身具有一定的隨機(jī)性，即使是同一個(gè)樣本，在多次平行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中所得到的結(jié)果可能不盡相同。使用高清晰引物及多點(diǎn)位序列分析（Multilocus Sequence Typing）的方法可增加eDNA檢測(cè)效率。導(dǎo)致假陽性的原因主要是樣品污染，樣品之間污染或外源污染導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，在實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中注意操作規(guī)范，避免樣品污染。

5.4" eDNA采集地點(diǎn)和時(shí)間的不確定性

eDNA分布存在空間和時(shí)間的不確定性。在不同類型環(huán)境中，eDNA擴(kuò)散的距離可能差異較大。在靜水水域，水生動(dòng)物的活動(dòng)區(qū)域相對(duì)固定，eDNA擴(kuò)散范圍也相對(duì)有限[60]；而在溪流等流動(dòng)水體中，eDNA可能擴(kuò)散較遠(yuǎn)，如一條河流中瀕危蛙類的eDNA可以在下游20 km外的地方被檢測(cè)到[61]。在動(dòng)態(tài)生態(tài)系統(tǒng)中，如流水、強(qiáng)風(fēng)及活動(dòng)范圍大的生物，eDNA的擴(kuò)散能力強(qiáng)，可能導(dǎo)致在不同環(huán)境中的研究結(jié)果存在較大差異。eDNA濃度也受季節(jié)影響，尤其是在繁殖季節(jié)期間及雄性競(jìng)爭(zhēng)、配子釋放等行為活動(dòng)增加時(shí)，會(huì)導(dǎo)致eDNA濃度和檢出率的提高[62]，而不同水生動(dòng)物的交配季節(jié)存在差異。有研究指出兩棲動(dòng)物的eDNA同樣受到季節(jié)的影響，Godwin等[63]對(duì)兩種瀕危兩棲爬行動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，它們所釋放的eDNA濃度與不同時(shí)間的活動(dòng)強(qiáng)度呈正相關(guān)。因此，充分了解目標(biāo)物種的生活史和行為特征對(duì)確定合適的取樣時(shí)間、提高eDNA檢出效果非常重要，否則檢出結(jié)果可能存在較大誤差。

隨著eDNA技術(shù)的不斷發(fā)展，如新的測(cè)序技術(shù)可以允許更長(zhǎng)的trnL片段被測(cè)序，進(jìn)一步提高分辨率與降低成本，以及現(xiàn)有不足的不斷改進(jìn)和完善，eDNA技術(shù)將會(huì)在生物多樣性監(jiān)測(cè)中得到廣泛推廣應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯：敬廷桃）