福州市行道樹杧果葉斑病發(fā)生情況調(diào)查與病原菌鑒定

摘 要 為了解福州行道樹杧果葉斑病發(fā)生情況并明確其病原菌，采用“Z”形選點法與五點取樣法對福州中心4城區(qū)的18條道路行道樹杧果葉斑病發(fā)生程度開展調(diào)查，并采集病樣進(jìn)行病原菌分離純化，根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行室內(nèi)致病性測定，結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)研究對其進(jìn)行鑒定分析。結(jié)果表明，福州市4城區(qū)行道樹杧果葉斑病普遍存在且發(fā)生程度差異顯著，平均病情指數(shù)為25.63。從病樣共分離出鏈格孢菌（Alternaria）、炭疽菌（Colletotrichum）、擬莖點霉菌（Phomopsis）3種真菌菌株，均能侵染杧果葉片產(chǎn)生病斑，使葉片逐漸枯萎，導(dǎo)致杧果樹勢衰弱。

關(guān)鍵詞 杧果；葉斑病；病情指數(shù)；病原菌鑒定；ITS序列

中圖分類號：S432 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.21.007

杧果Mangifera indica L.，又名檬果，漆樹科杧果屬常綠喬木，作為果樹和行道樹在中國廣泛栽種，主要分布在廣西、云南、海南、廣東、四川、臺灣、福建、貴州8?。▍^(qū)）約100多個縣（市）[1]。隨著杧果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，杧果炭疽病、白粉病、葉斑病、杧果流膠病、杧果蒂腐病、瘡痂病、煤煙病、枝枯病、褐根病、膏藥病、曲霉病等病害問題日益凸顯[2]，造成巨大的經(jīng)濟損失。杧果葉斑病作為杧果較常見的一種病害，主要危害葉片，使葉片產(chǎn)生斑點并干枯，影響杧果光合作用[3]，對杧果產(chǎn)量和園林綠化應(yīng)用都產(chǎn)生巨大的影響。杧果葉斑病致病病原菌種類多樣，有樹生黃單胞菌Xanthomonas arboricola、粉紅聚端孢菌Trichothecium" roseum、球座菌Guignardia [4]、黑曲霉Aspergillu niger、黑附球菌Epicoccum nigrum、鏈格孢菌Alternaria tenuissima、粉孢霉Oidium mangiferae Berther、膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides [5]和擬莖點霉菌Phomopsis [6]等 。

杧果因具有適應(yīng)性廣、速生易長、抗逆性強、栽培管理容易、經(jīng)濟壽命長（50 年以上）、樹形整齊等優(yōu)點[1]，常作為福州城市園林建設(shè)綠化樹種，在鼓樓區(qū)、臺江區(qū)、晉安區(qū)、倉山區(qū)等中心4城區(qū)大量栽種。但近年來，福州城市行道樹杧果葉斑病危害日益嚴(yán)重，主要為害癥狀表現(xiàn)為葉片初生圓形、近圓形或不規(guī)則形的黑色小病斑，隨著病斑擴大或連片，病斑中央呈褐色，邊緣黑褐色或黑色，發(fā)病嚴(yán)重時葉片枯死，導(dǎo)致杧果樹出現(xiàn)黃葉、落葉和樹勢衰弱等，嚴(yán)重影響城市園林綠化景觀。為掌握福州市行道樹杧果葉斑病的發(fā)生情況，探明杧果葉斑病的致病病原菌，本研究對福州市中心4城區(qū)行道樹杧果葉斑病的發(fā)生情況開展系統(tǒng)性調(diào)查，并分離和純化病原菌，通過柯赫氏法則驗證，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)研究進(jìn)行病原菌鑒定，以期為杧果葉斑病的防治提供參考。

1" 材料與方法

1.1" 杧果葉斑病發(fā)生情況調(diào)查

1.1.1" 調(diào)查地點與方法

選擇福州市鼓樓區(qū)（北環(huán)中路、公益路、湖東路、六一北路），臺江區(qū)（群眾東路、廣達(dá)路），晉安區(qū)（連江中路、長樂中路、秀峰路）及倉山區(qū)（倉前路、望峰路、盤嶼路、照嶼路、鳳冠路、冠浦路、上下店路、金林路、高宅路）18條具有代表性的道路作為行道樹杧果葉斑病調(diào)查地點。

采用“Z”形選點法在每條道路兩側(cè)各選取5株成齡杧果樹，每株分別在樹冠的東、西、南、北、中5個位點截取1～2枝帶葉枝條，調(diào)查并記錄葉片總數(shù)、各級病葉數(shù)，計算病情指數(shù)。

病情指數(shù)（DI）=[∑（各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9）]×100

1.1.2" 葉片病害發(fā)生程度分級

根據(jù)每株杧果樹采集的葉片病斑面積進(jìn)行分級，分為6級[7]。

0級：葉片無病斑；1級：病斑面積占整個葉片面積的5%以下；3級：病斑面積占整個葉片面積的6%～15%；5級：病斑面積占整個葉片面積的16%～25%；7級：病斑面積占整個葉片面積的26%～50%；9級：病斑面積占整個葉片面積的51%以上。

1.1.3" 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，運用DMRT法進(jìn)行方差分析。

1.2" 病原菌分離與鑒定

1.2.1" 病樣采集和病原菌分離純化

于福州市城區(qū)道路兩側(cè)杧果樹上采集具有典型癥狀的杧果葉片，將杧果病葉清潔后，參考組織分離法，切取約3 mm×3 mm病健交界處的葉片組織，用75%酒精浸洗30～35 s后，用無菌水浸洗4～5次，再用無菌濾紙去除多余水分后將小塊病葉組織轉(zhuǎn)移到無菌PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3 d。再在分離培養(yǎng)得到的單株病原菌菌落邊緣處切取約1 mm×1 mm菌絲塊，轉(zhuǎn)至無菌PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，如此重復(fù)純化培養(yǎng)3次，最后將純化菌株轉(zhuǎn)至PDA斜面培養(yǎng)基上，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2" 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～6 d，觀察菌落顏色、形狀、大小、菌絲形態(tài)、是否產(chǎn)孢、分生孢子及分生孢子梗形態(tài)等，根據(jù)其形態(tài)特征進(jìn)行病原菌初步鑒定[8]。

1.2.3" 病原菌致病性測定及柯赫式法則驗證

實驗室條件下，選擇帶柄的健康杧果葉片進(jìn)行菌餅接種。將葉片消毒處理后，在葉主脈兩側(cè)制造微傷口，一側(cè)接種純化后的菌餅，一側(cè)接種無菌的PDA培養(yǎng)基塊作為對照，且上下設(shè)置未造傷和造傷對照，最后于保濕條件下，25 ℃恒溫進(jìn)行光暗周期培養(yǎng)，觀察接種葉片發(fā)病情況，通過組織分離法對接種葉片病部的病原菌進(jìn)行分離鑒定。

1.2.4" 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

通過TPS法提取培養(yǎng)5～7 d真菌菌絲基因組DNA，用ITS通用引物（ITS1序列為5’-TCCGTAGG TGAACC TGCGC-3’，ITS4序列為5’-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3’[5]）進(jìn)行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測序。通過NCBI-BLAST網(wǎng)站進(jìn)行序列比對，選擇同源性高的序列并使用MEGA-X64軟件采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 杧果葉斑病調(diào)查結(jié)果

調(diào)查結(jié)果表明，所有調(diào)查路段內(nèi)行道樹杧果都存在葉斑病危害情況，病情指數(shù)均值為25.63，其中晉安區(qū)秀峰路最高（DI均值為36.29），倉山區(qū)鳳冠路次之（DI均值為33.37），臺江區(qū)廣達(dá)路最低（DI均值為19.45）。DMRT法檢驗結(jié)果表明，不同路段間的病情指數(shù)均值存在顯著差異（p＜0.05，見圖1）。

比較各區(qū)杧果葉斑病的病情指數(shù)均值，晉安區(qū)（DI均值為28.38）＞倉山區(qū)（DI均值為26.76）＞鼓樓區(qū)（DI均值為24.02）＞臺江區(qū)（DI均值為19.66），晉安區(qū)危害程度最重，臺江區(qū)危害程度最輕（見表1）。

2.2" 病原菌的分離鑒定

2.2.1" 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

從杧果葉斑病病部共分離到3種菌落形態(tài)不同的病原菌MG1、MG2、MG3。

病原菌MG1的菌落初期為白色，呈放射狀，菌絲致密，后期中部形成黃褐色圓形菌圈；分生孢子呈倒棍棒形，褐色，初步鑒定為鏈格孢菌。

病原菌MG2的菌落初期為白色、近圓形，菌絲致密呈放射狀，后期中部變成黑褐色，邊緣呈淺褐色，并產(chǎn)生橘紅色分生孢子堆；分生孢子呈橢圓形，兩端鈍圓，單胞，無色，初步鑒定為炭疽菌。

病原菌MG3的菌落初期為白色，呈扁平狀，后期逐漸形成多層黃褐色輪紋；分生孢子無色單胞，紡錘形，初步鑒定為擬莖點霉菌。

2.2.2" 病原菌分子生物學(xué)鑒定

3種病原真菌DNA模板通過ITS通用引物擴增片段的長度約為500 bp，將檢測所得基因序列提交 GenBank數(shù)據(jù)庫，通過BLAST進(jìn)行同源比對，同源性均在95%以上。選擇相似度高的菌株序列，以NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，本次試驗分離到的病原菌分別為鏈格孢菌、炭疽菌、擬莖點霉菌。

2.3" 病原菌致病性測定及柯赫式法則驗證

通過柯赫氏法則對杧果葉斑病病原菌進(jìn)行致病性測定，觀察菌餅接種發(fā)病情況，部分葉片造傷處接種后2～3 d逐漸形成黑褐色病斑并不斷擴大，4 d后部分病斑處開始產(chǎn)生少量菌絲，5 d后發(fā)病葉片逐漸枯萎，空白對照組未出現(xiàn)病害癥狀。通過組織分離法對接種葉片病部的病原菌再次進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果與接種病原菌一致。

3" 討論與結(jié)論

調(diào)查結(jié)果表明，福州市4城區(qū)道路杧果樹普遍存在葉斑病危害現(xiàn)象，且不同路段發(fā)病程度差異明顯，以秀峰路最嚴(yán)重。初步分析，導(dǎo)致道路杧果葉斑病發(fā)病嚴(yán)重的原因有：道路兩側(cè)杧果樹種植過密，樹干附著苔蘚、地衣及蕨類植物等，樹冠郁閉度大，不通風(fēng)，濕度較高，當(dāng)達(dá)到適宜溫度與濕度時，易發(fā)生葉斑病危害；道路周邊無高層建筑物遮擋，杧果樹受日灼影響導(dǎo)致整體樹勢弱，長勢不佳，易被病菌侵染；養(yǎng)護水平差異影響，非中心區(qū)域的道路管理較粗獷，未能及時對病蟲枝、病葉、枯枝進(jìn)行修剪與清理，常常導(dǎo)致病原菌仍在病殘體內(nèi)，繼續(xù)對杧果樹產(chǎn)生危害；部分道路杧果樹同時存在煤煙病、介殼蟲或黑斑病等其他病蟲危害，導(dǎo)致樹勢減弱，其他病蟲造成的微傷口為葉斑病病原菌入侵危害提供了便利，加快了致病菌的侵染發(fā)病。因此，福州4城區(qū)所有調(diào)查路段杧果葉斑病發(fā)病程度存在顯著性差異主要與杧果樹勢、環(huán)境溫度、濕度條件及道路養(yǎng)護水平不同密切相關(guān)。同時，本研究明確了福州城區(qū)行道樹杧果葉斑病的3種病原菌為鏈格孢菌、炭疽菌、擬莖點霉菌，均在侵染杧果葉片后產(chǎn)生黑褐色病斑，影響杧果樹的園林觀賞價值。其中，鏈格孢菌與周銀麗等[2]對杧果葉斑病病原菌的鑒定結(jié)果一致，擬莖點霉菌與張頂洋等[3]從杧果葉斑病病葉中分離到的病原菌一致，炭疽菌與任一兵等[5]報道的5種杧果葉斑病病原菌中的膠孢炭疽菌同為Colletotrichum屬，但還需進(jìn)一步定種。

可選用80%代森錳鋅和50%克菌丹防治由鏈格孢菌引起的杧果葉斑病[9]；或使用對杧果炭疽菌具有較好拮抗作用的沃豐康-復(fù)合微生物菌劑，對杧果炭疽病的防效在60%及以上[10]；或使用貝萊斯芽孢桿菌，能顯著抑制杧果膠孢炭疽菌菌絲的生長[11-12]；或使用0.3%四霉素水劑，研究表明，該水劑對火龍果膠孢炭疽菌起到較好的抑制作用[13]；或使用45%咪鮮胺EW抑制杧果膠孢炭疽菌的生長，使用咪鮮胺與三唑酮6︰4的混配藥劑能起到明顯的增效作用[14]；或選用高效納米氫氧化鎂抗真菌制劑抑制杧果擬莖點霉葉斑病病原菌，質(zhì)量濃度越高，抑菌活性越強[3]。除了采取化學(xué)防治與生物防治措施，行道樹杧果葉斑病防治還可采取合理密植、病殘枝清除、內(nèi)膛枝疏剪、樹木復(fù)壯、工具消毒等養(yǎng)護管理措施，降低病原菌的初侵染源數(shù)量，增強樹勢，減少病害發(fā)生。

本研究的調(diào)查與病原菌鑒定結(jié)果可為福州城區(qū)行道樹杧果葉斑病的科學(xué)防治提供參考，提高杧果樹的園林觀賞價值和經(jīng)濟效益，助力城市園林生態(tài)建設(shè)可持續(xù)發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：易" 婧）