廢水養(yǎng)殖的小球藻對小白菜生長的肥效試驗

摘 要 為了探究廢水養(yǎng)殖的小球藻作肥料在促進植物生長方面的潛能，研究了小球藻的養(yǎng)分含量及小球藻對廢水中總氮、總磷、COD的吸收率，以及不同小球藻肥料處理對小白菜生長、品質(zhì)及土壤酶活性、微生物群落的影響。結(jié)果表明，小球藻中含有豐富的碳水化合物和蛋白質(zhì)，并且對廢水中總氮、總磷、COD均具有較高的吸收效率，達到了79%～91%的去除效果；廢水養(yǎng)殖的小球藻鮮藻液處理能顯著提升小白菜生長和品質(zhì)，并提高土壤酶活力，改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，具有開發(fā)成高值化肥料的潛力。

關(guān)鍵詞 小球藻；廢水；小白菜；生長；土壤群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S634.3；S144 文獻標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.21.002

在過去數(shù)十年里，我國的化肥使用量持續(xù)上升，但肥料的利用效率相對較低，在30%～50%之間[1]，多余的養(yǎng)分通過農(nóng)田排水或表面流水流入河流和湖泊，對環(huán)境造成了極大的破壞，導(dǎo)致我國的主要水域都存在各種程度的營養(yǎng)過剩問題。為了全面提升養(yǎng)分資源的管理水平，改善土壤狀況，促進農(nóng)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，采取了一系列措施，包括開發(fā)配方肥、生物有機肥和新型肥料等，以實現(xiàn)從高產(chǎn)高效到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)高效的轉(zhuǎn)變，最終達到提高品質(zhì)和效率的目的。

藻類廢水處理技術(shù)最開始是在1957年由Oswal等人[2]提出，截至目前，挪威和日本已開展了通過微藻培養(yǎng)從而實現(xiàn)保護環(huán)境的研究[3]。微藻生物反應(yīng)器作為一種新興的廢水處理方法，具有占地面積小、無二次污染、操作簡單和運行費用低等優(yōu)點，近年來受到越來越多的關(guān)注。在我國，微藻處理污水技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生活污水、養(yǎng)殖場廢水和工業(yè)廢水治理中[4-7]。微藻由于生長速度快、繁殖能力強、易于馴化栽培，近年來已成為一種新興的廢水處理方法。在眾多微藻種類中，小球藻有能力在無光照的異養(yǎng)條件下，將廢水中的銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和葉綠素等含氮元素，其對氮和磷的最大吸收能力約為80%[8-9]，國內(nèi)外眾多研究人員已經(jīng)開始將這些微藻的深度脫氮除磷方法與提高微藻生物量、生產(chǎn)藻類油脂的技術(shù)相結(jié)合[10-12]。此外，藻類因具有固氮特點，常用作肥料施于糧食、果蔬、花卉及草坪等作物中，旨在促進種子發(fā)芽，增加作物產(chǎn)量和質(zhì)量，提高土壤質(zhì)量[13-16]。

本研究利用小球藻對豬場廢水進行脫氮除磷，將廢水中的氮磷轉(zhuǎn)化為微藻的營養(yǎng)物質(zhì)，在廢水達標(biāo)排放的同時，實現(xiàn)微藻細胞的資源化利用，探究了微藻生物肥對土壤理化性質(zhì)及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為開發(fā)微藻生物肥料和促進農(nóng)作物綠色高效種植提供理論支撐。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

1.1.1" 豬場厭氧廢水

本試驗采用的豬場沼液廢水是由煙臺龍大養(yǎng)殖有限公司提供，用清水稀釋成50%體積比，用于微藻培養(yǎng)處理。廢水初始營養(yǎng)物濃度為：總氮130.82 g·mL-1、總磷4.83 g·mL-1、COD 680.54 g·mL-1。

1.1.2" 供試微藻

小球藻原藻種（Chlorella vulgaris）是由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水資源藻種庫供應(yīng)，供試藻種用BG-11培養(yǎng)。將小球藻接種到用清水稀釋成50%體積比的廢水中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度25 ℃，光照4 000 Lux，光暗比12 h∶12 h，轉(zhuǎn)速140 r·min-1。使用血球計數(shù)板，并在顯微鏡下進行觀察和計數(shù)，計算小球藻的濃度并據(jù)此繪制其生長趨勢圖。

1.2" 試驗方法

1.2.1" 微藻生物質(zhì)的收獲和表征

將收獲后的小球藻用蒸餾水洗滌3次以除去殘留的營養(yǎng)物質(zhì)和污染物，然后在60 ℃烘箱中干燥以獲得干燥的微藻生物質(zhì)。對獲得的干燥微藻生物質(zhì)進行生物化學(xué)表征，使用二硝基水楊酸比色法來評估碳水化合物含量，使用GB 5009.5—2016中凱氏定氮法和GB 5009.6—2016中索式抽提法來評估蛋白質(zhì)和脂質(zhì)含量。此外，使用JY/T 017—1996元素分析法進行元素表征以計算干燥微藻生物質(zhì)中存在的碳（C）、氫（H）、氧（O）、氮（N）和硫（S）含量的百分比。使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測定干燥微藻生物質(zhì)中鈉（Na）、鉀（K）、鈣（Ca）、磷（P）等元素含量。

1.2.2" 廢水中總氮、總磷、COD濃度的動態(tài)監(jiān)測

每天提取廢水和微藻混合系統(tǒng)中的水樣，采用HJ 828—2017中重鉻酸鹽法測定廢水中化學(xué)需氧量（COD）；采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定廢水中總氮（TN）含量；采用鉬酸銨分光光度法測定廢水中總磷（TP）的含量。

1.2.3" 小白菜盆栽試驗

供試土樣為煙臺市周邊農(nóng)田里的田園土，其基本理化性質(zhì)為：堿解氮含量189.65 mg·kg-1，速效鉀含量165.98 mg·kg-1，速效磷含量36.91 mg·kg-1。以小白菜為供試植物，進行微藻肥效試驗，共設(shè)置5個處理：1）清水對照處理（CK）；2）鮮藻肥處理（BC，廢水養(yǎng)殖的對數(shù)期小球藻鮮藻液）；3）上清液處理（B，廢水養(yǎng)殖的對數(shù)期小球藻鮮藻液3 000 r·min-1離心10 min后獲得的上清液）；4）藻泥液處理（C，對數(shù)期的小球藻鮮藻液3 000 r·min-1離心10 min后獲得的沉淀物+等量的水）；5）原沼液處理（PB，未使用的體積比為50%的沼液）。當(dāng)小白菜開始發(fā)芽時，每隔3 d使用上述不同處理溶液澆灌1次，每次的量為50 mL。小白菜成熟采收后，每個處理采集5株，使用葉面積儀測定葉面積大小，使用電子天平測定植株新鮮重量和干重量。此外，對小白菜的品質(zhì)指標(biāo)進行檢測，葉片中維生素C含量采用2，6-二氯酚靛酚滴定法測定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定。

1.2.4" 土壤酶活性測定

小白菜生長周期結(jié)束后，采集小白菜根際區(qū)的土壤。從每個處理中隨機選擇3株小白菜植株，隨機選取靠近植物根際的6個點，采用小鏟取其0～2 cm根際土壤，將土壤樣品裝入自封袋中，讓其自然風(fēng)干，然后碾碎、過篩，并放置一旁備用。

土壤酸性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶活性采用試劑盒測定，土壤酸性磷酸酶和蔗糖酶試劑盒由索萊寶公司提供，土壤脲酶測試盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2.5" 土壤微生物群落測定

供試土壤使用TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒進行基因組DNA抽提后，利用Thermo NanoDrop One檢測DNA的純度和濃度。以基因組DNA為模板，選取515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對16S rRNA基因的V3和V4區(qū)域進行了PCR擴增。根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度進行了等量混合，并確保充分混合后，使用2%的瓊脂糖凝膠電泳來檢測PCR產(chǎn)物。使用凝膠回收試劑盒來回收PCR混合產(chǎn)物，并使用TE緩沖液來洗脫并回收目標(biāo)DNA片段。使用Illumina Nova 6000平臺對構(gòu)建的擴增子文庫進行了PE250測序。

1.2.6" 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用GraphPad Prism 8.0軟件進行繪圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 小球藻對廢水中營養(yǎng)物質(zhì)的去除率

如圖1所示，隨著培養(yǎng)時間延長，小球藻生物量不斷積累，廢水中總氮、總磷含量和COD呈遞減趨勢，當(dāng)小球藻生物量達到最大時，廢水中總氮、總磷和COD濃度分別降到18.93、0.41、140.95 g·mL-1，去除率分別為91.51%、85.52%、79.28%，符合國家規(guī)定的廢水排放水平。

2.2" 不同施肥處理對小白菜生長的影響

由表1可知，不同處理的小白菜單株鮮重、干重、葉面積差異較大，均達顯著水平。其中BC處理的單株鮮重、干重、葉面積均達到最大值，分別為10.08 g、0.82 g、71.04 cm2，比CK提高了227.2%、225.4%、164.95%。綜合比較小白菜的單株鮮重、干重、葉面積這3項指標(biāo)，BC處理表現(xiàn)最好，其次是B、C、PB處理，CK處理表現(xiàn)最不理想。

2.3" 不同施肥處理對小白菜品質(zhì)的影響

由表1可知，在不同處理條件下，小白菜葉片中可溶性糖、可溶性蛋白和維生素C含量存在明顯的差異，都達到了顯著水平。其中BC處理的葉片可溶性糖、可溶性蛋白、維生素C含量均達到最大值，分別為58.60、17.04、479.76 mg·g-1，比CK提高了131.71%、37.29%、33.87%，表現(xiàn)最好，其次是C、B、PB處理，CK處理表現(xiàn)均最差。

2.4" 不同施肥處理對土壤酶活性的影響

如圖2所示，與CK、PB處理相比，小球藻鮮藻液（BC）、藻泥（C）、上清液（B）處理后土壤中的蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶活性顯著提高，其中鮮藻液（BC）處理后的土壤蔗糖酶、脲酶和酸性磷酸酶活性最高，分別為12.7、1 364.02、18 065 U·g-1，較對照組分別提高了170.33%、191.43%、260.18%。藻泥（C）處理效果次之，較對照組分別提高了96.61%、75.23%、87.2%。上清液（B）處理雖然不及鮮藻液處理效果好，但土壤酶活力相比對照組也有顯著提高，這些結(jié)果說明加入小球藻及細胞分泌物后，土壤酶活力顯著改善，有利于促進土壤有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化和N、P的吸收。

2.5" 不同施肥處理對土壤微生物群落的影響

通過對各樣本細菌16S rRNA的V3～V4區(qū)片段進行高通量測序并聚類后，共獲得7 839個ASV，隸屬于27門60綱96目187科499屬。根據(jù)聚類結(jié)果，構(gòu)建優(yōu)勢菌群系統(tǒng)發(fā)育進化樹如圖3（見封三）所示。在門水平上，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、未分類的Candidatus_Saccharibacteria門和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）等在各處理中是主要的優(yōu)勢細菌門，占細菌序列的97%以上（平均相對豐度＞1%）。

如圖4（見封三）所示，BC處理后的根際土壤樣本中變形菌門和擬桿菌門豐度顯著提高（p＜0.05），放線菌門和酸桿菌門豐度降低。變形菌門是所有細菌中豐度最高的，包含許多病原菌，也包含了許多能夠固氮的細菌。變形菌門具有吞噬細菌及其他有機物的能力，并且可以通過形態(tài)的變化來適應(yīng)不同的環(huán)境和生活方式。這類生物廣泛存在于自然界中的土壤、水體和動物體內(nèi)等環(huán)境中，是自然界中重要微生物群體之一。與此同時，變形菌門具有一系列重要的生物功能，如在氮循環(huán)、有機物分解、土壤修復(fù)等生態(tài)過程中起到重要的作用。

圖5（見封三）揭示了排名前30的土壤細菌群落在不同處理之間的相對豐度差異及聚類關(guān)系?？梢钥闯觯珺C處理后的根際土壤樣本中類諾卡氏菌屬、溶桿菌屬和假單胞菌屬相對豐度顯著提高（p＜0.05），Gaiella和Gemmatirosa相對豐度降低。這些結(jié)果有力地表明，微藻作為肥料對細菌豐度在門、屬水平上有一定的影響，說明微藻及其細胞分泌物改變了土壤細菌群落的組成和豐度。

2.6" 功能預(yù)測

使用FAPROTAX對根際土壤細菌群落功能注釋后共獲得29個功能種群分組，其中豐度排名前十的微生物群落功能主要有尿素分解（ureolysis）、殼聚糖分解（chitinolysis）、芳香族化合物降解（aromatic_compound_degradation）、好養(yǎng)亞硝酸氧化（aerobic_nitrite_oxidation）、硝酸還原（nitrate_reduction）、硝酸呼吸（nitrate_respiration）、硝化作用（nitrification）、固氮作用（nitrogen_fixation）、氮呼吸（nitrogen_respiration）和硫酸呼吸（sulfate_respiration）。

如圖6（見封三）所示，處理組與CK組微生物群落功能明顯不同。BC處理后的根際土壤中微生物群落殼聚糖分解、硝酸還原、固氮作用和芳香族化合物降解代謝功能豐度較CK處理顯著提高，說明小球藻鮮藻液及分泌物改變了土壤微生物群落功能。

3" 討論與結(jié)論

生物肥料作為一種提高作物生產(chǎn)力的手段，在可持續(xù)農(nóng)業(yè)中越來越重要，以環(huán)境友好和經(jīng)濟可行的方式減少化學(xué)肥料的污染影響。在各種類型的生物肥料中，光合生物（包括真核微藻、無氧光養(yǎng)生物和藍藻）的作用越來越重要，微藻是一類微小的單細胞或簡單多細胞水生生物，具有高效的光合作用能力和快速的生物生長速度。它們通過光合作用吸收光能、二氧化碳和無機鹽，轉(zhuǎn)化為有機物和氧氣。在凈化沼液的過程中，微藻主要利用沼液中的有機物、氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)進行生長，同時吸收和固定這些營養(yǎng)物質(zhì)，從而降低沼液中的污染物濃度。除此之外，微藻在其生長和代謝活動中也能產(chǎn)生如吲哚乙酸和細胞分裂素等植物生長調(diào)節(jié)劑，這對農(nóng)作物的生長和提高其抗病能力都是有益的[17-18]。Xu等人采用微藻Scenedesmus sp.來處理沼液，他們發(fā)現(xiàn)沼液中的COD、TN、TP、銨態(tài)氮和無機磷含量顯著下降，這些變化對大白菜的生長產(chǎn)生了顯著的促進作用[19]。在此基礎(chǔ)上，進一步考察了沼液對小白菜的促進作用及沼液中微藻類生物量與蔬菜產(chǎn)量之間的關(guān)系。本研究也得到了相似的發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過微藻處理，廢水中COD、TN、TP濃度都有了明顯的下降，達到了79%～91%的去除效果。另外，我們還發(fā)現(xiàn)在相同濃度下，用不同藻種培養(yǎng)得到的小白菜產(chǎn)量有顯著差異。綜合分析，發(fā)現(xiàn)使用廢水養(yǎng)殖的微藻肥料可以有效促進小白菜生長，增強其營養(yǎng)價值和土壤酶活性，改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，這為廢水的資源化處理和微藻肥的高效利用提供參考。

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（責(zé)任編輯：易" 婧）