狂犬病病毒突變株rRC-HL（GX074P1M1）的構(gòu)建及其生物學(xué)特性

摘要：【目的】構(gòu)建狂犬病病毒（RABV）突變株rRC-HL（GX074P1M1）并探究其生物學(xué)特性，分析磷蛋白（P）與基質(zhì)蛋白（M）部分區(qū)域聯(lián)合突變對(duì)RABV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制水平的影響，以了解RABV的致病機(jī)制，為靶點(diǎn)預(yù)防與治療提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^反向遺傳學(xué)技術(shù)，將RABV街毒株GX074的P蛋白P1區(qū)域（第48～78位氨基酸）與M蛋白M1區(qū)域（第1～22位氨基酸）聯(lián)合嵌入弱毒株RC-HL相應(yīng)位置，通過間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting分別測(cè)定突變毒株和對(duì)照毒株［RC-HL、GX074、rRC-HL（GX074PM）和CVS-11］感染細(xì)胞BSR/T7-9后的病毒滴度與核蛋白（N）基因、P基因和M基因及其蛋白相對(duì)表達(dá)量?！窘Y(jié)果】通過病毒拯救成功獲得突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）。病毒多步生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果顯示，感染BSR/T7-9細(xì)胞24～96 h內(nèi)，突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）的病毒滴度均高于親本毒株RC-HL和GX074。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）在感染24和48 h時(shí)，N基因、P基因和M基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著（Plt;0.05）或極顯著（Plt;0.01，下同）高于親本毒株RC-HL和GX074。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，在感染24 h時(shí)，與親本毒株RC-HL相比，突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）的N蛋白、P蛋白和M蛋白相對(duì)表達(dá)量均小幅上升；在感染48 h時(shí)，突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）的N蛋白、P蛋白和M蛋白相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于親本毒株RC-HL與GX074?！窘Y(jié)論】RABV街毒株GX074的P1和M1區(qū)域聯(lián)合嵌入弱毒株RC-HL獲得的突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）復(fù)制及轉(zhuǎn)錄水平比親本毒株高，在細(xì)胞內(nèi)具有更強(qiáng)的增殖能力，表明街毒株GX074的P蛋白P1區(qū)域和M蛋白M1區(qū)域在促進(jìn)病毒轉(zhuǎn)錄及復(fù)制中發(fā)揮協(xié)同作用。

關(guān)鍵詞：狂犬病病毒（RABV）；GX074；RC-HL；P1；M1；生長(zhǎng)特性；反向遺傳

中圖分類號(hào)：S852.659.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）10-3106-11

Construction of rabies virus mutant strain rRC-HL（GX074P1M1）and its biological characteristics

LI Wen-fang1，2，PENG Jing1，2，LUO Xi1，2，YANG Wen-hao1，2，WEI Xian-kai1，2，LI Xiao-ning1，2，3*，LUO Ting-rong1，2，3，4*

（1College of Animal Science and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004，China；2State Key Labo-ratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Nanning，Guangxi 530004，China；3GuangxiVeterinary Biological Products Engineering Research Center，Nanning，Guangxi 530004，China；4Guangxi Key Labora-tory of Animal Breedingamp;Disease Control and Prevention，Nanning，Guangxi 530004，China）

Abstract：【Objective】The objective of this study was to construct the rabies virus（RABV）mutant strain rRC-HL（GX074P1M1）and investigate its biological characteristics，analyzed the impact of combined mutations in the phospho-protein（P）and matrix protein（M）regions on RABV transcription and replication levels，in order to study the patho-genic mechanisms of RABV and provide theoretical basis for targeted prevention and treatment.【Method】Using reverse genetics technology，the P protein P1 region（amino acids at positions 48-78）and M protein M1 region（amino acids atpositions 1-22）of the RABV street strain GX074 were co-embedded into the corresponding positions of the attenuatedstrain RC-HL.The virus titers and the relative expression levels of the nucleoprotein（N）gene，P gene，and M gene，as well as their proteins were determined for the mutant strain and control strains［RC-HL，GX074，rRC-HL（GX074PM），and CVS-11］after infection of BSR/T7-9 cells using indirect immunofluorescence assay（IFA），real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting.【Result】The mutant strain rRC-HL（GX074P1M1）was successfully obtainedthrough virus rescue.Multi-step virus growth curve assays showed that the virus titer of the mutant strain rRC-HL（GX074P1M1）was higher than that of the parental strains RC-HL and GX074 within 24-96 h post infection of BSR/T7-9 cells.Real-time fluorescence quantitative PCR revealed that the relative expression levels of the N gene，P gene and M gene of the mutant strain rRC-HL（GX074P1M1）were significantly（rlt;0.05）or extremely significantly（rlt;0.01，thesame below）higher than those of the parental strains RC-HL and GX074 at 24 and 48 h post infection.Westernblottingresults indicated that at 24 hpost infection，the relative expression levels of N protein，P protein and M proteins in the mu-tant strain rRC-HL（GX074P1M1）were slightly higher than those in the parental strain RC-HL.At 48 h post infection，the relative expression levels of N protein，P protein and M proteins in the mutantstrainrRC-HL（GX074P1M1）were ex-tremely significantly higher than those in the parental strains RC-HL and GX074.【Conclusion】The mutantstrainrRC-HL（GX074P1M1），obtained by co-embedding the P1 and M1 regions of the RABV street strain GX074 into the attenuatedstrain RC-HL，exhibits higher replication and transcription levels than the parental strains，indicating a stronger intracellu-lar proliferation capability.This suggests that the P protein P1 region and M protein M1 region of the street strain GX074 play synergistic effects in promoting viral transcription and replication.

Key words：rabies virus（RABV）；GX074；RC-HL；P1；M1；growth characteristics；reverse inheritance

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32070161，31570147）；Guangxi Natural Science Foundation（2020GXNSFAA297212）

0引言

【研究意義】狂犬病是一種由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的接觸性人獸共患傳染病，一旦出現(xiàn)臨床癥狀幾乎100%死亡，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全世界每年死于狂犬病的人數(shù)高達(dá)5.9萬(wàn)。RABV因具有血腦屏障穿透性而不易用藥物治療，各國(guó)控制狂犬病流行均采用以注射疫苗為主的預(yù)防措施，進(jìn)行精細(xì)的RABV結(jié)構(gòu)研究，對(duì)提高疫苗針對(duì)性尤為重要。【前人研究進(jìn)展】RABV隸屬于彈狀病毒科狂犬病病毒屬，其基因組全長(zhǎng)約12 kb，為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，從3'端至5'端依次編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和病毒RNA聚合酶蛋白（L）（Hidaka et al.，2018）。RABV的P蛋白由297個(gè)氨基酸組成，具有高度親水性，P基因通過特定的翻譯機(jī)制可翻譯出5種不同大小的P蛋白，這些P蛋白定位在細(xì)胞的不同位置，發(fā)揮重要功能（Cheniketal.，1995）。RABV的P蛋白是與核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物一起形成螺旋狀核殼的重要中間體，P蛋白在N-RNA模板上能正確定位，因?yàn)镻蛋白具有2個(gè)獨(dú)立的N蛋白結(jié)合區(qū)域，分別位于C端和N端，較強(qiáng)的結(jié)合區(qū)域位于P蛋白C端，與N-RNA復(fù)合物中的N蛋白結(jié)合，較弱的結(jié)合區(qū)域位于P蛋白N端，主要結(jié)合新產(chǎn)生的N蛋白（Liu et al.，2004；Mavrakis et al.，2004，2006）。P蛋白阻止N蛋白與細(xì)胞RNA結(jié)合，對(duì)病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起重要作用（Jacob et al.，2001）。P蛋白可與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）（Vidy et al.，2005；Zhan et al.，2021）、黏著斑激酶（Fouquet et al.，2015）、熱休克蛋白90（Hsp90）（Xu et al.，2016）、自噬蛋白Beclin 1（Liu et al.，2017）、Rho家族GTP酶Rac1（徐婧，2023）等多種宿主蛋白直接或間接作用以調(diào)控宿主抗病毒功能。RABV的M蛋白是負(fù)鏈RNA病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)病毒的組裝和出芽具有重要作用。M蛋白由202個(gè)氨基酸組成，是RABV結(jié)構(gòu)蛋白中最小的，但其變異頻率卻較大（Mebatsionetal.，1999）。M蛋白位于RABV粒子的囊膜下，連接RNP和G蛋白（Guichard etal.，2011）。M蛋白通過與宿主的多種蛋白相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)病毒轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的功能，其利用富含脯氨酸的基序與細(xì)胞蛋白的WW結(jié)構(gòu)域相互作用，促進(jìn)病毒出芽（Hartyet al.，1999）；M蛋白可與NF-κB家族蛋白R(shí)elAp43結(jié)合，抑制病毒感染后期與先天免疫相關(guān)的NF-κB依賴性基因表達(dá)（Ben Khalifa et al.，2016；Besson etal.，2017）；Zan等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，M蛋白能以線粒體為靶標(biāo)，在病毒感染后期誘導(dǎo)線粒體凋亡，以促進(jìn)病毒的復(fù)制和傳播；劉杏（2020）研究發(fā)現(xiàn)，V型ATP酶轉(zhuǎn)運(yùn)亞基A（ATP6V1A）與M蛋白相互作用，促進(jìn)病毒的復(fù)制；張曦等（2023）研究發(fā)現(xiàn)，M蛋白第74位氨基酸（組氨酸）對(duì)M蛋白定位至線粒體有重要影響；此外，Zhang等（2023）研究發(fā)現(xiàn)，M蛋白可劫持宿主蛋白Desmin，實(shí)現(xiàn)病毒成分在細(xì)胞內(nèi)的有效轉(zhuǎn)運(yùn)，從而幫助病毒出芽。RABV的反向遺傳學(xué)技術(shù)逐漸發(fā)展成熟，Schnell等（1994）用痘病毒感染刺激細(xì)胞從而促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)RNA聚合酶；Buchholz等（1999）構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)T7RNA聚合酶的BSR-T7/5細(xì)胞系；Inoue等（2003）建立依賴于細(xì)胞聚合酶Ⅱ，兩端分別連接錘頭狀核酶和丁型肝炎病毒核酶，并接合在pcDNA3.1/Zeo（+）載體CMV啟動(dòng)子下游的RABV全長(zhǎng)質(zhì)粒系統(tǒng)；Ito等（2003）構(gòu)建了含有RC-HL毒株全長(zhǎng)基因組的質(zhì)粒pRC-HL（+）與含有RC-HL毒株N基因、P基因和L基因序列的3個(gè)輔助質(zhì)粒pcDNA-RN、pcDNA-RP及pcDNA-RL，是RABV基因功能研究的重要工具。本課題組前期分離獲得了廣西街毒株GX074，通過反向遺傳技術(shù)將街毒株GX074的P基因和M基因替換至弱毒株RC-HL相應(yīng)位置進(jìn)行聯(lián)合突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒致病性提高，且突變毒株rRC-HL（GX074PM）的復(fù)制水平介于親本弱毒株和街毒株之間；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將街毒株GX074的M蛋白第1～22位氨基酸與P蛋白全長(zhǎng)聯(lián)合替換至弱毒株RC-HL相應(yīng)位置，或?qū)⒔侄局闓X074的P蛋白第48～78位氨基酸與M蛋白全長(zhǎng)聯(lián)合替換至弱毒株RC-HL相應(yīng)位置，獲得的突變毒株在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力均與親本弱毒株RC-HL相似，但明顯高于親本街毒株GX074（陸麗瑩等，2022；周桂全等，2023）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究RABV的P蛋白P1區(qū)域（第48～78位氨基酸）和M蛋白M1區(qū)域（第1～22位氨基酸）聯(lián)合突變的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過反向遺傳學(xué)技術(shù)，將街毒株GX074的P蛋白P1區(qū)域與M蛋白M1區(qū)域聯(lián)合嵌入弱毒株RC-HL相應(yīng)位置，構(gòu)建RABV突變株并探究其生物學(xué)特性，通過間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting分別測(cè)定突變毒株和對(duì)照毒株感染BSR/T7-9細(xì)胞后的病毒滴度與N基因、P基因和M基因及其蛋白相對(duì)表達(dá)量。分析P1和M1區(qū)域聯(lián)合突變對(duì)RABV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制水平的影響，以了解RABV的致病機(jī)制，為靶點(diǎn)預(yù)防與治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

pRC-HL質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒pT7IRES-N、pT7IRES-P和pT7IRES-L均由日本岐阜大學(xué)源宣之教授惠贈(zèng)；pRC-HL（GX074P1M）和pRC-HL（GX074PM1）感染性cDNA克隆均為本課題組前期研究構(gòu)建保存；BSR/T7-9細(xì)胞系與RABV固定毒株CVS-11和弱毒株RC-HL均由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供；RABV街毒株GX074為本課題組前期研究分離保存；RABV突變毒株rRC-HL（GX074PM）為本課題組前期研究拯救保存；限制性內(nèi)切酶AgeⅠ購(gòu)自美國(guó)NEB公司；限制性內(nèi)切酶SacⅡ、PrimeSTAR MAX Premix（2×）、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV和RNA酶抑制劑均購(gòu)自日本TaKaRa公司；2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司；LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑、DMEM培養(yǎng)基粉末、Opti-MEMTM減血清培養(yǎng)基和GeneJET凝膠回收試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司；2×Taq PCR MasterMixⅡ和大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；RABV N蛋白鼠源單克隆抗體和免疫熒光染色試劑盒（含抗小鼠Alexa Fluor 488）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；內(nèi)參蛋白β-Actin鼠源單克隆抗體購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank已公布的RC-HL毒株基因組序列（登錄號(hào)AB009663）和本課題組前期研究測(cè)序獲得的GX074毒株基因組序列，比對(duì)弱毒株RC-HL和街毒株GX074的P蛋白氨基酸序列P1區(qū)域及M蛋白氨基酸序列M1區(qū)域（圖1），設(shè)計(jì)將GX074毒株P(guān)基因P1片段和M基因M1片段替換至RC-HL毒株相應(yīng)位置的cDNA克隆引物（表1），委托南寧捷尼斯生物科技有限公司合成。

1.3 RABV突變株感染性cDNA克隆的構(gòu)建

以pRC-HL（GX074P1M）質(zhì)粒為模板，采用含有AgeⅠ酶切位點(diǎn)的引物AgeⅠ-F和含有重疊片段的引物P1-R擴(kuò)增P1片段，以pRC-HL（GX074PM1）質(zhì)粒為模板，利用含有SacⅡ酶切位點(diǎn)的引物SacⅡ-R和含有重疊片段的引物M1-F擴(kuò)增M1片段，通過重疊PCR將2個(gè)片段進(jìn)行連接獲得P1M1片段。采用限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和SacⅡ?qū)RC-HL質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切獲得線性化載體，利用同源重組一步法克隆試劑盒將P1M1片段連接至線性化載體，以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在LA培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序。

1.4 RABV突變株的拯救

將BSR/T7-9細(xì)胞接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。感染性cDNA克隆與輔助質(zhì)粒pT7IRES-N、pT7IRES-P和pT7IRES-L分別取2.0、0.4、0.1和0.2μL，用200.0μL Opti-MEMTM減血清培養(yǎng)基溶解混勻；同時(shí)，取4.0μL脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000于200.0μLOpti-MEMTM減血清培養(yǎng)基中溶解混勻，室溫靜置5 min；將質(zhì)粒和脂質(zhì)體溶解液混合，室溫靜置20min。棄去12孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液，用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，將質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合液加入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔400.0μL，置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，6 h后棄去上清液，更換為含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基，每孔1 mL，至培養(yǎng)第3 d時(shí)每孔再補(bǔ)充1 mL含2%FBS的DMEM。培養(yǎng)6 d后將12孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于-80℃超低溫冰箱凍融2次，收集凍融液，4℃下12000 r/min離心5 min，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將凍融液接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的細(xì)胞中，每孔100.0μL，接種2 h后更換為含2%FBS和1%甲基纖維素的DMEM，48 h后通過IFA檢測(cè)細(xì)胞中特異性病毒熒光灶形成情況。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，將含有病毒粒子的凍融液接種至BSR/T7-9細(xì)胞中盲傳3代，提取盲傳3代后的細(xì)胞凍融液總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用引物AgeⅠ-F和SacⅡ-R擴(kuò)增目的片段，膠回收后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 RABV突變株的多步生長(zhǎng)曲線測(cè)定

測(cè)定突變毒株與對(duì)照毒株RC-HL、GX074、rRC-HL（GX074PM）和CVS-11的病毒滴度，然后按感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.01的劑量接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的BSR/T7-9細(xì)胞中，分別收集感染后24、48、72和96 h的上清液，采用IFA測(cè)定不同感染時(shí)間的病毒滴度，使用GraphPad Prism 9.0繪制病毒的多步生長(zhǎng)曲線。

1.6 RABV突變株的結(jié)構(gòu)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

將突變病毒株與對(duì)照毒株RC-HL、GX074、rRC-HL（GX074PM）和CVS-11以0.1 MOI的劑量接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的BSR/T7-9細(xì)胞中。分別于感染后24和48h收集細(xì)胞樣品，提取樣品總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)N基因、P基因和M基因相對(duì)表達(dá)量，引物信息見表2。PCR反應(yīng)體系10.0μL：cDNA模板2.0μL，2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 5.0μL，上、下游引物各0.5μL，超純水2.0μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3min；95℃5 s，60℃30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用LightCy-cler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀［羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司］進(jìn)行檢測(cè)，通過2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.7 RABV突變株的結(jié)構(gòu)蛋白相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

病毒接種方法同1.6，收集感染后24和48h的細(xì)胞樣品，用含10%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解，通過Western blotting檢測(cè)突變毒株與對(duì)照毒株RC-HL、GX074、rRC-HL（GX074PM）及CVS-11的N蛋白、P蛋白和M蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2021對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），利用GraphPad Prism 9.0制圖。

2結(jié)果與分析

2.1 RABV突變株感染性cDNA克隆的構(gòu)建結(jié)果

RABV突變株感染性cDNA克隆的構(gòu)建策略如圖2-A所示，以pRC-HL（GX074P1M）質(zhì)粒為模板，采用引物AgeⅠ-F和P1-R擴(kuò)增出P1片段，以pRC-HL（GX074PM1）質(zhì)粒為模板，利用引物SacⅡ-R和M1-F擴(kuò)增出M1片段，產(chǎn)物大小符合預(yù)期（圖2-B）；通過重疊PCR將P1和M1片段連接得到P1M1片段，與預(yù)期大小一致（圖2-C）；采用限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和SacⅡ?qū)RC-HL質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切獲得線性化載體（圖2-D），利用同源重組一步法克隆試劑盒將P1M1片段連接至線性化載體，以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在LA培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)鑒定成功構(gòu)建RABV突變株感染性cDNA克隆pRC-HL（GX074P1M1）。

2.2 RABV突變株的拯救結(jié)果

通過IFA檢測(cè)到拯救的RABV突變株在細(xì)胞間傳播形成特異性熒光灶，與對(duì)照毒株RC-HL、GX074、rRC-HL（GX074PM）和CVS-11在細(xì)胞間形成的熒光灶形狀相似（圖3-A），初步判斷pRC-HL（GX074P1M1）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BSR/T7-9細(xì)胞后有病毒粒子形成；提取接種病毒后盲傳3代的細(xì)胞凍融液總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明RABV突變株rRC-HL（GX074P1M1）拯救成功（圖3-B）。

2.3 RABV突變株的多步生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

將突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）與對(duì)照毒株RC-HL、GX074、rRC-HL（GX074PM）和CVS-11接種至BSR/T7-9細(xì)胞，通過IFA檢測(cè)不同感染時(shí)間的病毒滴度，繪制病毒多步生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖4所示。感染24～96 h內(nèi)，突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）的病毒滴度均高于親本弱毒株RC-HL和親本街毒株GX074，生長(zhǎng)趨勢(shì)與親本弱毒株RC-HL相似。對(duì)照突變毒株rRC-HL（GX074PM）在感染24h時(shí)的病毒滴度介于親本弱毒株RC-HL和親本街毒株GX074之間，感染72h后病毒滴度高于上述親本毒株。突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）的病毒滴度在感染48 h前高于rRC-HL（GX074PM）毒株，感染72 h后病毒滴度低于rRC-HL（GX074PM）毒株。固定毒株CVS-11在病毒滴度在感染24h后快速升高，但感染24～96 h內(nèi)其病毒滴度均低于RC-HL毒株。

2.4 RABV突變株的結(jié)構(gòu)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）與對(duì)照毒株RC-HL、GX074、rRC-HL（GX074PM）和CVS-11在感染BSR/T7-9細(xì)胞后N基因、P基因及M基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖5所示。感染24 h時(shí)，突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）的N基因和M基因的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于親本弱毒株RC-HL（Plt;0.01，下同），P基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于親本弱毒株RC-HL（Plt;0.05，下同）；在感染48 h時(shí)，突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）的N基因、P基因和M基因相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于親本弱毒株RC-HL。在感染24和48 h時(shí)，對(duì)照突變毒株rRC-HL（GX074PM）的N基因、P基因和M基因相對(duì)表達(dá)量均顯著或極顯著低于突變毒株rRC-HL（GX074P1M1），而與親本弱毒株RC-HL的N基因、P基因和M基因相對(duì)表達(dá)量差異較小。CVS-11毒株N基因、P基因和M基因的相對(duì)表達(dá)量在感染24和48 h時(shí)均顯著或極顯著低于突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）。街毒株GX074的N基因、P基因和M基因相對(duì)表達(dá)量在感染24和48 h時(shí)均低于突變毒株rRC-HL（GX074P1M1），其中N基因和M基因在感染24和48 h時(shí)均差異極顯著，P基因在感染24 h時(shí)差異顯著，在感染48 h時(shí)差異極顯著。突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）N基因、P基因和M基因的相對(duì)表達(dá)量較親本毒株RC-HL上調(diào)，與多步生長(zhǎng)曲線顯示的病毒滴度上調(diào)結(jié)果一致，說(shuō)明RABV的P1和M1片段聯(lián)合突變同時(shí)提高了病毒的復(fù)制水平和轉(zhuǎn)錄水平。

2.5 RABV突變株的結(jié)構(gòu)蛋白相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果

突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）與對(duì)照毒株RC-HL、GX074、rRC-HL（GX074PM）和CVS-11感染BSR/T7-9細(xì)胞后，通過Western blotting檢測(cè)病毒N蛋白、P蛋白和M蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果（圖6）顯示，在感染24h時(shí)，突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）的N蛋白、P蛋白和M蛋白相對(duì)表達(dá)量均較親本弱毒株RC-HL小幅上升，但差異不顯著（rgt;0.05，下同）；感染48h時(shí)，突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）的N蛋白、P蛋白和M蛋白相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于親本毒株RC-HL。感染24 h時(shí)，對(duì)照突變毒株rRC-HL（GX074PM）的N蛋白和P蛋白相對(duì)表達(dá)量均與突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）無(wú)顯著差異，但M蛋白的相對(duì)表達(dá)量較突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）極顯著降低；感染48 h時(shí)，rRC-HL（GX074PM）毒株N蛋白、P蛋白和M蛋白的相對(duì)表達(dá)量均極顯著低于突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）。感染24 h時(shí)，CVS-11毒株N蛋白和M蛋白的相對(duì)表達(dá)量均極顯著低于突變毒株rRC-HL（GX074P1M1），但P蛋白的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異；感染48 h時(shí)，CVS-11毒株N蛋白、P蛋白和M蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）。感染24 h時(shí)，GX074毒株P(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量與突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）無(wú)顯著差異，而N蛋白和M蛋白的相對(duì)表達(dá)量均極顯著低于突變毒株rRC-HL（GX074P1 M1）；感染48 h時(shí)，GX074毒株N蛋白、P蛋白和M蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著均極顯著低于突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）。感染24 h時(shí)，突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）的N蛋白、P蛋白和M蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于親本弱毒株RC-HL和親本街毒株GX074，與多步生長(zhǎng)曲線顯示的病毒滴度變化趨勢(shì)一致，進(jìn)一步說(shuō)明P1和M1區(qū)域聯(lián)合突變對(duì)病毒復(fù)制有促進(jìn)作用。

3討論

RABV的RNP復(fù)合物在病毒組裝和復(fù)制中起關(guān)鍵作用，RABV的P蛋白作為病毒螺旋狀核殼的組成部分可影響病毒復(fù)制，且同為核殼重要組成部分的RNP復(fù)合物形成受N蛋白、P蛋白和L蛋白比例影響（Pattnaik and Wertz，1990；Mei et al.，2017），表明低水平的P基因表達(dá)可通過阻礙RNP形成來(lái)限制病毒復(fù)制。通過同時(shí)修飾RABV的P蛋白動(dòng)力蛋白輕鏈結(jié)合位點(diǎn)和替換G蛋白的第333位氨基酸（精氨酸）可致弱病毒（Mebatsion，2001）。P蛋白被認(rèn)為是主要的干擾素拮抗劑，因?yàn)槠淠芙Y(jié)合信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT），通過P蛋白的強(qiáng)輸出序列引起P-STAT復(fù)合物的核排斥（Wiltzeretal.，2014）。M蛋白是調(diào)節(jié)病毒轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的重要成分。研究表明，M蛋白表達(dá)可調(diào)節(jié)RABV基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制（Finke et al.，2003）；M蛋白的第58位氨基酸對(duì)RABV的復(fù)制也至關(guān)重要（Finke and Conzelmann，2003）。將M基因在RABV全基因組中的順序進(jìn)行重排能致弱病毒（Yang et al.，2014）。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，M蛋白能與RelAp43相互作用調(diào)節(jié)NF-κB通路，在干擾素的刺激下M蛋白和P蛋白配合與STAT1相互作用，共同調(diào)節(jié)Jak-Stat通路，P蛋白和M蛋白能調(diào)節(jié)對(duì)方少數(shù)氨基酸突變?cè)谠撏飞弦鸬母淖儯˙en Khalifa et al.，2016；Sonthonnax et al.，2019）。M蛋白的過度表達(dá)會(huì)增加組蛋白去乙?；?（HDAC6）的表達(dá)，通過微管解聚增強(qiáng)RABV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制（Zan etal.，2017）。

本研究將街毒株GX074的P1和M1片段嵌入弱毒株RC-HL獲得突變毒株rRC-HL（GX074P1M1），在感染BSR/T7-9細(xì)胞24和48h時(shí)，突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）的N基因、P基因和M基因相對(duì)表達(dá)量均顯著或極顯著高于親本弱毒株RC-HL和親本街毒株GX074。本課題組前期研究中，將街毒株GX074的P基因和M基因聯(lián)合替換至弱毒株RC-HL獲得突變毒株rRC-HL（GX074PM），其N基因、P基因和M基因的相對(duì)表達(dá)量在感染24和48h時(shí)均顯著或極顯著低于突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）。以上研究結(jié)果表明，RABV的P基因和M基因聯(lián)合突變區(qū)域不同對(duì)病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制水平調(diào)節(jié)會(huì)產(chǎn)生不同影響，可能是由于突變區(qū)域不同引起病毒蛋白參與的信號(hào)通路變化，從而影響病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平。

Tian等（2017）研究表明，RABV野毒株GD-SH-01的P基因嵌合至實(shí)驗(yàn)室減毒株HEP-Flury獲得的突變毒株rHEP-SH-P在體外的增殖能力較差；而Long等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，rHEP-SH-P毒株在體內(nèi)的生長(zhǎng)相對(duì)較慢，P基因也被抑制。本課題組前期研究中，將街毒株GX074的P基因與街毒株GX01的M基因共同嵌合至弱毒株RC-HL獲得突變毒株rRC-HL（074P-01M），將GX074毒株的M基因與GX01毒株的P基因共同嵌合至弱毒株RC-HL獲得突變毒株rRC-HL（01P-074M），突變毒株與親本弱毒株RC-HL相比復(fù)制效率均降低（陳俊蓉等，2022）；此外還發(fā)現(xiàn)，GX074毒株的P基因和M基因共同嵌合至RC-HL毒株獲得的突變毒株復(fù)制效率比親本毒株RC-HL低；將GX074毒株P(guān)基因的部分片段與M基因全長(zhǎng)聯(lián)合嵌入RC-HL毒株，或?qū)X074毒株的M基因部分片段與P基因全長(zhǎng)聯(lián)合嵌入RC-HL毒株，獲得的突變毒株復(fù)制能力均與親本毒株RC-HL相似（陸麗瑩等，2022；周桂全等，2023）。本研究的多步生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果顯示，將GX074毒株的P蛋白P1區(qū)域與M蛋白M1區(qū)域聯(lián)合嵌入弱毒株RC-HL獲得的突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）在BSR/T7-9細(xì)胞內(nèi)增殖能力比親本弱毒株RC-HL和親本街毒株GX074強(qiáng)，生長(zhǎng)趨勢(shì)與親本弱毒株RC-HL相似，說(shuō)明P蛋白和M蛋白全長(zhǎng)聯(lián)合突變與部分區(qū)域聯(lián)合突變所起的作用存在差異，推測(cè)是由于蛋白內(nèi)氨基酸殘基改變后引起病毒三維結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而影響病毒生長(zhǎng)特性，也可能是由于改變了病毒與宿主相互作用的部分蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，從而使突變毒株呈現(xiàn)不同生長(zhǎng)特性。同時(shí)，突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平高于親本毒株GX074和RC-HL，具有更強(qiáng)的增殖能力，表明RABV街毒株GX074的P蛋白P1區(qū)域和M蛋白M1區(qū)域在促進(jìn)病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中發(fā)揮協(xié)同作用。后續(xù)研究將進(jìn)一步探索P1和M1區(qū)域中哪些氨基酸位點(diǎn)對(duì)協(xié)同影響病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制起關(guān)鍵作用。

4結(jié)論

RABV街毒株GX074的P1和M1區(qū)域聯(lián)合嵌入弱毒株RC-HL獲得的突變毒株rRC-HL（GX074P1M1）復(fù)制及轉(zhuǎn)錄水平比親本毒株高，在細(xì)胞內(nèi)具有更強(qiáng)的增殖能力，表明街毒株GX074的P蛋白P1區(qū)域和M蛋白M1區(qū)域在促進(jìn)病毒轉(zhuǎn)錄及復(fù)制中發(fā)揮協(xié)同作用。

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（責(zé)任編輯劉可丹）