不同養(yǎng)殖模式下生長遲緩與正常華南鯉腸道健康狀況的比較

摘要：【目的】從腸道健康角度揭示華南鯉生長遲緩的原因，為深入探究魚類生長遲緩現(xiàn)象與腸道健康的內(nèi)在關(guān)聯(lián)提供理論依據(jù)?！痉椒ā咳‘?dāng)年同批繁殖的華南鯉幼魚，分別在循環(huán)水和池塘網(wǎng)箱2種養(yǎng)殖模式下養(yǎng)殖5個(gè)月，根據(jù)其體質(zhì)量分為4組［循環(huán)水模式生長正常組（R-N），循環(huán)水模式生長遲緩組（R-GS），池塘網(wǎng)箱模式生長正常組（P-N），池塘網(wǎng)箱模式生長遲緩組（P-GS）］，然后比較分析4組華南鯉的腸道組織形態(tài)、消化酶活性及菌群結(jié)構(gòu)差異?！窘Y(jié)果】2種養(yǎng)殖模式下，生長遲緩華南鯉的腸絨毛高度和肌層厚度均顯著低于生長正常華南鯉（Plt;0.05，下同），腸道淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶的活性也低于生長正常華南鯉，其中胰蛋白酶活性差異達(dá)顯著水平。池塘網(wǎng)箱模式下華南鯉腸道菌群Alpha多樣性指標(biāo)顯著高于循環(huán)水模式下的華南鯉；但同一養(yǎng)殖模式下，生長遲緩與正常華南鯉的腸道菌群Alpha多樣性差異不顯著（Pgt;0.05，下同）。相對于生長正常華南鯉，循環(huán)水模式生長遲緩華南鯉腸道變形菌門相對豐度顯著降低，而脫硫桿菌門、厚壁菌門和放線菌門的相對豐度顯著升高；池塘網(wǎng)箱模式生長遲緩華南鯉腸道梭桿菌門和厚壁菌門的相對豐度顯著下降，而綠彎菌門、藍(lán)藻門和酸桿菌門的相對豐度顯著升高，脫硫桿菌門、放線菌門、浮霉菌門和變形菌門的相對豐度也有所升高，但差異不顯著。在屬分類水平上，循環(huán)水模式生長遲緩華南鯉腸道的未分類脫硫弧菌科、紅球菌屬、弧菌屬和希瓦氏菌屬相對豐度較生長正常華南鯉顯著升高；池塘網(wǎng)箱模式生長遲緩華南鯉腸道的unclassified Pirellulaceae和Fimbriiglobus相對豐度較生長正常華南鯉顯著升高。KEGG信號通路分析結(jié)果表明，2種養(yǎng)殖模式下生長遲緩與正常華南鯉腸道豐度差異菌群均顯著富集在內(nèi)分泌系統(tǒng)通路上?！窘Y(jié)論】無論是在池塘網(wǎng)箱模式還是循環(huán)水模式下，生長遲緩華南鯉的腸道健康指標(biāo)均發(fā)生明顯變化，具體表現(xiàn)為消化酶活性降低，對食物消化能力減弱，即腸道健康水平下降可能是分化出生長遲緩華南鯉的主要原因之一。

關(guān)鍵詞：華南鯉；生長遲緩；腸道健康；消化酶；菌群結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S965.116文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）10-3147-13

Comparison of intestinal health status in growth-stunted andnormal Cyprinus carpio rubrofuscus under differentaquaculture modes

GENG Guo-hua1，2，ZHU Hua-ping2，3*，MA Dong-mei2，3，ZHONG Zai-xuan2，3，ZHAO Shu-hao1，2，F(xiàn)AN Jia-jia2，3，TIANYuan-yuan2，3，HAN Fang1，LIU Xian-de1*

（1Fisheries College，Jimei University，Xiamen，F(xiàn)ujian 361021，China；2Pearl River Fisheries Research Institute，Chi-nese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of Tropical and Subtropical Fishery Resources Application and Cultiva-tion，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Guangzhou，Guangdong 510380，China；3Guangdong Provincial KeyLaboratory of Aquatic Animal Immunology and Sustainable Aquaculture，Guangzhou，Guangdong 510380，China）

Abstract：【Objective】To elucidate the causes of stunted growth in Cyprinus carpio rubrofuscus from the perspectiveof intestinal health，which provided theoretical reference for further investigation of the intrinsic relationship between thefish stunted growth and intestinal health.【Method】C.carpiorubrofuscus juveniles bred in the same batch in the same year were cultured in 2 culture modes for 5 months：recirculating water system and pond netting.They were then divided into 4 groups according to their body weight，with the following designations：normal group in recirculating water system（R-N）；growth-stunted group in recirculating water system（R-GS）；normal group in pond netting（P-N）；growth-stunted group in pond netting（P-GS）.The differences in intestinal tissue morphology，digestive enzyme activities and bacterialflora structure of C.carpiorubrofuscus among the 4 groups were compared and analyzed.【Result】In the 2 culture modes，the height of intestinal villi and the thickness of muscularis propria of growth-stunted C.carpiorubrofuscus were signifi-cantly lower than those of normal C.carpiorubrofuscus（Plt;0.05，the same below），and the activities of intestinal amy-lase，trypsin and lipase were lower than those of normal C.carpiorubrofuscus，with the difference in the activity of tryp-sin reaching a significant level.The Alpha diversity of the intestinal flora of C.carpiorubrofuscus in the pond netting mode was significantly higher than that of C.carpiorubrofuscus in the recirculating water system mode；however，the difference in the Alpha diversity of intestinal flora of growth-stunted and normal-growing C.carpiorubrofuscus in thesame culture mode was not significant（Pgt;0.05，the same below）.Compared with the normal-growing C.carpiorubrofus-cus，the relative abundance of growth-stunted C.carpiorubrofuscus intestinal Proteobacteria was significantly decreasedintherecirculating water system mode，while the relative abundance of Desulfobacterota，F(xiàn)irmicutes and Actinobacteria were significantly increased；the relative abundance of growth-stunted C.carpiorubrofuscus intestinal Fusobacteria and Firmicutes in the pond netting mode was significantly decreased，while the relative abundance of Chloroflexi，Cyanobac-teria and Acidobacteria were significantly increased，and Desulfobacterota，Actinobacteria，Planctomycetes and Protebac-teria also increased in relative abundance，but the differences were not significant.At the genus level，the relative abun-dance of unclassified Desulfovibrionaceae，Rhodococcus，Vibrio，Shewanella in the intestine of growth-stunted C.carpiorubrofuscus in therecirculating water system mode was significantly increased compared with that of normal C.carpioru-brofuscus；the relative abundance of unclassified Pirellulaceae and Fimbriiglobus in the intestine of growth-stunted C.car-piorubrofuscusin the pond netting mode was significantly increased compared with that of normal C.carpiorubrofuscus.The results of KEGG signaling pathway analysis showed that intestinal abundance differential flora in 2 modes of culturein growth-stunted and normal C.carpiorubrofuscus all enriched in the endocrine system pathway.【Conclusion】Both inthe pond netting andrecirculating water system modes，the intestinal health indexes of growth-stunted C.carpiorubrofus-cus change greatly，which is manifested by the reduced activity of digestive enzymes and weakened ability to digest food.In other words，the reduced level of intestinal health is one of the main reasons for the differentiation of growth-stunted C.carpiorubrofuscus.

Key words：Cyprinus carpio rubrofuscus；stunted growth；intestinal health；digestive enzyme；flora structure

Foundation items：National Key Research and Development Program of China（2023YFD2400203）；National Natu-ral Science Foundation of China（32072971）；Guangdong Rural Revitalization Strategy Special Project（2022-SPY-00-019）；Fujian Science and Technology Plan Project（2023N0011）

0引言

【研究意義】華南鯉（Cyprinus carpio rubrofus-cus）是我國云南省元江流域、珠江流域廣東和廣西段及海南省島內(nèi)水域的土著魚類，屬于鯉（Cyprinus carpio Linnaeus）的4個(gè)亞種之一（朱華平等，2018）。在池塘或稻田人工養(yǎng)殖模式下，部分同批繁殖的華南鯉養(yǎng)殖至5月齡后會(huì)分化為生長遲緩型和生長正常型2種群體，二者形體差異明顯，其體質(zhì)量差異在25%左右。腸道健康對魚類的健康至關(guān)重要，健康的腸道具備完善的機(jī)械保護(hù)屏障、化學(xué)保護(hù)屏障、免疫保護(hù)屏障和微生物保護(hù)屏障，在維持內(nèi)環(huán)境平衡及阻礙外來病原微生物入侵方面發(fā)揮重要作用（Vancamelbeke and Vermeire，2017；Zhang et al.，2020；陳秀梅等，2022；蔣鑫濤等，2023）。魚類腸表面是機(jī)械保護(hù)屏障的重要組成部分，其完整性和表面積是評估魚類腸道吸收功能、生長性能及健康水平的重要指標(biāo)（Chen et al.，2018；Bai etal.，2019）；消化酶是魚類健康的化學(xué)保護(hù)屏障，消化酶活性升高可增強(qiáng)對食物的消化能力，有效抵御外來有害物質(zhì)的侵害（Hu etal.，2014）；腸道菌群是魚類的微生物保護(hù)屏障，適宜的菌群組成及比例可為魚類提供維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，抑制腸道致病菌生長和促進(jìn)魚體快速生長（Tran et al.，2018；羅君等，2022）。因此，明確生長遲緩華南鯉腸道健康狀況對揭示其生長遲緩的原因具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】腸道是動(dòng)物消化器官中最長的部分，主要的消化和吸收作用均在腸道內(nèi)完成，尤其是腸道上皮細(xì)胞不僅具有營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的功能，還發(fā)揮屏障保護(hù)和免疫防御的作用（徐革鋒等，2009）。腸道病變可引起肝胰腺等器官的損傷及功能障礙，進(jìn)而影響魚類的整體健康水平（米海峰等，2015）。經(jīng)濟(jì)魚類常見的腸道健康評估指標(biāo)包括腸道內(nèi)壁組織形態(tài)、消化酶活性、腸道微生物組成及其多樣性（Hooper and Macpher-son，2010；米海峰等，2015；何琴等，2023），通過腸道內(nèi)壁組織形態(tài)觀察可測定腸道內(nèi)的腸絨毛高度和寬度，而這2個(gè)指標(biāo)與腸道表面積呈正相關(guān)，是評估腸道消化能力的重要指標(biāo)之一（Caspary，1992；黃玉章等，2010）。魚類腸道內(nèi)消化酶具有消化分解食物和促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收的作用，其活性可反映魚類消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力及腸道健康狀況（Dawood，2021），根據(jù)底物類型的不同，可分為蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶等（張?jiān)讫埖龋?017）。魚類腸道內(nèi)定殖有種類豐富、數(shù)量龐大的菌群，在促進(jìn)魚類生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝、維持宿主健康和免疫調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用（孟曉林等，2019；Xiong et al.，2019）。至今，關(guān)于異速生長魚類個(gè)體生長速度與腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性及組成相關(guān)性的研究已有較多報(bào)道。李英英等（2017）研究表明，生長緩慢大黃魚（Pseudos-ciaenacrocea）腸道菌群OTU數(shù)量及Chao1指數(shù)顯著高于生長正常的大黃魚；饒劉瑜等（2018）通過比較轉(zhuǎn)生長激素基因鯉（Cyprinus carpio L.）和野生對照鯉不同發(fā)育階段的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鯉腸道中存在高豐度的厚壁菌門（Fir-micutes）細(xì)菌，而對照鯉中擬桿菌門（Bacteroidetes）細(xì)菌較多；王沈同（2023）研究證實(shí)，低體質(zhì)量組草魚（Ctenopharyngodonidella）的腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)高于高體質(zhì)量組草魚。此外，某些特殊菌屬可能與魚類生長速率相關(guān)，如快速生長達(dá)氏鰉（Huso dauricus）群體腸道中的鞘氨醇單胞菌屬（Sphin-gomonas）相對豐度（67.0%）顯著高于慢速生長達(dá)氏鰉群體（29.5%）（王若愚等，2023）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，有關(guān)異速生長魚體腸道微生物種群特征的研究已有較多報(bào)道（Sun et al.，2009；Zhang et al.，2021），但系統(tǒng)揭示腸道健康狀況影響魚類生長的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以華南鯉為研究對象，比較分析池塘網(wǎng)箱和循環(huán)水養(yǎng)殖模式下生長遲緩和正常華南鯉的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、消化酶活性及其菌群結(jié)構(gòu)特征，以期從腸道健康角度揭示華南鯉生長遲緩的原因，為深入探究魚類生長遲緩現(xiàn)象與腸道健康的內(nèi)在關(guān)聯(lián)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)魚飼養(yǎng)管理與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取當(dāng)年同批繁殖的華南鯉幼苗（平均體長5.0 cm），400尾養(yǎng)殖于珠江水產(chǎn)研究所室內(nèi)循環(huán)水水泥池（長4.0 m，寬2.5 m，水深約0.8 m；水體約8.0 m3），400尾養(yǎng)殖于池塘網(wǎng)箱（在面積約2234m2的池塘中放置長4.0 m，寬3.0 m，水深約1.8 m的網(wǎng)箱），各養(yǎng)殖階段根據(jù)魚體大小投喂適口的人工配合飼料，循環(huán)水模式的投喂時(shí)間分別為8：30和18：00，池塘網(wǎng)箱模式的投喂時(shí)間分別為9：00和18：30，每日投餌量約為魚體總體質(zhì)量的3%。2種養(yǎng)殖模式在試驗(yàn)期間均持續(xù)充氣增氧，循環(huán)水水池每周換1次曝氣的自來水，換水量為養(yǎng)殖水量的1/2。養(yǎng)殖5個(gè)月后，2種養(yǎng)殖模式下的華南鯉均出現(xiàn)生長遲緩個(gè)體，檢測其腸道健康狀況，分析出現(xiàn)生長遲緩個(gè)體的原因。停止投餌15h后，從循環(huán)水模式中挑選30尾體質(zhì)量高的華南鯉（85.35±15.21 g）設(shè)為循環(huán)水模式生長正常組（R-N），30尾體質(zhì)量低的個(gè)體（17.51±3.43 g）設(shè)為循環(huán)水模式生長遲緩組（R-GS）；從池塘網(wǎng)箱模式中挑選30尾體質(zhì)量高的個(gè)體（93.09±13.78 g）設(shè)為池塘網(wǎng)箱模式生長正常組（P-N），30尾體質(zhì)量低的個(gè)體（18.74±4.57 g）設(shè)為池塘網(wǎng)箱模式生長遲緩組（P-GS）。動(dòng)物試驗(yàn)由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號LAEC-PRFRI-2023-06-35。

1.2腸道樣品采集

華南鯉經(jīng)MS-222麻醉后稱重，每組隨機(jī)取18尾，用75%酒精擦洗體表，無菌操作剪開腹腔和腸道，取出腸道內(nèi)容物，將每3尾魚的腸道內(nèi)容物制成1個(gè)混合樣品，放入2 mL凍存管中，每組采集6個(gè)樣品，液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱保存。每組另取6尾，按腸道生理彎曲部位在中腸相同位置分別截取一小段，4%多聚甲醛固定保存，用于制作腸道組織切片；其他中腸部分經(jīng)液氮速凍后放入-80℃超低溫冰箱保存，用于測定消化酶活性。

1.3腸道組織切片制備及觀察

4%多聚甲醛固定24h的腸道樣品經(jīng)梯度濃度乙醇脫水、二甲苯透明及石蠟包埋后，截面橫切5μm厚的切片，蘇木精—伊紅染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。通過ImageJ比較分析腸道組織結(jié)構(gòu)差異，測量記錄各組華南鯉的腸絨毛高度、寬度和肌層厚度（n=50），并沿腸道橫截面的黏膜曲線畫線測量黏膜長度（n=5），根據(jù)對應(yīng)黏膜上的絨毛數(shù)量計(jì)算腸絨毛密度：

腸絨毛密度（根/mm）=腸絨毛數(shù)量/對應(yīng)黏膜長度

1.4腸道消化酶活性測定

將用于消化酶活性測定的腸道樣品剪開，PBS洗去腸道內(nèi)容物，吸水紙吸干，稱重，然后按照重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入預(yù)冷生理鹽水，置于冰上勻漿，2500 r/min離心10 min，取上清液用于腸道消化酶活性測定。采用紫外比色法測定胰蛋白酶（Trypsin）活性，使用淀粉—碘比色法測定淀粉酶（Amylase）活性，以比色法測定脂肪酶（Lipase）活性，所有消化酶活性檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.5水環(huán)境樣品采集

為分析水環(huán)境菌群與魚類腸道菌群間的關(guān)聯(lián)性，采用五點(diǎn)取樣法分別對循環(huán)水模式（R-W）和池塘網(wǎng)箱模式（P-W）進(jìn)行水樣采集，共5 L水樣，分別重復(fù)取3次水樣。采集的水樣先用0.45μm大孔徑濾膜抽濾去除雜質(zhì)，然后以0.22μm濾膜過濾收集水體中的微生物，液氮速凍保存。

1.6高通量測序分析

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取4組華南鯉24個(gè)腸道內(nèi)容物樣品及6個(gè)水環(huán)境微生物樣品的基因組DNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測合格后，以基因組DNA為模板，使用微生物16S rDNA序列V3～V4可變區(qū)特異性引物（341F：5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'；805R：5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（Logue et al.，2015）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、定量和回收后，委托上海百趣生物醫(yī)學(xué)科技有限公司在NovaSeq 6000測序儀上完成2×250 bp雙端測序。測序獲得的原始數(shù)據(jù)采用Cutadapt去除接頭和引物序列，以FLASH對雙端測序得到的每對Reads進(jìn)行拼接，再用Fqtrim（v0.94）過濾掉長度小于100 bp或不確定堿基含量大于5%的低質(zhì)量Reads，運(yùn)用Vsearch（v2.3.4）去除嵌合體，然后利用DADA2進(jìn)行長度過濾及去噪，最終獲得高質(zhì)量的擴(kuò)增子序列變異體（Ampliconsequence variants，ASVs）（張小明等，2024）。在SILVA數(shù)據(jù)庫（https：//www.arbsilva.de/documenta‐tion/release 138/）中對獲得的ASVs進(jìn)行比對分析及物種注釋，采用Qiime計(jì)算每個(gè)樣品的物種豐度指數(shù)（Observed species）、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和Pieloue指數(shù)，以明確華南鯉腸道微生物群落Alpha多樣性，并通過主坐標(biāo)分析（PCoA）評估腸道微生物群落Beta多樣性。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan?s多重比較，并以t檢驗(yàn)對不同樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)及物種組成進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1 2種養(yǎng)殖模式下華南鯉腸道組織結(jié)構(gòu)差異

2種養(yǎng)殖模式下，華南鯉的中腸組織結(jié)構(gòu)如圖1所示。在顯微鏡觀察的基礎(chǔ)上，對華南鯉腸絨毛的高度、寬度、肌層厚度及腸絨毛密度4個(gè)形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果（圖2）顯示，在池塘網(wǎng)箱模式下，P-GS組華南鯉的腸絨毛高度、肌層厚度和腸絨毛密度均顯著低于P-N組華南鯉（Plt;0.05，下同），腸絨毛寬度也低于P-N組華南鯉，但差異不顯著（Pgt;0.05，下同）；在循環(huán)水模式下，R-GS組華南鯉的腸絨毛高度、寬度和肌層厚度均顯著低于R-N組華南鯉，但腸絨毛密度與R-N組華南鯉無顯著差異。

2.2 2種養(yǎng)殖模式下華南鯉腸道消化酶活性差異

由圖3可看出，無論是池塘網(wǎng)箱模式還是循環(huán)水模式，生長遲緩華南鯉腸道的胰蛋白酶活性均顯著低于生長正常華南鯉，淀粉酶活性和脂肪酶活性也低于生長正常華南鯉，但差異不顯著。在4組華南鯉中，以R-N組華南鯉腸道的胰蛋白酶活性和淀粉酶活性最高。

2.3養(yǎng)殖水體菌群與華南鯉腸道菌群的相關(guān)性

2.3.1養(yǎng)殖水體和華南鯉腸道菌群多樣性基于微生物16S rDNA序列V3～V4可變區(qū)對4組華南鯉24個(gè)腸道內(nèi)容物樣品及2種養(yǎng)殖模式6個(gè)水環(huán)境微生物樣品進(jìn)行高通量測序，并計(jì)算各樣品的菌群多樣性指數(shù)，結(jié)果（表1）顯示，循環(huán)水模式養(yǎng)殖水體及其養(yǎng)殖的華南鯉腸道菌群Alpha多樣性（物種豐度指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和Pieloue指數(shù)）均顯著低于池塘網(wǎng)箱模式下對應(yīng)的各組樣品。同一養(yǎng)殖模式下，生長遲緩與正常華南鯉腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)的差異均不顯著，說明環(huán)境對不同生長速度華南鯉腸道微生物組成具有相似的影響。

基于PCoA分析評估養(yǎng)殖水體和華南鯉腸道菌群Beta多樣性，結(jié)果如圖4所示。在未加權(quán)距離矩陣的PCoA分析中，第一主坐標(biāo)（PCoA1）、第二主坐標(biāo)（PCoA2）的貢獻(xiàn)率分別為34.55%和15.29%；在加權(quán)距離矩陣的PCoA分析中，PCoA1、PCoA2的貢獻(xiàn)率分別為47.29%和22.18%。2種PCoA分析獲得的結(jié)果基本相似，循環(huán)水模式下的樣品聚集于第三象限，池塘網(wǎng)箱模式下的樣品聚集于第四象限；2種養(yǎng)殖模式下的華南鯉腸道內(nèi)容物樣品明顯分開，同一養(yǎng)殖模式下生長遲緩與正常華南鯉的腸道內(nèi)容物樣品聚集在一起，表明養(yǎng)殖模式對華南鯉腸道菌群組成有明顯影響。

2.3.2養(yǎng)殖水體和華南鯉腸道菌群結(jié)構(gòu)特征基于布雷柯蒂斯（Bray-Curtis）距離的UPGMA聚類分析結(jié)果（圖5）顯示，在2種養(yǎng)殖模式下均表現(xiàn)為生長遲緩華南鯉腸道內(nèi)容物樣品先聚為一支，再與生長正常華南鯉腸道內(nèi)容物樣品聚類在一起，即生長遲緩與正常華南鯉的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異，二者間可有效區(qū)分開。

通過繪制Venn圖展示各組樣品間的共有或特有ASV數(shù)目，直觀反映不同樣品間ASV組成的相似性及重疊情況。由圖6-A可看出，所有樣品的共有ASV數(shù)目為19個(gè)，R-W樣品、P-W樣品、P-N樣品、P-GS樣品、R-N樣品、R-GS樣品的特有ASV數(shù)目分別為1244、2572、3124、3847、1367和641個(gè)。由圖6-B～圖6-D可看出，池塘網(wǎng)箱模式下養(yǎng)殖華南鯉腸道內(nèi)容物樣品及其養(yǎng)殖水體的共有ASV數(shù)目明顯高于循環(huán)水模式下對應(yīng)的各組樣品，表明池塘網(wǎng)箱模式養(yǎng)殖水體的菌群多樣性較循環(huán)水模式養(yǎng)殖水體更豐富，使得池塘網(wǎng)箱模式下的生長遲緩華南鯉腸道菌群結(jié)構(gòu)可能更復(fù)雜，涉及的菌群種類更多。此外，2種養(yǎng)殖模式下的生長遲緩華南鯉腸道內(nèi)容物樣品共有ASV數(shù)目為131個(gè)（圖6-B），說明2種養(yǎng)殖模式下生長遲緩華南鯉腸道菌群結(jié)構(gòu)存在相似性。

2.3.3生長遲緩與正常華南鯉腸道菌群組成差異如圖7-A所示，循環(huán)水模式養(yǎng)殖水體的菌群組成以擬桿菌門和變形菌門（Proteobacteria）為主，其相對豐度分別為48.63%和35.81%；池塘網(wǎng)箱模式養(yǎng)殖水體的菌群組成多樣性更高，主要包括放線菌門（Actinobacteria，25.79%）、變形菌門（21.30%）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria，17.88%）和浮霉菌門（Planctomy-cetes，11.27%）等；變形菌門是2種養(yǎng)殖模式下的共有優(yōu)勢菌門。循環(huán)水模式下，華南鯉腸道菌群主要由變形菌門、梭桿菌門（Fusobacteria）和放線菌門組成，相對于生長正常華南鯉，生長遲緩華南鯉腸道變形菌門相對豐度顯著降低，而脫硫桿菌門（Desulfo-bacterota）、厚壁菌門和放線菌門的相對豐度顯著升高。池塘網(wǎng)箱模式下，華南鯉腸道菌群優(yōu)勢菌門由浮霉菌門、梭桿菌門和變形菌門組成，與生長正常華南鯉相比，生長遲緩華南鯉腸道梭桿菌門和厚壁菌門的相對豐度顯著下降，而綠彎菌門（Chloroflexi）、藍(lán)藻門和酸桿菌門（Acidobacteriota）的相對豐度顯著升高，脫硫桿菌門、放線菌門、浮霉菌門和變形菌門的相對豐度也有所升高，但差異不顯著。

如圖7-B所示，在屬分類水平上2種養(yǎng)殖水體的菌群組成存在明顯差異，循環(huán)水模式養(yǎng)殖水體菌群結(jié)構(gòu)組成中相對豐度排名前3的屬分別是黃桿菌屬（Flavobacterium，35.97%）、Limnohabitans（16.47%）和Emticicia（6.03%），池塘網(wǎng)箱模式養(yǎng)殖水體菌群結(jié)構(gòu)組成中相對豐度排名前3的屬分別為hgcI clade（16.35%）、雙色藻屬（Cyanobium PCC-6307，12.80%）和unclassified Pirellulaceae（7.26%）。循環(huán)水模式下，生長遲緩華南鯉腸道的優(yōu)勢菌屬包括氣單胞菌屬（Aeromonas，27.69%）、鯨桿菌屬（Cetobacterium，20.99%）、未分類脫硫弧菌科（unclassified Desulfovi-brionaceae，13.99%）、紅球菌屬（Rhodococcus，10.65%）、弧菌屬（Vibrio，6.65%）和短螺旋體屬（Brevinema，2.48%），生長正常華南鯉腸道的優(yōu)勢菌屬包括氣單胞菌屬（47.96%）、鯨桿菌屬（16.66%）、鄰單胞菌屬（Plesiomonas，7.12%）和短螺旋體屬（1.78%）；相對于生長正常華南鯉，生長遲緩華南鯉的未分類脫硫弧菌科、紅球菌屬、弧菌屬和希瓦氏菌屬（Shewanella）相對豐度顯著升高。池塘網(wǎng)箱模式下，生長遲緩華南鯉腸道的優(yōu)勢菌屬有小梨形菌屬（Pirellula，17.14%）、鯨桿菌屬（7.62%）和unclassified Gemmataceae（4.58%），生長正常華南鯉腸道的優(yōu)勢菌屬包括鯨桿菌屬（31.45%）和unclassified Pirellulaceae（10.85%）；與生長正常華南鯉相比，生長遲緩華南鯉的unclassified Pirellulaceae和Fimbriiglobus相對豐度顯著升高。

2.4華南鯉腸道菌群功能預(yù)測結(jié)果

采用PICRUSt 2預(yù)測華南鯉腸道菌群功能，結(jié)果（圖8）顯示，池塘網(wǎng)箱模式下，生長遲緩與正常華南鯉腸道豐度差異菌群顯著富集在心血管疾病（Cardiovascular disease）、消化系統(tǒng)（Digestive sys-tem）、能量代謝（Energy metabolism）、內(nèi)分泌系統(tǒng)（Endocrine system）及信號分子與相互作用（Signal molecules and interaction）等KEGG信號通路上；循環(huán)水模式下，生長遲緩與正常華南鯉腸道豐度差異菌群則顯著富集在外源性物質(zhì)生物降解與代謝（Xenobiotics biodegradation and metabolism）、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（Cell motility）、循環(huán)系統(tǒng)（Circulatory system）、折疊/分類/降解（Folding，sorting and degradation）及內(nèi)分泌系統(tǒng)等KEGG信號通路上。其中，內(nèi)分泌系統(tǒng)是2種養(yǎng)殖模式下生長遲緩與正常華南鯉腸道豐度差異菌群均顯著富集到的KEGG信號通路，說明無論是在池塘網(wǎng)箱模式還是循環(huán)水模式下，華南鯉腸道健康水平下降和生長遲緩現(xiàn)象可能都與內(nèi)分泌相關(guān)通路異常存在潛在關(guān)聯(lián)。

3討論

腸道健康對于魚類的健康養(yǎng)殖至關(guān)重要，其中，腸絨毛高度和密度的增加可擴(kuò)大腸道消化吸收食物的表面積，肌層厚度增加可增強(qiáng)腸道收縮蠕動(dòng)的能力，因此腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)指標(biāo)可從側(cè)面反映魚體的消化能力（翟少偉等，2016；Cao et al.，2022）。本研究結(jié)果表明，在循環(huán)水和池塘網(wǎng)箱模式下，生長遲緩華南鯉的腸絨毛高度和肌層厚度均顯著低于生長正常華南鯉，與李英英等（2015）對大黃魚、麥浩彬等（2020）對珍珠龍膽石斑幼魚（Epinephelus lanceolatu♂×E.fuscoguttatus♀）的研究結(jié)果相似，即生長緩慢型個(gè)體的腸道肌層較薄、腸絨毛高度和密度較低，而生長快速型個(gè)體的腸絨毛高度和密度均高于正常個(gè)體。由此推測，2種養(yǎng)殖模式下生長遲緩華南鯉的腸道健康均出現(xiàn)異常，腸絨毛高度和密度降低致使腸表面積相應(yīng)減小，腸道消化吸收能力下降，進(jìn)而出現(xiàn)魚體生長緩慢現(xiàn)象。消化酶具有催化食物分解的作用，其活性水平可反映魚體對營養(yǎng)成分的消化和吸收利用能力，是衡量魚類腸道健康及生長狀況的重要指標(biāo)之一（田宏杰等，2006；Comabella et al.，2006；劉敏和張輝，2008；余友斌等，2023）。本研究結(jié)果顯示，無論是池塘網(wǎng)箱模式還是循環(huán)水模式，生長遲緩華南鯉腸道淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶的活性均低于生長正常華南鯉，其中胰蛋白酶活性差異達(dá)顯著水平。消化酶活性與經(jīng)濟(jì)魚類的生長性能間存在高度相關(guān)性，錢永生等（2019）研究發(fā)現(xiàn)快速生長的甌江彩鯉具有較高的蛋白酶活性和脂肪酶活性，袁禹惠等（2023）研究表明生長性能最高的斜帶石斑魚（E.coioides）稚魚腸道胰蛋白酶活性顯著高于其他組別的斜帶石斑魚稚魚。生長遲緩華南鯉消化酶活性降低，導(dǎo)致魚體腸道對食物的消化能力減弱，也是腸道健康水平降低的表現(xiàn)。

魚類腸道內(nèi)定殖有種類豐富、數(shù)量龐大的菌群（Eckburg et al.，2005；Roeselers et al.，2011），與宿主經(jīng)過長期進(jìn)化選擇后共同形成一個(gè)在調(diào)節(jié)生理生化反應(yīng)、促進(jìn)食物消化、介導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答及抵抗病原體侵染等方面發(fā)揮重要作用的微生態(tài)系統(tǒng)（Sugita et al.，1996；Pérez et al.，2010；Ghanbari et al.，2015；Wang et al.，2018）。魚類腸道菌群Alpha多樣性可反映其健康狀況和代謝能力（Clarke et al.，2014；Luan et al.，2023）。本研究結(jié)果表明，池塘網(wǎng)箱模式養(yǎng)殖水體菌群Alpha多樣性指標(biāo)顯著高于循環(huán)水模式養(yǎng)殖水體，與之對應(yīng)的是，池塘網(wǎng)箱模式下華南鯉腸道菌群Alpha多樣性指標(biāo)均顯著高于循環(huán)水模式下的華南鯉，說明魚體腸道菌群多樣性與養(yǎng)殖水環(huán)境中的菌群多樣性呈正相關(guān)，與李存玉等（2015）的研究結(jié)果基本一致，即池塘養(yǎng)殖牙鲆（Paralichthys olivaceus）腸道菌群多樣性高于工廠化養(yǎng)殖牙鲆，且水環(huán)境中的菌群可能直接影響牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)態(tài)。在同一養(yǎng)殖模式下，生長遲緩與正常華南鯉的腸道菌群Alpha多樣性差異不顯著，說明華南鯉腸道菌群Alpha多樣性與其生長性狀間無顯著相關(guān)性，與Chapagain等（2019）的研究結(jié)果一致，即快速生長與慢速生長虹鱒（Oncorhynchus mykiss）間的腸道菌群Alpha多樣性無顯著差異；但Zhao等（2023）對祁連山裸鯉（Gymnocyprischilianensis）的研究發(fā)現(xiàn)，較高體質(zhì)量個(gè)體的腸道微生物群落豐度和均勻度均高于較低體質(zhì)量個(gè)體?？梢?，魚類生長差異與腸道菌群多樣性的關(guān)聯(lián)尚未明確。

除了菌群Alpha多樣性外，腸道菌群結(jié)構(gòu)組成也是衡量腸道健康的重要指標(biāo)（王飛飛等，2022）。本研究結(jié)果顯示，2種養(yǎng)殖模式下華南鯉腸道菌群結(jié)構(gòu)中相對豐度排名前5的門均包括變形菌門、厚壁菌門、浮霉菌門、梭桿菌門和放線菌門，與Wu等（2013）、Eichmiller等（2016）、王蕾（2017）的研究結(jié)果相似。2種養(yǎng)殖模式下，生長遲緩與正常華南鯉的腸道菌群結(jié)構(gòu)組成雖然在門和屬分類水平上相似，但各菌群的相對豐度存在差異，與工廠化和網(wǎng)箱養(yǎng)殖模式下黃條鰤（Seriola lalandi）幼魚（周鶴庭等，2022）、稻田和池塘養(yǎng)殖模式下建鯉（Cyprinus car-piovar.Jian）（趙柳蘭等，2021）的腸道菌群研究結(jié)果相似，說明不同養(yǎng)殖模式下魚類具有穩(wěn)定的核心菌群，但腸道菌群結(jié)構(gòu)組成比例會(huì)隨著養(yǎng)殖水體的變化而改變。此外，無論是池塘網(wǎng)箱模式還是循環(huán)水模式，生長遲緩華南鯉腸道菌群中放線菌門、脫硫桿菌門和藍(lán)藻門的相對豐度較生長正常華南鯉均呈升高趨勢，其中，放線菌門和脫硫桿菌門相對豐度在循環(huán)水模式下呈顯著升高趨勢，藍(lán)藻門相對豐度在池塘網(wǎng)箱模式下呈顯著升高趨勢。放線菌門相對豐度的變化趨勢與王悅等（2021）的研究結(jié)果相似，故推測腸道菌群中放線菌門的相對豐度與華南鯉生長性能存在一定相關(guān)性。在屬分類水平上，循環(huán)水模式下生長遲緩華南鯉腸道菌群中希瓦氏菌屬的相對豐度較生長正常華南鯉顯著升高。希瓦氏菌屬具有適應(yīng)性極強(qiáng)的代謝系統(tǒng)，可產(chǎn)生硫化氫（H2S）（商寶娣等，2015）。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的H2S濃度升高，會(huì)破壞腸道屏障而引起腸道炎癥反應(yīng)（Dordevi?et al.，2021；盧歌雪，2023）。張燕玉等（2019）研究證實(shí)，海藻希瓦氏菌（Shewanella algae）能引起半滑舌鰨腸絨毛出現(xiàn)溶解、脫落等組織損傷，且伴有大量炎性細(xì)胞浸潤于肌肉層和黏膜下層；Choi等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，希瓦氏菌在低體質(zhì)量皺紋盤鮑（Haliotis discus han-nai）腸道中的相對豐度顯著升高。由此推測，華南鯉腸道菌群中希瓦氏菌屬相對豐度較高，可產(chǎn)生高濃度的H2S而破壞腸道屏障，引起腸道損傷及消化能力減弱，最終導(dǎo)致華南鯉出現(xiàn)生長緩慢現(xiàn)象。

4結(jié)論

無論是在池塘網(wǎng)箱模式還是循環(huán)水模式下，生長遲緩華南鯉的腸道健康指標(biāo)均發(fā)生明顯變化，具體表現(xiàn)為消化酶活性降低，對食物消化能力減弱，即腸道健康水平下降是分化出生長遲緩華南鯉的主要原因之一。

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（責(zé)任編輯蘭宗寶）