小菜蛾RyR調(diào)控蛋白FKBP基因克隆及其時空表達(dá)譜

摘要：【目的】明確FK506結(jié)合蛋白（FKBP）基因在小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺抗性形成中的作用，篩選出起主要作用的關(guān)鍵FKBP基因，為闡明小菜蛾抗雙酰胺類殺蟲劑的分子機(jī)理提供新思路。【方法】以抗氯蟲苯甲酰胺種群和敏感種群小菜蛾為研究對象，采用浸葉法測定不同種群小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的敏感性差異；利用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）方法克隆3個FKBP基因（FKBP8、FKBP12和FKBP52）的全長序列，并通過GSDS 2.0、CDD和MEME在線分析軟件分析其基因結(jié)構(gòu)與蛋白保守結(jié)構(gòu)域和Motif；采用實時熒光定量PCR分析抗性種群不同發(fā)育階段和敏感、抗性種群4齡幼蟲不同組織FKBP基因的時空表達(dá)特性?！窘Y(jié)果】生物測定結(jié)果顯示，抗性種群小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗性倍數(shù)為122.67倍，屬于高水平抗性。實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，抗性種群小菜蛾體內(nèi)3個FKBP基因的相對表達(dá)量均顯著高于敏感種群（Plt;0.05，下同），其中FKBP8基因的表達(dá)差異最顯著，是敏感種群的968倍。通過RACE方法克隆得到FKBP52、FKBP8和FKBP12基因的全長序列，長度分別為1473、1525和649 bp，分別編碼423、307和108個氨基酸殘基，其蛋白均為親水蛋白。FKBP52、FKBP8和FKBP12基因具有相同的基因結(jié)構(gòu)，F(xiàn)KBP52和FKBP12蛋白具有相同的保守結(jié)構(gòu)域FkpA，而FKBP8蛋白具有2個不同的保守結(jié)構(gòu)域?？剐苑N群小菜蛾4齡幼蟲體內(nèi)3個FKBP基因表達(dá)量均高于蛹期，其中FKBP12和FKBP8基因在4齡幼蟲中的表達(dá)量最高，顯著高于其他齡期和蛹期。FKBP8基因在抗性種群小菜蛾中腸和表皮中的表達(dá)量顯著高于敏感種群，分別是敏感種群的3.2和3.7倍?！窘Y(jié)論】FKBP52、FKBP8和FKBP12基因在氯蟲苯甲酰胺抗性種群小菜蛾中均過量表達(dá)，其中FKBP8基因在高抗氯蟲苯甲酰胺種群小菜蛾的中腸高表達(dá)，表明其可能通過過量表達(dá)參與小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗藥性。

關(guān)鍵詞：FK506結(jié)合蛋白；FKBP基因；小菜蛾；氯蟲苯甲酰胺；時空表達(dá)特性；抗藥性

中圖分類號：S433.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）10-3023-10

Cloning and spatiotemporal expression analysis of RyRregula?tory protein FKBP gene in Plutellaxylostella（L.）

ZHANG Wan-li1，GE Tian-cheng2，CHEN Qi-chun2，PENG Zheng-ke2，XIAO Yong2，LI Zhen-yu2*，YIN Fei2*

（1Guangdong Tianhe Agricultural Resources Co.，Ltd.，Guangzhou，Guangdong 510080，China；2Institute of PlantProtection，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of HighTechnology for Plant Protection，Guangzhou，Guangdong 510640，China）

Abstract：【Objective】The role of FK506-binding protein（FKBP）gene in the development of resistance of Plutellaxylostella（L.）to chlorantraniliprole was determined，and key FKBP genes involved in this process was identified，provi-ding new insights into the molecular mechanism underlying diamide insecticide resistance in P.xylostella.【Method】Chlorantraniliprole resistant and susceptible populations of P.xylostella were used to determine chlorantraniliprole suscep-tibility difference of P.xylostella by leaf-dip bioassay.The full-length sequence of 3 FKBP genes（FKBP8，F(xiàn)KBP12 and FKBP52）were cloned using rapid amplification of cDNA end（RACE），and its gene structure，protein conserved do-mains and Motifs were analyzed using online softwares including MEME，CDD and GSDS 2.0.Real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR）was used to analyzespatiotemporal expression patterns of FKBP genes in different develop-mental stages of the resistant population，and in different tissues of fourth-instar larvae of both resistant and susceptible populations.【Result】The bioassay revealed a 122.67-time resistance to chlorantraniliprole in the resistant population of P.xylostella，indicating high-level resistance.RT-qPCR analysis showed that the relative expression levels of all 3 FKBP genes of P.xylostella in the resistant population were significantly higher than those in susceptible population（Plt;0.05，the same below）.The full-length sequence of FKBP52，F(xiàn)KBP8 and FKBP12 genes were cloned by the RACE method，with lengths of 1473，1525 and 649 bp，encoding 423，307 and 108 amino acids residues respectively.All 3 proteins were predicted to be hydrophilic.They shared similar gene structures.FKBP52 and FKBP12 protein had the same conserved do-main FkpA，while FKBP8 protein contained 2 different conserved domains.The difference of FKBP8 gene expression was the most significant，which was as 968 times as that in the resistant population.The expression levels of 3 FKBP genes in fourth-instar larvae in the resistant population were higher than those in pupae.The expression levels of FKBP12 and FKBP8 genes were the highest in fourth-instar larvae，significantly higher than in other larval stages and pupae.The expression levels of FKBP8 gene in the midgut and epidermis of the resistant population were significantly higher than those in the susceptible population，being 3.2 and 3.7 times as those in susceptible population respectively.【Conclusion】FKBP52，F(xiàn)KBP8 and FKBP12 genes ofP.xylostella in the chlorantraniliprole-resistant population are all over-expressed.The high expression of FKBP8 gene in the midgut of the highly resistant population suggests its potential involvement in chlorantraniliprole resistance through over-expression.

Key words：FK506 binding protein；FKBP gene；Plutellaxylostella（L.）；chlorantraniliprole；spatiotemporal ex-pression patterns；insecticide resistance

Foundation items：Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation Project（2022A1515012395）；Project of Collaborative Innovation Center of Guangdong Academy of Agricultural Sciences（XTXM202209）

0引言

【研究意義】小菜蛾［Plutellaxylostella（L.）］隸屬于屬鱗翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae），是十字花科蔬菜上的一種世界性害蟲，該蟲已對多種常用殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性（向立剛等，2022）。在我國，小菜蛾危害造成的經(jīng)濟(jì)損失及用于小菜蛾防控的相關(guān)費用年均約7.7億美元（Li etal.，2016；Zhang et al.，2016）。氯蟲苯甲酰胺是首個具有新型鄰酰胺苯甲酰胺類化學(xué)結(jié)構(gòu)的一種廣譜雙酰胺類殺蟲劑，自上市以來被廣泛應(yīng)用于防治鱗翅目害蟲，其銷售量持續(xù)增長且年增長率居眾多殺蟲劑之首（陳鵑和柏亞羅，2021；張新鳳等，2024）。然而，由于氯蟲苯甲酰胺的長期不合理使用，致使小菜蛾對其產(chǎn)生了抗藥性，從而使十字花科蔬菜生產(chǎn)遭受重大損失。闡明小菜蛾抗性分子機(jī)理是有效治理小菜蛾抗藥性的基礎(chǔ)。氯蟲苯甲酰胺可結(jié)合在魚尼丁受體（Ryanodine receptor，RyR）跨膜區(qū)的偽電壓傳感器結(jié)構(gòu)域中，通過激活RyR使其不能正常關(guān)閉，導(dǎo)致鈣離子持續(xù)釋放，致使害蟲的肌肉持續(xù)收縮并最終癱瘓死亡。FK506結(jié)合蛋白（FKBP）具有調(diào)控RyR的功能，并在維持鈣離子通道的穩(wěn)定關(guān)閉中發(fā)揮重要作用。為此，本研究擬從RyR調(diào)控蛋白FKBP著手，探索關(guān)鍵FKBP基因在小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺抗性形成中的作用，旨在為闡明小菜蛾抗雙酰胺類殺蟲劑的分子機(jī)理提供新思路，對治理小菜蛾的抗藥性及延長雙酰胺類殺蟲劑的使用壽命具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】FKBP是一類大環(huán)內(nèi)酯免疫抑制劑，可限制蛋白質(zhì)折疊過程的速度。其屬于肽基—脯氨酸順反異構(gòu)體大家族，具有肽基—脯氨酰基—順反異構(gòu)酶（PPIases）活性，可催化多肽或蛋白質(zhì)底物中的肽基—脯氨酸順反子轉(zhuǎn)換，從而影響其活性、磷酸化狀態(tài)、蛋白質(zhì)間相互作用、亞細(xì)胞定位及穩(wěn)定性；其家族因不同的異構(gòu)體調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞途徑，具有多種生物功能，如分子伴侶、轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)、免疫抑制和凋亡等（Harrar et al.，2001；Barik，2007；Kang et al.，2008；Blackburn and Walkinshaw，2011）。研究表明，F(xiàn)KBP12可與三磷酸肌醇受體（IP3R）和RyR的鈣釋放通道相互作用，具有調(diào)節(jié)RyR的功能，對信號傳導(dǎo)和Ca2+調(diào)控起關(guān)鍵作用（Tong and Yu，2015；Kasahara，2021）。FKBP11調(diào)控MAPK信號通路中蛋白的表達(dá)，影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，其可作為骨肉瘤治療的潛在靶點（曾鐸，2023）。FKBP因其功能多樣，可為多種藥物提供藥物靶點，他克莫司、雷帕霉素、子囊霉素及其衍生物已作為藥物應(yīng)用于臨床（劉菲等，2014）。應(yīng)用FKBP防控害蟲的研究結(jié)果表明，其量變可影響殺蟲劑活性（Bultyncket al.，2000；MacMillan et al.，2008）。FKBP52蛋白與金龜子綠僵菌（Metarhiziumanisopliae）聯(lián)合使用對東亞飛蝗（Locusta migratoriamanilensis）和西花薊馬（Frankliniella occidentalis）的致死率顯著高于單獨使用金龜子綠僵菌的致死率（田野等，2021b；尹仙楓等，2024）。FKBP46與金龜子綠僵菌混用可顯著增加?xùn)|亞飛蝗的死亡率（田野等，2021a）?！颈狙芯壳腥朦c】FKBP具有使RyR的鈣離子通道處于穩(wěn)定的關(guān)閉狀態(tài)等多種功能，其量變影響殺蟲劑對東亞飛蝗和西花薊馬的活性。本課題組前期通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)3個FKBP基因（FKBP8、FKBP12和FKBP52）在氯蟲苯甲酰胺抗性種群小菜蛾中過量表達(dá)。然而，F(xiàn)KBP基因在小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺等雙酰胺類殺蟲劑抗性形成中的作用尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以抗氯蟲苯甲酰胺種群和敏感種群小菜蛾為研究對象，采用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）方法克隆3個FKBP基因（FKBP8、FKBP12和FKBP52）的全長序列，并利用GSDS 2.0、CDD和MEME在線軟件分析其基因結(jié)構(gòu)與蛋白保守結(jié)構(gòu)域和Motif；通過實時熒光定量PCR比較分析不同種群小菜蛾體內(nèi)3個FKBP基因的表達(dá)差異及其時空表達(dá)譜，旨在篩選出在小菜蛾抗氯蟲苯甲酰胺中起主要作用的關(guān)鍵FKBP基因，為闡明小菜蛾抗雙酰胺類殺蟲劑的分子機(jī)理提供新思路。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試蟲供試敏感種群小菜蛾于2004年采集自深圳市十字花科蔬菜田，經(jīng)菜心苗（Brassica campestris）在室內(nèi)未接觸任何殺蟲劑條件下飼養(yǎng)至今，飼養(yǎng)條件：溫度（25±2）℃、相對濕度65%～70%、光周期L∶D=16 h∶8 h。抗性種群小菜蛾為田間采集于廣東惠州地區(qū)的小菜蛾老熟幼蟲和蛹，置于養(yǎng)蟲室（條件同上）內(nèi)飼養(yǎng)，待其羽化后，補(bǔ)充10%蜂蜜水；用菜心苗供成蟲產(chǎn)卵，待幼蟲孵化后飼養(yǎng)至3齡初期用于試驗。敏感種群和抗性種群小菜蛾分別記為SS和HZ?？剐苑N群隔代用亞致死濃度（LC25）的氯蟲苯甲酰胺處理以維持其抗性水平。

1.1.2供試藥劑與試劑98.6%氯蟲苯甲酰胺原藥（廣州進(jìn)展生物科技有限公司），使用二甲基亞砜（DMSO）和乳化劑911將其配制成5%乳油。2×HiFiTaq PCR StarMix、DNA Maker、限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、EASYspin組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒、Reverse Transcritase M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、StarPrep Plasmid Miniprep Kit（200）快速質(zhì)粒小提取試劑盒和Star-Prep DNA純化/膠回收試劑盒等均購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。Clotech BD SMARTTM RACEcDNA Amplification Kit、大腸桿菌DH5α、pMD18-T載體均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器設(shè)備PCR儀（T100，伯樂生命醫(yī)藥產(chǎn)品上海有限公司）；熒光定量儀（qTOWER3，德國耶拿分析儀器股份有限公司）；超微量紫外可見分光光度計（ND-100，杭州米歐儀器有限公司）；組織研磨機(jī)（JXFSTPRP-24，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2試驗方法

1.2.1不同種群小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的敏感性測定采用浸葉法，測定方法、結(jié)果調(diào)查和抗性倍數(shù)（RR）計算方法等均參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2360—2013《十字花科小菜蛾抗藥性監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》進(jìn)行。RR=抗性種群的致死中濃度（LC50）/敏感品系的LC50?？剐运絼澐謽?biāo)準(zhǔn)：RR≤10，低水平抗性；10lt;RR≤100，中等水平抗性；RRgt;100，高水平抗性。

1.2.2 FKBP基因全長克隆

1.2.2.1引物設(shè)計合成根據(jù)RACE試劑盒說明設(shè)計并合成RACE引物，利用Primer Premier 5.0進(jìn)行巢式引物及熒光定量PCR引物設(shè)計，如表1所示。

1.2.2.2總RNA提取和FKBP基因的PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物純化取5～10頭敏感種群小菜蛾3齡幼蟲整蟲，先用焦碳酸二乙酯（DEPC）水清洗3次，以濾紙吸干后置于1.5 mL無菌離心管中，加入液氮急凍，用特制的小研磨棒快速將其研磨成粉末，按照EASYspin組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒說明提取小菜蛾總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒及RACE試劑盒的操作說明合成cDNA第一鏈，并置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。根?jù)RACE試劑盒操作說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃35 s，45～55℃35 s，72℃20 s，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。用StarPrep DNA純化/膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，并用超微量紫外可見分光光度計檢測回收產(chǎn)物的濃度。

1.2.3原核表達(dá)質(zhì)粒pMD-FKBP構(gòu)建及測序?qū)⒒厥债a(chǎn)物和載體pMD18-T于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物用大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化，篩選陽性重組子，用StarPrep Plasmid Miniprep Kit（200）快速質(zhì)粒小提取試劑盒進(jìn)行重組質(zhì)粒抽提。再用Hind III和Bam I進(jìn)行雙酶切鑒定，取5μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。委托賽默飛世爾科技公司對酶切產(chǎn)物進(jìn)行測序，并將獲得的序列利用NCBI的BLAST進(jìn)行序列比對和分析。

1.2.4 FKBP基因的表達(dá)差異及其時空表達(dá)譜收集敏感和抗性種群小菜蛾4齡幼蟲頭部、表皮、中腸組織及抗性種群小菜蛾1～4齡幼蟲整蟲、蛹進(jìn)行總RNA提取。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行cDNA第一鏈合成并以其為模板，采用SYBR Green染料法，通過實時熒光定量PCR檢測不同種群4齡幼蟲及其不同組織和抗性種群不同發(fā)育階段FKBP基因的相對表達(dá)量。反應(yīng)體系25μL：cDNA模板1μL，上、下游引物各1μL，2×HiFiTaq PCR StarMix 10μL，ddH2O 12μL。每個樣品4次重復(fù)。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃35 s，42～60℃35 s，72℃1 min，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法（Livak and Schmittgen，2001）并以小菜蛾RPL32基因為內(nèi)參基因，定量分析3個FBKP基因的相對表達(dá)量。

1.3基因結(jié)構(gòu)分析

利用GSDS 2.0（https：//gsds.gao-lab.org/）進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。采用MEME在線軟件（https：//meme-suite.org/meme/info/status？service=MEMEamp;id=appM EME_5.5.517144433127781391122981）進(jìn)行Motif分析。利用NCBI中的CDD進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。

1.4統(tǒng)計分析

采用SPSS 19的最小顯著差異（LSD）法對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同種群小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的敏感性測定結(jié)果

由表2可知，抗性種群小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的LC50為92.01 mg/L；相較于敏感種群，其RR為122.67倍，屬于高水平抗性。

2.2不同種群小菜蛾體內(nèi)FKBP基因的相對表達(dá)量

由圖1可知，抗性種群小菜蛾4齡幼蟲中3個FKBP基因（FKBP8、FKBP52和FKBP12）的相對表達(dá)量均顯著高于敏感種群（Plt;0.05，下同），分別是敏感種群的968、117和44倍。

2.3 FKBP基因全長序列克隆與分析結(jié)果

按照RACE試劑盒說明，以敏感種群小菜蛾的cDNA為模板，并用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，克隆得到3個FKBP基因的全長序列，結(jié)果如圖2所示。FKBP12、FKBP8和FKBP52基因均具有完整的開放閱讀框及起始密碼子ATG，其中FKBP52基因全長1473 bp，其編碼區(qū)（CDS）長1272 bp，編碼423個氨基酸殘基，蛋白分子量46982.25 Da，理論等電點5.83，親水性-0.564，屬于親水蛋白。FKBP8基因全長1525bp，其CDS長921bp，編碼307個氨基酸殘基，蛋白分子量33839.70 Da，理論等電點4.87，親水性-0.660，屬于親水蛋白。FKBP12基因全長649bp，其CDS長324bp，編碼108個氨基酸殘基，蛋白分子量11699.29 Da，理論等電點7.85，親水性-0.369，屬于親水蛋白。

如圖3所示，F(xiàn)KBP52蛋白含有2個FkpA結(jié)構(gòu)域、1個TPR結(jié)構(gòu)域、10個Motif，其編碼基因含有1個CDS區(qū)域；FKBP8蛋白含有FKBP_C superfamily和Spy superfamily結(jié)構(gòu)域及10個Motif，其編碼基因含有1個CDS區(qū)域；FKBP12蛋白含有1個FKpA保守結(jié)構(gòu)域及3個Motif，其編碼基因含有1個CDS區(qū)域。

2.4抗性種群小菜蛾不同發(fā)育階段的FKBP基因表達(dá)差異

由圖4-A可知，抗性種群小菜蛾1～4齡幼蟲之間的FKBP52基因相對表達(dá)量差異不顯著（Pgt;0.05，下同）且均高于蛹期，不同發(fā)育階段的相對表達(dá)量排序為2齡幼蟲gt;1齡幼蟲gt;3齡幼蟲gt;4齡幼蟲gt;蛹期，其中1～2齡幼蟲的相對表達(dá)量顯著高于蛹期。由圖4-B可知，抗性種群小菜蛾1～4齡幼蟲之間的FKBP8基因相對表達(dá)量差異顯著，4齡小菜蛾FKBP8基因相對表達(dá)量最高，不同發(fā)育階段的相對表達(dá)量排序為4齡幼蟲gt;1齡幼蟲gt;2齡幼蟲gt;蛹期gt;3齡幼蟲。由圖4-C可知，抗性種群小菜蛾4齡幼蟲FKBP12基因的相對表達(dá)量顯著高于1～3齡幼蟲和蛹期，不同發(fā)育階段的相對表達(dá)量排序為4齡幼蟲gt;蛹期gt;3齡幼蟲gt;1齡幼蟲gt;2齡幼蟲，在1、2和3齡小菜蛾中的相對表達(dá)量差異不顯著。

2.5小菜蛾4齡幼蟲不同組織的FKBP基因表達(dá)差異

為進(jìn)一步了解FKBP基因在小菜蛾體內(nèi)的時空表達(dá)特性及其在小菜蛾抗氯蟲苯甲酰胺中的作用，同時基于該藥劑的作用特點，解剖小菜蛾4齡幼蟲頭部、表皮和中腸組織并提取總RNA后進(jìn)行實時熒光定量PCR分析，結(jié)果如圖5所示。FKBP8基因在同一種群不同組織中的相對表達(dá)量差異不顯著，在敏感種群以頭部的相對表達(dá)量最高，在抗性種群以表皮的相對表達(dá)量最高；在不同種群同一組織中除頭部的相對表達(dá)量差異不顯著外，在中腸和表皮的相對表達(dá)量差異顯著，在抗性種群中腸和表皮中的相對表達(dá)量均顯著高于敏感種群，分別是敏感種群的3.2和3.7倍（圖5-A）。FKBP12基因在敏感種群不同組織中的相對表達(dá)量差異不顯著，而其在抗性種群表皮中的相對表達(dá)量顯著高于敏感種群3種組織及抗性種群頭部和中腸（圖5-B）。FKBP52基因在敏感種群頭部的相對表達(dá)量最高，顯著高于表皮和中腸；抗性種群各組織中FKBP52基因的相對表達(dá)量均低于敏感種群，且頭部和表皮中的相對表達(dá)量顯著低于敏感種群（圖5-C）。

3討論

氯蟲苯甲酰胺是一種雙酰胺類殺蟲劑，對鱗翅目害蟲具有較好的防治效果（劉嘉楠等，2023；周春麗等，2023）；其2012年銷售額為9.10億美元，并逐年遞增，至2019年銷售額達(dá)17.50億美元（陳小平等，2021）。由于氯蟲苯甲酰胺被廣泛、大量地使用，害蟲對其陸續(xù)產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了極大損失。在我國，小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺在短時間內(nèi)已產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，RR值最高達(dá)1749.96倍，給十字花科蔬菜的安全生產(chǎn)帶來困擾（李振宇等，2020）。已有研究發(fā)現(xiàn)，小菜蛾、斜紋夜蛾、番茄潛葉蛾等多種鱗翅目害蟲對氯蟲苯甲酰胺和溴氰蟲酰胺產(chǎn)生了交互抗性（Camposet al.，2015；Liu et al.，2015；Sanget al.，2016；Li etal.，2023）?？孤认x苯甲酰胺的二化螟對氯氟氰蟲酰胺和四氯蟲酰胺等具有交互抗性（趙丹丹等，2017）?？孤认x苯甲酰胺的稻縱卷葉螟對氟氯蟲酰胺、四唑蟲酰胺、溴氰蟲酰胺、環(huán)丙蟲酰胺和四氯蟲酰胺也表現(xiàn)出中等至高水平抗性（王立等，2024）。

闡明抗藥性機(jī)理是抗藥性治理的基礎(chǔ)。因此，研究并闡明害蟲對氯蟲苯甲酰胺的抗藥性機(jī)理，將有助于保護(hù)雙酰胺類殺蟲劑的使用命壽，并為新藥劑的研發(fā)提供新思路。FKBP已成為多個領(lǐng)域中備受關(guān)注的主題，其可以影響產(chǎn)前發(fā)育和許多人類疾病發(fā)病機(jī)制的多種細(xì)胞和分子途徑。FKBP具有免疫抑制、凋亡等功能，其不同的異構(gòu)體調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞途徑，因此，F(xiàn)KBP可為藥物研發(fā)提供一系列的藥物靶點。FKBPs在不同生物體內(nèi)與多種受體信號通路相互作用，鈣調(diào)磷酸酶（CaN）信號通路是其中之一。CaN信號通路由鈣通道（Cch1）、轉(zhuǎn)運蛋白（Mid1）、鈣感覺蛋白（鈣調(diào)素，CaM）、鈣調(diào)素依賴性磷酸酶和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶相互作用蛋白組成。FKBP通過與FK506結(jié)合抑制鈣調(diào)磷酸酶A亞基（CnA）和鈣調(diào)磷酸酶B亞基（CnB），從而抑制鈣信號級聯(lián)反應(yīng)（Park etal.，2019）。張道剛等（2023）研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP46基因通過調(diào)控CaN參與飛蝗（Locusta migratoria）卵的滯育。FKBP59是瞬時受體電位樣（TRPL）復(fù)合物——INAD信號復(fù)合物的一部分，通過與位于通道細(xì)胞質(zhì)口附近的保守的亮氨?！滨６南嗷プ饔茫{(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)運輸（Goel et al.，2001）。FKBP是RyR鈣離子通道的調(diào)節(jié)蛋白，兩者結(jié)合起到穩(wěn)定通道關(guān)閉狀態(tài)的作用。氯蟲苯甲酰胺可結(jié)合在RyR跨膜區(qū)的偽電壓傳感器結(jié)構(gòu)域中，激活鈣離子通道，使其不能正常關(guān)閉，從而導(dǎo)致Ca2+釋放量增加，引起害蟲的肌肉收縮并最終死亡（Bultyncketal.，2000；MacMillan et al.，2008）。由氯蟲苯甲酰胺和FKBP蛋白的作用特點可知，兩者存在必然聯(lián)系。因此，研究FKBP基因在小菜蛾抗氯蟲苯甲酰胺中的作用具有重要意義。Ghartey-Kwansah等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）中8個已知的FKBP基因與人類（Homo sapiens）FKBP12基因具有同源性，其功能也具有多樣性。因此，研究哺乳動物和黑腹果蠅中FKBP基因功能方面的差異，有助于設(shè)計新型殺蟲劑。本研究中FKBP基因為前期從氯蟲苯甲酰胺抗性小菜蛾種群的轉(zhuǎn)錄組分析得到的差異表達(dá)基因，經(jīng)NCBI檢索后發(fā)現(xiàn)，其與多種生物的FKBP基因具有同源性；其中，F(xiàn)KBP8基因與人類FKBP基因序列相似性和一致性分別為83%和30%，E值為8e-43，由此可推斷3個FKBP基因在小菜蛾體內(nèi)具有重要功能。

本研究克隆得到3個FKBP基因，分別為FKBP12、FKBP52和FKBP8。FKBP12基因是目前研究最多的FKBP基因，其與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，具有參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)錄等多種生理功能（劉國通和楊成明，2006；Maruyama et al.，2011）。FKBP12是2種結(jié)構(gòu)相關(guān)藥物FK506和雷帕霉素的主要靶點，其與FK506或雷帕霉素結(jié)合后，分別抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和雷帕霉素復(fù)合物1的靶標(biāo)（TORC1）；FKBP12還具有調(diào)節(jié)RyR的功能，其與RyR鈣離子釋放通道的緊密聯(lián)系，有利于向全電導(dǎo)水平躍遷，如FKBP12可動態(tài)改變RyR2的活性，即以高親和力激活RyR2，并以低親和力抑制RyR2（Kasahara，2021；Richardson et al.，2023）。FKBP12影響鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶依賴的磷酸化蛋白質(zhì)組，促進(jìn)一部分蛋白質(zhì)的去磷酸化，從而導(dǎo)致α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）毒性（Caraveo etal.，2017）。Gómez等（2004）研究表明，F(xiàn)KBP12.6過表達(dá)使Wistar大鼠（Rattus norvegicus）心肌細(xì)胞的總鈣離子濃度瞬時增加（與肌漿網(wǎng)的鈣超載有關(guān)），從而促進(jìn)興奮—收縮耦聯(lián)。FKBP52與激素依賴性、應(yīng)激反應(yīng)和神經(jīng)退行性疾病相關(guān)（Hanaki and Shimada，2023）；其與瞬時電位離子通道（TRP）或TRPL結(jié)合，使Ca2+濃度升高（Goel et al.，2001）。FKBP8在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，參與細(xì)胞內(nèi)運輸和蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、細(xì)胞生長和分化及癌癥等病理過程（Agu-ileraetal.，2022）。FKBP8過表達(dá)顯著減弱仙臺病毒誘導(dǎo)的干擾素β啟動子（IFN-β）、核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）和干擾素刺激反應(yīng)元件（ISRE）的激活；FKBP8過表達(dá)也降低了二聚體IRF3的活性，但增強(qiáng)了病毒的復(fù)制，而RNA干擾敲低FKBP8的表達(dá)則顯示出相反的效果（Xu etal.，2019）。此外，F(xiàn)KBP8是雷帕霉素受體蛋白（mTOR）激酶的內(nèi)在抑制劑，其通過mTOR激酶參與代謝調(diào)控（Zhang et al.，2021）；其還通過將抗凋亡蛋白募集到線粒體抑制凋亡，影響mTOR激酶的調(diào)節(jié)及細(xì)胞缺氧反應(yīng)的調(diào)節(jié)（Misaka et al.，2018；王紅等，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)，小菜蛾不同發(fā)育階段的3個FKBP基因相對表達(dá)量均存在差異；氯蟲苯甲酰胺抗性種群小菜蛾4齡幼蟲表皮中的FKBP12和FKBP8基因相對表達(dá)量最高，顯著高于敏感種群，而抗性種群4齡幼蟲不同組織的FKBP52基因表達(dá)量均低于敏感種群，說明FKBP12、FKBP8和FKBP52基因可能在小菜蛾體內(nèi)具有不同的功能。已有研究表明，F(xiàn)KBP蛋白在各組織中所處地位不同及其在不同組織與RyR各個亞型的親和力不同，會導(dǎo)致其表達(dá)量有所差異（陳默，2013；范娟等，2015）。本研究還發(fā)現(xiàn)，抗性種群小菜蛾中3個FKBP基因的相對表達(dá)量均顯著高于敏感種群，說明其可能通過表達(dá)量的變化以提高小菜蛾的免疫活性，進(jìn)而增強(qiáng)小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗藥性。此外，F(xiàn)KBP8基因在高抗氯蟲苯甲酰胺種群小菜蛾的中腸高表達(dá)，且顯著高于敏感種群，說明其可能通過表達(dá)量的增高導(dǎo)致小菜蛾抗藥性的變化。因此，F(xiàn)KBP8基因可能在小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗性形成中具有重要作用。

4結(jié)論

克隆得到的3個FKBP基因FKBP52、FKBP8和FKBP12均由1個CDS組成。3個FKBP基因在氯蟲苯甲酰胺抗性種群小菜蛾中均過量表達(dá)，其中FKBP8基因在高抗氯蟲苯甲酰胺種群小菜蛾的中腸高表達(dá)，說明FKBP8基因可能通過過量表達(dá)參與小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗藥性。

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（責(zé)任編輯麻小燕）