敲低RIP3 對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)人腎小管上皮HK2 細(xì)胞自噬、細(xì)胞焦亡和鐵死亡的影響

［摘 要］ 目的：探討敲低受體相互作用蛋白激酶3（RIP3）對(duì)缺氧復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)下人腎小管上皮HK2細(xì)胞自噬、焦亡和鐵死亡的影響。方法：將慢病毒干擾載體質(zhì)粒shRIP3和陰性對(duì)照慢病毒干擾載體質(zhì)粒shNC 分別轉(zhuǎn)染至HK2 細(xì)胞中，分為shRIP3 組和shNC 組，另以正常培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染的HK2 細(xì)胞作為空白組，轉(zhuǎn)染48 h 后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR） 法和Western blotting 法驗(yàn)證慢病毒轉(zhuǎn)染效果。將HK2 細(xì)胞分為對(duì)照組、H/R 組、shNC+H/R 組和shRIP3+H/R 組。CCK-8 法檢測(cè)各組HK2 細(xì)胞存活率，免疫熒光染色法檢測(cè)各組細(xì)胞中微管結(jié)合蛋白1 輕鏈（LC） 3B 和含核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域富亮氨酸重復(fù)序列（NLR） 家族Pyrin 域蛋白3 （NLRP3） 蛋白熒光強(qiáng)度，Western blotting 法檢測(cè)各組HK2 細(xì)胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin1、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1、膜穿孔蛋白D （GSDMD）、白細(xì)胞介素（IL）-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)水平， 試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中鐵離子（Fe2+） 水平。結(jié)果：與空白組和shNC組比較，shRIP3組HK2細(xì)胞中RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05）。CCK-8 法檢測(cè)，與對(duì)照組比較，H/R 組HK2 細(xì)胞存活率明顯降低（Plt;0. 05）；與H/R 組比較，shRIP3+H/R 組HK2 細(xì)胞存活率明顯升高（Plt;0. 05）。免疫熒光染色法檢測(cè)，與對(duì)照組比較，H/R 組HK2 細(xì)胞中LC3B 蛋白熒光強(qiáng)度明顯降低（Plt;0. 05），NLRP3 蛋白熒光強(qiáng)度明顯升高（Plt;0. 05）；與H/R 組比較，shRIP3+H/R 組HK2 細(xì)胞中LC3B 蛋白熒光強(qiáng)度明顯升高（Plt;0. 05），NLRP3 蛋白熒光強(qiáng)度明顯降低（Plt;0. 05）。Western blotting 法檢測(cè)，與對(duì)照組比較，H/R 組HK2 細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯降低（Plt;0. 05），Beclin1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05）； 與H/R 組比較，shRIP3+H/R 組HK2 細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高（Plt;0. 05），Beclin1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）；與對(duì)照組比較，H/R 組HK2 細(xì)胞中Caspase-1、GSDMD、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）；與H/R 組比較，shRIP3+H/R組HK2細(xì)胞中Caspase-1、GSDMD、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05）。與對(duì)照組比較， H/R 組HK2 細(xì)胞中GPX4 和SLC7A11 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05）；與H/R 組比較，shRIP3+H/R 組HK2 細(xì)胞中GPX4和SLC7A11 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與對(duì)照組比較，H/R 組HK2 中細(xì)胞Fe2+水平明顯升高（Plt;0. 05）； 與H/R 組比較， shRIP3+H/R 組HK2 細(xì)胞中Fe2+ 水平明顯降低（Plt;0. 05）。結(jié)論：靶向敲低RIP3可誘導(dǎo)H/R誘導(dǎo)人腎小管上皮HK2細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞焦亡和減輕鐵死亡。

［關(guān)鍵詞］ 人腎小管上皮HK2 細(xì)胞； 缺氧/復(fù)氧； 受體相互作用蛋白激酶3； 自噬； 焦亡； 鐵死亡

［中圖分類號(hào)］ R692 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

急性腎損傷是一種急性危重腎臟疾病，通常由腎缺血/再灌注、腎毒素、腎切除術(shù)和膿毒癥引起［1］。目前，重癥監(jiān)護(hù)病房患者急性腎損傷的發(fā)病率和死亡率高達(dá)50% 以上［2］。腎缺血/再灌注損傷作為急性腎損傷的常見原因之一，主要由于腎臟局部缺血后恢復(fù)血供而造成不可逆性腎功能損傷，其發(fā)生和進(jìn)展與多種分子事件有關(guān)，如離子蓄積、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、炎癥及細(xì)胞凋亡［3-4］。因此，探討抑制腎缺血/再灌注損傷的有效治療方法對(duì)于預(yù)防急性腎損傷較為重要。

受體相互作用蛋白激酶（receptor interactingprotein kinase，RIP） 3 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在介導(dǎo)炎癥和細(xì)胞死亡中起重要的作用。研究［5］顯示： RIP3 促進(jìn)膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷，并在脂多糖處理的近端腎小管上皮細(xì)胞（renalproximal tubular epithelial cells， PTEC） 中激活，通過促進(jìn)氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙加重腎小管損傷。此外，抑制RIP3 可以通過恢復(fù)膿毒性急性腎損傷期間腎小管細(xì)胞的自噬降解起到腎臟保護(hù)作用， RIP3 可能參與急性腎損傷的發(fā)生發(fā)展［6］。本研究通過缺氧復(fù)氧（hypoxia reoxygenation， H/R）誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞HK2 在體外模擬腎缺血/再灌注模型，探討RIP3 敲低后對(duì)H/R 誘導(dǎo)的人腎小管上皮HK2 細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制， 為急性腎損傷的臨床防治提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人腎小管上皮細(xì)胞HK2 來源于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。胎牛血清、1% 青-鏈霉素及DMEM 培養(yǎng)基購于美國Hyclone 公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司，TRIzol、反轉(zhuǎn)錄和鐵SYBR Green 定量檢測(cè)試劑盒購于日本TaKaRa 公司， RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、超敏ECL 試劑液和DAPI染料購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CCK-8 試劑購于北京康為世紀(jì)公司，Triton X-100 購于北京百奧萊博科技有限公司，鐵離子（ferri ion，F(xiàn)e2+）檢測(cè)試劑盒購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司，兔抗甘油醛3 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 多克隆抗體、兔抗RIP3 多克隆抗體、兔抗微管結(jié)合蛋白1 輕鏈（microtubule binding protein 1 light chain， LC）3B多克隆抗體、兔抗Beclin1 單克隆抗體、兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartatespecific proteinase， Caspase）-1 多克隆抗體、兔抗膜穿孔蛋白D （gasdermin-D，GSDMD） 單克隆抗體、兔抗白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β 單克隆抗體、兔抗IL-18 單克隆抗體、兔抗谷胱甘肽過氧化物酶4 （glutathione peroxidase 4， GPX4） 單克隆抗體、兔抗溶質(zhì)載體家族7 成員11 （solute carrierfamily 7 member 11， SLC7A11） 多克隆抗體、含核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域富亮氨酸重復(fù)序列（nucleotidebindingdomain leucine-rich repeat， NLR） 家族Pyrin 域蛋白3 （NLR family Pyrin-domain protein 3，NLRP3） 和多克隆抗體及辣根過氧化物酶/花青3（cyanine 3， Cy3） 熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體均購于英國Abcam 公司。引物序列、慢病毒干擾載體質(zhì)粒shRIP3 和陰性對(duì)照慢病毒干擾載體質(zhì)粒shNC 由生工生物工程（上海） 有限公司合成和構(gòu)建。

1. 2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將HK2細(xì)胞置于含10%胎牛血清與1% 青-鏈霉素混合溶液的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2 環(huán)境下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將慢病毒干擾載體質(zhì)粒shRIP3和陰性對(duì)照慢病毒干擾載體質(zhì)粒shNC 分別轉(zhuǎn)染至HK2 細(xì)胞中，分為shRIP3 組和shNC 組，具體根據(jù)Lipofectamine 2000 試劑盒說明書步驟執(zhí)行。另以正常培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染的HK2 細(xì)胞作為空白組，轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細(xì)胞并加入新鮮完全培養(yǎng)基，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitativePCR ， RT-qPCR） 法和Western blotting 法驗(yàn)證慢病毒轉(zhuǎn)染效果。

1. 3 H/R細(xì)胞模型制備和分組 H/R建模方法［7］：將HK2 細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱內(nèi)（含94% N2、5%CO2 和1% O2） 持續(xù)培養(yǎng)6 h 后， 再移至復(fù)氧培養(yǎng)箱內(nèi)（含74% N2、5% CO2 和21% O2） 中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，造成HK2 細(xì)胞的H/R。將HK2 細(xì)胞分為對(duì)照組（HK2 細(xì)胞在正常環(huán)境下培養(yǎng)）、H/R 組（HK2 細(xì)胞進(jìn)行H/R 處理）、shNC+H/R 組（HK2細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照慢病毒干擾載體質(zhì)粒shNC 后進(jìn)行H/R 處理） 和shRIP3+H/R 組（HK2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒干擾載體質(zhì)粒shRIP3 后進(jìn)行H/R 處理）。

1. 4 RT-qPCR 法 檢 測(cè) 各 組 HK2 細(xì) 胞 中 RIP3mRNA表達(dá)水平 各組 HK2細(xì)胞中添加 TRIzol試劑， 按照說明書步驟提取總RNA， 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-qPCR 法檢測(cè)各組HK2 細(xì)胞中RIP3mRNA 表達(dá)水平， 參照SYBR Green 法熒光定量PCR 試劑盒說明書， 加入各試劑與對(duì)應(yīng)底物cDNA， 反應(yīng)體系體積共20 μL， 定量檢測(cè)系統(tǒng)上設(shè)置兩步法反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火/延伸30 s，循環(huán)40 次。實(shí)驗(yàn)重復(fù)檢測(cè)3 次， 以β -actin 為內(nèi)參， 采用2—△△Ct 法計(jì)算RIP3 mRNA 表達(dá)水平。引物序列： RIP3 上游引物5'-GGACCTCAAGCCCTCTAACA-3'， RIP3下游引物5'-ACCTCGGAGACAGCAGCATC-3'；β-actin 上游引物5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3'， β-actin 下游引物5'-CTGGGTCATCTTTTCACGGT-3'。

1. 5 Western blotting法檢測(cè)各組HK2細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平 使用RIPA裂解液提取各組HK2細(xì)胞總蛋白，BCA 法進(jìn)行定量。蛋白樣品經(jīng)100 ℃金屬浴煮沸變性后， 將等量30 μg 蛋白加入凝膠孔，通過10% SDS-PAGE 電泳分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。再將分離后的膜浸入5% 脫脂奶粉中，室溫封閉2 h，加入兔抗RIP3、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin1、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18、GPX4 和SLC7A11 抗體作為一抗， 均按1∶ 1 000 稀釋，與膜在4 ℃下共孵育。次日，取膜復(fù)溫，TBST 溶液洗滌后，加入對(duì)應(yīng)標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體作為二抗， 按1∶ 5 000 稀釋， 與膜在室溫下共孵育，2 h 后再以TBST 溶液洗膜， 超敏ECL 試劑液顯色， 曝光顯影， 圖像掃描儀檢測(cè)蛋白條帶， 采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值， 以GAPDH 作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 6 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率 將HK2細(xì)胞按照每孔3×103 個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2 環(huán)境下過夜培養(yǎng)。各孔內(nèi)添加10 μL 新鮮配制的CCK-8 試劑， 繼續(xù)孵育2 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長450 nm 處各孔吸光度（A） 值， 并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A 值- 空白孔A 值） / （對(duì)照組A 值-空白孔A 值） ×100%。

1. 7 免疫熒光染色法檢測(cè)各組細(xì)胞中 LC3B 和NLRP3蛋白熒光強(qiáng)度 取各組HK2細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，4% 多聚甲醛固定后，滴加0. 5%Triton X-100滲透15 min， 磷酸鹽緩沖液（phosphate bufferedsaline， PBS） 清洗后， 5% 山羊血清封閉1 h。甩去多余封閉液，加入兔抗LC3B 多克隆抗體或兔抗NLRP3 多克隆抗體分別作為一抗，均按照1∶100稀釋，4 ℃下孵育過夜。次日，PBS 緩沖液再次清洗，加入Cy3 熒光標(biāo)記的二抗，按照1∶200 稀釋，避光室溫孵育2 h，DAPI 染色液染核15 min，抗淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察染色情況，攝取圖像，采用Image J 軟件分析LC3B 和NLRP3 蛋白熒光強(qiáng)度。蛋白熒光強(qiáng)度= 實(shí)驗(yàn)組蛋白熒光強(qiáng)度/對(duì)照組蛋白熒光強(qiáng)度。

1. 8 采用試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中 Fe2+水平 各組HK2 細(xì)胞采用PBS 緩沖液洗滌后加入200 μL 裂解液裂解細(xì)胞，置于搖床處理2 h。將緩沖液與4. 5% 高錳酸鉀溶液按照1∶1 比例混勻，設(shè)置空白對(duì)照管、標(biāo)準(zhǔn)品管和樣品管，根據(jù)試劑盒說明書添加各試劑和樣品，混勻后于60 ℃條件下孵育1 h，冷卻至室溫后， 加入30 μL Fe2+檢測(cè)劑， 室溫下孵育30 min，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長550 nm 處各孔A 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算Fe2+水平。

1. 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism7. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪制圖像。各組HK2 細(xì)胞中RIP3 mRNA 表達(dá)水平、細(xì)胞存活率、HK2 細(xì)胞中LC3B 蛋白熒光強(qiáng)度和RIP3、Beclin1、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18、GPX4 及SLC7A11 蛋白表達(dá)水平以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均符合正態(tài)分布，以x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組HK2細(xì)胞中RIP3 mRNA和蛋白表達(dá)水平 與空白組（1. 00±0. 08 和0. 84±0. 07） 和shNC 組（1. 03±0. 10 和0. 83±0. 08） 比較，shRIP3 組HK2細(xì)胞中RIP3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平（0. 24±0. 02和0. 26±0. 02） 均明顯降低（Plt;0. 05）。見圖1。

2. 2 各組HK2細(xì)胞存活率 與對(duì)照組比較，H/R組HK2 細(xì)胞存活率明顯降低（Plt;0. 05）。與H/R 組比較， shRIP3+H/R 組HK2 細(xì)胞存活率明顯升高（Plt;0. 05）， shNC+H/R 組HK2 細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見圖2。

2. 3 各組 HK2 細(xì)胞中 LC3B 和 NLRP3 蛋白熒光強(qiáng)度 與對(duì)照組（1. 00±0. 04 和1. 00±0. 05） 比較，H/R 組HK2 細(xì)胞中LC3B 蛋白熒光強(qiáng)度（ 0. 24±0. 02 ） 明顯降低（Plt;0. 05）， NLRP3蛋白熒光強(qiáng)度（2. 38±0. 25） 明顯升高（Plt;0. 05）。與H/R 組比較， shRIP3+H/R 組HK2 細(xì)胞中LC3B 蛋白熒光強(qiáng)度（1. 23±0. 11） 明顯升高（Plt;0. 05）， NLRP3 蛋白熒光強(qiáng)度（1. 17±0. 13）明顯降低（Plt;0. 05），shNC+H/R 組HK2 細(xì)胞中LC3B 和NLRP3 蛋白熒光強(qiáng)度（0. 25±0. 03 和2. 29±0. 25） 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見圖3 和4。

2. 4 各組HK2細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，H/R組 HK2細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯降低（Plt;0. 05），Beclin1蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05）。與H/R 組比較，shRIP3+H/R 組HK2 細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高（Plt;0. 05）， Beclin1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）， shNC+H/R 組HK2 細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1 蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見圖5。

2. 5 各組 HK2 細(xì)胞中 Caspase-1、GSDMD、IL-1β和 IL-18 蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，H/R 組HK2 細(xì)胞中Caspase-1、GSDMD、IL-1β 和IL-18蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與H/R 組比 較， shRIP3+H/R 組HK2 細(xì)胞中Caspase-1、GSDMD、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05），shNC+H/R 組HK2 細(xì)胞中Caspase-1、GSDMD、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見圖6 和7。

2. 6 各組 HK2 細(xì)胞中 GPX4 和 SLC7A11 蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，H/R組HK2細(xì)胞中GPX4和SLC7A11 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05）。與H/R 組比較， shRIP3+H/R 組HK2 細(xì)胞中GPX4 和SLC7A11 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）， shNC+H/R 組HK2 細(xì)胞中GPX4 和SLC7A11 蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見圖8 和9。

2. 7 各 組 HK2 細(xì) 胞 中 Fe2+ 水 平 與 對(duì) 照 組［ （1. 00±0. 03） μmol·g－1］ 比較， H/R 組HK2細(xì)胞中Fe2+水平［（1. 67±0. 19） μmol·g－1］ 明顯升高（Plt;0. 05）。與H/R 組比較，shRIP3+H/R 組HK2 細(xì)胞中Fe2+ 水平［ （1. 22±0. 14） μmol·g－1］明顯降低（Plt;0. 05），shNC+H/R 組HK2 細(xì)胞中Fe2+水平［（1. 69±0. 18） μmol·g－1］ 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。

3 討 論

臨床上，急性腎損傷患者的腎功能迅速惡化，表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率降低、體液和電解質(zhì)失衡及代謝廢物的積累， 給患者生命健康造成了嚴(yán)重威脅［8］。急性腎損傷的嚴(yán)重程度與多種因素有關(guān)，確切發(fā)病機(jī)制有待深入研究。RIP3 作為程序性壞死的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可以控制腫瘤壞死因子受體家族的下游信號(hào)傳導(dǎo)， 并通過與RIP1 相互作用導(dǎo)致RIP3-RIP3 同源相互作用及RIP3 磷酸化， 磷酸化的RIP3 募集并激活混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域（mixed lineage kinase domain-like， MLKL）， 使MLKL 易位至細(xì)胞膜誘導(dǎo)壞死性病變［9］。WANG 等［10］研究發(fā)現(xiàn)： RIP3 缺乏減輕了氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的小鼠高尿酸血癥，降低了腎臟促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平，對(duì)腎臟損傷起保護(hù)作用。FENG 等［11］ 研究發(fā)現(xiàn)：RIP3 易位至線粒體， 促進(jìn)線粒體降解， 增加腎缺血再灌注后炎癥反應(yīng)和腎組織損傷；WANG 等［12］發(fā)現(xiàn)：急性DeBakeyⅠ型主動(dòng)脈夾層患者血漿RIP3水平與術(shù)后急性腎損傷和炎癥反應(yīng)有關(guān)，且患者血漿RIP3 水平越高，患者生存率越低。因此，RIP3在急性腎損傷中發(fā)揮了重要作用，可能是未來治療策略的重要靶點(diǎn)。本研究在H/R 誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染慢病毒干擾載體質(zhì)粒shRIP3， 并成功敲低了RIP3 的mRNA 和蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果顯示：敲低RIP3 表達(dá)能夠減輕H/R 誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞焦亡和鐵死亡， 誘導(dǎo)HK2 細(xì)胞自噬， 并使細(xì)胞存活率升高。

自噬是一種高度保守的過程，通過溶酶體降解和回收錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)及衰老細(xì)胞器，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［13］。自噬功能障礙與多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，激活自噬對(duì)急性腎損傷具有保護(hù)作用。恩格列凈可通過促進(jìn)自噬和降低氧化應(yīng)激、炎癥及凋亡改善非糖尿病大鼠的腎缺血再灌注損傷［14］。缺血預(yù)處理通過激活近端腎小管細(xì)胞自噬，進(jìn)而減少缺血再灌注急性期腎組織中巨噬細(xì)胞浸潤，介導(dǎo)腎內(nèi)膜的保護(hù)作用［15］。LC3B 屬于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白8 （autophagy-related protein，ATG8） 基因的同系物，定位于自噬囊泡膜表面，參與自噬體形成。自噬過程涉及LC3-Ⅰ 向LC3-Ⅱ 的轉(zhuǎn)化，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可被視為反映自噬水平的主要指標(biāo)［16］。Beclin1 是自噬的成熟調(diào)節(jié)因子，與Ⅲ類磷脂酰肌醇3 激酶復(fù)合物相互作用，產(chǎn)生磷酸化磷脂酰肌醇后，通過與相關(guān)核心成分結(jié)合以促進(jìn)自噬體的形成和成熟［17］。本研究結(jié)果顯示： H/R 誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞中LC3B 蛋白熒光強(qiáng)度降低， LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低，Beclin1 蛋白表達(dá)水平降低，表明H/R 處理抑制了HK2 細(xì)胞自噬；敲低RIP3 后可升高HK2 細(xì)胞中LC3B 蛋白熒光強(qiáng)度，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高， Beclin1 蛋白表達(dá)水平升高， 提示敲低RIP3 可誘導(dǎo)H/R 誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞自噬。

腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展均與細(xì)胞焦亡有關(guān)。焦亡導(dǎo)致的細(xì)胞死亡與凋亡相似，均以DNA 斷裂為特征。然而，焦亡是依賴炎癥反應(yīng)的程序性壞死，該過程不由經(jīng)典的凋亡相關(guān)途徑所調(diào)節(jié)［18］。H/R 中產(chǎn)生的大量活性氧加劇了炎癥活動(dòng)，有助于炎癥信號(hào)因子的形成，包括NLRP3 炎性體，其激活可進(jìn)一步誘發(fā)焦亡［19］。NLRP3 炎性小體由NLRP3、Caspase-1 前體（pro-Caspase-1） 和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like proteincontaining a card，ASC） 組成，其催化pro-Caspase-1轉(zhuǎn)化為活化的Caspase-1， 從而促進(jìn)IL-1β 和IL-18的成熟和分泌，并激活GSDMD 產(chǎn)生N 末端片段寡聚物，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，誘導(dǎo)焦亡發(fā)生［20］。因此，抑制NLRP3 炎性體介導(dǎo)的焦亡是抑制腎缺血/再灌注后腎損傷的重要途徑。本研究結(jié)果顯示： H/R誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞中NLRP3 蛋白熒光強(qiáng)度升高，Caspase-1、GSDMD、IL-1β 和IL-18 蛋白相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)，提示H/R 處理促進(jìn)了HK2 細(xì)胞焦亡發(fā)生； 在敲低RIP3 后HK2 細(xì)胞中NLRP3 蛋白熒光強(qiáng)度降低，Caspase-1、GSDMD、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)均下調(diào)，提示敲低RIP3 能夠抑制H/R 誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞焦亡。

本研究結(jié)果顯示：H/R 誘導(dǎo)后HK2 細(xì)胞中Fe2+ 水平升高， 鐵死亡負(fù)調(diào)節(jié)蛋白GPX4 和SLC7A11 蛋白表達(dá)下調(diào)。鐵死亡是一種新型細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)方式，由鐵介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化積累、質(zhì)膜破裂和損傷相關(guān)分子的釋放所誘導(dǎo)。特定小分子化合物作用于細(xì)胞各向異性靶標(biāo)，導(dǎo)致抗氧化劑谷胱甘肽或GPX4 表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞中活性氧積累和脂質(zhì)過氧化，在Fe2+的協(xié)同作用下，細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［21］。SLC7A11 是胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個(gè)亞基，主要功能是跨細(xì)胞膜交換胱氨酸和谷氨酸， 從而抑制鐵死亡［22］。鐵死亡失調(diào)已在多種生理和病理過程中得到證實(shí)，如癌癥、組織損傷和T 淋巴細(xì)胞免疫等。此外，人尿源性干細(xì)胞來源的外泌體攜帶的長鏈非編碼RNA （long non-codingRNA， lncRNA） 中磺酸上調(diào)基因1 （taurineupregulated 1， TUG1） 通過抑制?；o酶A 合成酶長鏈家族成員4 （acyl-CoA synthetase long-chainfamily member 4， ACSL4） 介導(dǎo)的鐵死亡來緩解缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷［23］。核苷治療減輕了葉酸誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠腎組織病變，抑制了炎癥細(xì)胞浸潤并改善了腎功能障礙，這一作用機(jī)制與抑制鐵死亡有關(guān)，提示鐵死亡可能是腎臟損傷治療的新靶點(diǎn)［24］。本研究結(jié)果顯示：敲低HK2 細(xì)胞中RIP3 后，細(xì)胞中Fe2+水平降低，鐵死亡負(fù)調(diào)節(jié)蛋白GPX4 與SLC7A11 蛋白表達(dá)水平升高， 提示敲低RIP3 能夠減輕H/R 誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞鐵死亡。

綜上所述，靶向敲低RIP3 可誘導(dǎo)H/R 人腎小管上皮HK2 細(xì)胞自噬、抑制細(xì)胞焦亡和減輕鐵死亡，對(duì)H/R 環(huán)境下的HK2 細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)效果，本研究結(jié)果為臨床上預(yù)防和治療缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷提供了新的思路。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：何國斌參與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和文章撰寫，王煥參與研究設(shè)計(jì)。

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