miR-30c-5p 對前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及其機(jī)制

［摘 要］ 目的：探討微小RNA（miR） -30c-5p對人前列腺癌細(xì)胞 （LNCap） 增殖、遷移和侵襲的影響，并闡明其可能的機(jī)制。方法：LNCap細(xì)胞根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒不同分為 LNCap組 （無轉(zhuǎn)染質(zhì)粒）、miR-30c-5p mimic 組（轉(zhuǎn)染miR-30c-5p mimic）、mimic NC 組（轉(zhuǎn)染miR-30c-5p mimic NC）、sh-DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子4 （DDIT4） 組（轉(zhuǎn)染sh-DDIT4）、sh-NC 組（轉(zhuǎn)染sh-DDIT4 NC）、miR-30c-5pmimic+pc-DNA3. 1-NC 組（共轉(zhuǎn)染miR-30c-5p mimic 和pc DNA3. 1-DDIT4 空載質(zhì)粒） 和miR-30c-5pmimic+pc-DNA3. 1-DDIT4 組（共轉(zhuǎn)染miR-30c-5p mimic 和pc-DNA3. 1-DDIT4 過表達(dá)質(zhì)粒），RWPE-1 細(xì)胞正常培養(yǎng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測各組細(xì)胞中miR-30c-5p 和DDIT4mRNA 表達(dá)水平， Western blotting 法檢測各組細(xì)胞中DDIT4 蛋白表達(dá)水平， CCK-8 法檢測各組LNCap 細(xì)胞增殖率，Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測各組LNCap 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組LNCap細(xì)胞劃痕愈合率，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-30c-5p 與DDIT4 的靶向關(guān)系。體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)， 18 只雄性BALB/c 裸鼠隨機(jī)分為空白組、agomiR-NC 組（轉(zhuǎn)染agomiR-30c-5p NC） 和agomiR-30c-5p 組（轉(zhuǎn)染agomiR-30c-5p），每組6 只。agomiR-NC 組和agomiR-30c-5p 組裸鼠皮下注射LNCap細(xì)胞，空白組裸鼠注射等量生理鹽水，檢測各組小鼠腫瘤體積。HE 染色觀察各組小鼠前列腺癌組織形態(tài)表現(xiàn)，RT-qPCR 法和免疫熒光染色法檢測各組小鼠前列腺癌組織中miR-30c-5p 和DDIT4 mRNA表達(dá)水平及DDIT4蛋白熒光強(qiáng)度。結(jié)果：體外前列腺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，與人正常前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞比較，前列腺癌LNCap 細(xì)胞中miR-30c-5p 表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01），DDIT4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）；轉(zhuǎn)染48 h 后，與LNCap 組和mimic NC 組比較，miR-30c-5pmimic 組LNCap 細(xì)胞中miR-30c-5p 表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）。與LNCap 組和sh-NC 組比較，sh-DDIT4 組LNCap 細(xì)胞中DDIT4 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）； 與miR-30c-5p mimic 組和miR-30c-5p mimic+pcDNA3. 1 NC 組比較，miR-30c-5p mimic +pc-DNA3. 1-DDIT4 組LNCap 細(xì)胞中miR-30c-5p表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）；與miR-30c-5p mimic組和miR-30c-5p mimic+pcDNA3. 1 NC組比較，miR-30c-5p mimic+pc-DNA3. 1-DDIT4 組LNCap 細(xì)胞中DDIT4 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）； 與miR-30c-5p mimic 組和miR-30c-5p mimic+pcDNA3. 1 NC 組比較， miR-30c-5p mimic+pc-DNA3. 1-DDIT4 組LNCap 細(xì)胞中DDIT4 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）。CCK-8 法檢測，與LNCap 組和mimic NC 組比較， miR-30c-5p mimic 組LNCap 細(xì)胞增殖率明顯降低（Plt;0. 01）； 與LNCap 組和sh-NC 組比較，sh-DDIT4 組LNCap 細(xì)胞增殖率明顯降低（Plt;0. 01）；與miR-30c-5pmimic 組和miR-30c-5p mimic+pcDNA3. 1 NC 組比較， miR-30c-5p mimic+pc-DNA3. 1-DDIT4 組LNCap 細(xì)胞增殖率明顯升高（Plt;0. 01）。Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測，與LNCap 組和mimic NC 組比較，miR-30c-5p mimic 組LNCap 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（Plt;0. 01）；與LNCap 組和sh-NC 組比較，sh-DDIT4 組LNCap 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（Plt;0. 01）； 與miR-30c-5p mimic 組和miR-30c-5pmimic+pcDNA3. 1 NC 組比較，miR-30c-5p mimic+pc-DNA3. 1-DDIT4 組LNCap 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加（Plt;0. 01）。劃痕實(shí)驗(yàn)檢測，與LNCap 組和mimic NC 組比較，miR-30c-5p mimic 組LNCap 細(xì)胞劃痕愈合率明顯降低（Plt;0. 01）；與LNCap 組和sh-NC 組比較，sh-DDIT4 組細(xì)胞劃痕愈合率明顯降低（Plt;0. 01）；與miR-30c-5p mimic 組和miR-30c-5p mimic+pcDNA3. 1 NC 組比較，miR-30c-5p mimic+pc-DNA3. 1-DDIT4組細(xì)胞劃痕愈合率明顯升高（Plt;0. 01）。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測，與共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-DDIT4和mimic NC 的LNCap 細(xì)胞比較，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-DDIT4 和miR-30c-5p mimic 的LNCap 細(xì)胞中熒光素酶活性明顯降低（Plt;0. 01）。體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)， 細(xì)胞注射后第3、6、9、12 和15 天， 與空白組和agomiR-NC 組比較， agomiR-30c-5p 組裸鼠腫瘤體積明顯減?。≒lt;0. 05）。HE 染色觀察，空白組和agomiR-NC 組小鼠前列腺癌組織中細(xì)胞核增大，核仁突出且畸形；agomiR-30c-5p 組小鼠前列腺癌組織部分區(qū)域細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核恢復(fù)正常形態(tài)。RT-qPCR 法和免疫熒光染色法檢測，與agomiR-NC 組比較， agomiR-30c-5p 組小鼠前列腺癌組織中miR-30c-5p 表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）；與空白組和agomiR-NC 組比較，agomiR-30c-5p組小鼠前列腺癌組織中DDIT4 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）；DDIT4 蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，與空白組和agomiR-NC 組比較，agomiR-30c-5p 組小鼠前列腺癌組織中DDIT4 蛋白熒光強(qiáng)度明顯降低（Plt;0. 01）。結(jié)論：miR-30c-5p在前列腺癌LNCap細(xì)胞中表達(dá)水平明顯降低，其可通過靶向下調(diào)DDIT4 抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，從而參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。

［關(guān)鍵詞］ 前列腺腫瘤； 微小RNA-30c-5p； DNA 損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子4； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞遷移

［中圖分類號(hào)］ R737. 25 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

前列腺癌是全世界男性中常見的癌癥，每年約160 萬例患者發(fā)病，其中36. 6 萬例患者死亡，大多數(shù)患者最終會(huì)進(jìn)展為去勢抵抗性前列腺癌，目前臨床尚無有效的治療手段［1］。因此，尋找新的更有效的前列腺癌治療靶點(diǎn)尤為關(guān)鍵。創(chuàng)新型診斷性生物標(biāo)志物可以避免對患者進(jìn)行不必要的活檢和過度治療，目前已發(fā)現(xiàn)前列腺癌基因3 （prostate cancerantigen 3， PCA3） 等多種生物標(biāo)志物［2］， 但是前列腺癌的病因及其發(fā)展機(jī)制尚不明確，因此，需要進(jìn)一步探討前列腺癌的發(fā)病機(jī)制，以發(fā)現(xiàn)更加有效的診斷和治療方法。

微小RNA （micro RNAs，miRNAs） 是一類高度保守且具有組織特異性的非編碼小片段RNA［3］。研究［4］ 發(fā)現(xiàn)：miR-34a 是一種可用于治療前列腺癌的miRNA， 腫瘤蛋白P53 （tumor protein P53，TP53） 活化miR-34a 的啟動(dòng)子區(qū)域， 其表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。BONAFé 等［5］ 發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)miR-30c-5p 能夠下調(diào)絲氨酸或蘇氨酸激酶通路中蛋白激酶B （protein kinase B，Akt） 和P53-B 細(xì)胞淋巴瘤2 （B-cell lymphoma-2， Bcl-2） 通路活性， 進(jìn)一步調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展。研究［6］ 發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)的miR-30c-5p 會(huì)阻礙膀胱癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲能力并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。DNA 損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子4 （DNA damage inducing transcriptionfactor 4，DDIT4） 是一種線粒體和腫瘤相關(guān)蛋白，參與腫瘤耐藥、增殖和侵襲，StarBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測DDIT4 是miR-30c-5p 的潛在靶向基因［7］。研究［8］表明：DNA 損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子4 反義RNA1 （DNAdamage inducible transcript 4 antisense RNA1，DDIT4-AS1） 在三陰性乳腺癌（triple-negativebreast cancer， TNBC） 細(xì)胞系和組織中高表達(dá)，并通過激活自噬促進(jìn)TNBC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。盡管在前列腺癌的鑒別診斷中已發(fā)現(xiàn)多種具有臨床意義的長鏈非編碼RNA 分子，但因其在研究中的一致性等問題而一直存在爭議，miRNAs 等短鏈非編碼RNA 分子因其穩(wěn)定性而在疾病鑒別診斷中具有潛在的價(jià)值［9］。目前有關(guān)miR-30c-5p 與靶標(biāo)共同調(diào)控前列腺癌的作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)聯(lián)合體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討miR-30c-5p 對前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并初步闡明其作用機(jī)制，旨在為前列腺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1. 1 動(dòng)物、細(xì)胞、主要試劑和儀器 雄性 BALB/c裸鼠18 只，體質(zhì)量19～20 g，購自中國科學(xué)院昆明動(dòng)物所， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可格證號(hào)： SCXK （湘）2019-0004。人正常前列腺上皮RWPE-1 細(xì)胞（貨號(hào)：tings-1618238） 購自合肥萬物生物科技有限公司，人前列腺癌LNCap 細(xì)胞（貨號(hào)：C6515） 購自上海碧云天生物科技有限公司。RPMI-1640 培養(yǎng)基、Defined K-SFM 培養(yǎng)基、1% 青-鏈霉素溶液和總RNA 提取試劑盒均購自中國上海賽默飛世爾科技有限公司，pcDNA3. 1 載體購自上海酶研生物科技有限公司，psiCHECK-2 熒光素酶報(bào)告基因載體購自美國Promega 公司，CCK-8 試劑盒購自北京索萊寶公司，抗DDIT4（貨號(hào)：ab191871）、抗GAPDH（貨號(hào)： ab8245） 和山羊抗兔二抗抗體（貨號(hào)：ab205718） 購自英國Abcam 公司，RIPA 蛋白裂解液購自上海碧云天生物科技有限公司， Transwell"小室購自美國康寧公司。倒置熒光顯微鏡（型號(hào)：DP74） 購自日本OLYMPUS 公司， -20 ℃ 冰柜（型號(hào)：BCD-200） 購自合肥美菱公司，單孔水浴鍋（型號(hào)： 尚光） 購自上海尚道儀器制造有限公司，低速離心機(jī)（型號(hào)：TD5B） 購自長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)：CI-191C）購自美國精騏有限公司。

1. 2 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 、轉(zhuǎn) 染 和 分 組 LNCap 細(xì) 胞 和RWPE-1 細(xì)胞接種于含10% 胎牛血清（fetal bovineserum， FBS） 和1% 青-鏈霉素溶液的RPMI-1640培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)60% 時(shí)， 調(diào)整細(xì)胞密度為1. 0×105 mL－1，將LNCap 細(xì)胞根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒不同分為LNCap 組（無轉(zhuǎn)染質(zhì)粒）、miR-30c-5pmimic 組（轉(zhuǎn)染miR-30c-5p mimic）、mimic NC 組（轉(zhuǎn)染miR-30c-5p mimic NC）、sh-DDIT4 組（轉(zhuǎn)染sh-DDIT4）、sh-NC 組（ 轉(zhuǎn)染sh-DDIT4 NC）、miR-30c-5p mimic+pc-DNA3. 1-NC 組（ 共轉(zhuǎn)染miR-30c-5p mimic 和pc DNA3. 1-DDIT4 空載質(zhì)粒）及miR-30c-5p mimic+pc-DNA3. 1-DDIT4 組（共轉(zhuǎn)染miR-30c-5p mimic 和pc-DNA3. 1-DDIT4 過表達(dá)質(zhì)粒）， RWPE-1 細(xì)胞正常培養(yǎng)。按照LipofectamineTM 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，混勻后放入37 ℃ 培養(yǎng)箱中，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法和Western blotting 法驗(yàn)證細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率＝轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1. 3 RT-qPCR 法檢測各組細(xì)胞中 miR-30c-5p 和DDIT4 mRNA表達(dá)水平 選取對數(shù)生長期 LNCap細(xì)胞，采用TRIzol 試劑提取各組LNCap 細(xì)胞總RNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA， 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件： 95 ℃預(yù)變性10 min， 95 ℃變性，60 ℃退火20 s，72 ℃伸長34 s，共循環(huán)30 次。以U6 和GAPDH 為內(nèi)參， 采用2—△△Ct 法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。引物序列見表1。

1. 4 Western blotting 法檢測各組細(xì)胞中 DDIT4蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，采用RIPA裂解液裂解各組細(xì)胞， BCA 試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。將提取的蛋白質(zhì)用10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，采用5% 牛血清白蛋白密封1 h。將膜與一抗DDIT4 （1∶ 1 000） 及相應(yīng)的山羊抗兔二抗（1∶2 000） 于4 ℃混合過夜。采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 洗膜后，化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，以GAPDH（1∶1 000） 為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算DDIT4 蛋白表達(dá)水平。DDIT4 蛋白表達(dá)水平=DDIT4 蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 5 CCK-8法檢測各組LNCap細(xì)胞增殖率 選取對數(shù)生長期LNCap 細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)， 細(xì)胞消化、重懸和離心后， 將細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，孵育0、24 和48 h， 并在對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分別加入10 μL CCK-8 試劑，將培養(yǎng)基更換為細(xì)胞活性檢測液，繼續(xù)孵育1～2 h。采用分光光度計(jì)于波長450 nm處檢測各孔吸光度（A） 值，重復(fù)3 次，取平均值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率= （實(shí)驗(yàn)孔A 值－ 空白孔A 值） / （對照孔A 值－ 空白孔A 值） ×100%。

1. 6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測各組 LNCap細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù) 將無血清培養(yǎng)基與 Matrigel溶液配比，將其平鋪于Transwell 小室上室，放入培養(yǎng)箱靜置至凝固。選取對數(shù)生長期LNCap 細(xì)胞株進(jìn)行消化、重懸和離心后， 采用無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至3. 0×105 mL－1，取100 μL 細(xì)胞溶液加入Transwell小室的Matrigel 基質(zhì)膠上， 在Transwell 小室的下室加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，用棉簽擦拭上室細(xì)胞，甲醇固定30 min，雙蒸餾水洗滌2～3 次，然后用0. 5% 結(jié)晶紫染色， 光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5 個(gè)視野計(jì)數(shù)各組穿膜細(xì)胞數(shù)，并取其平均值即為侵襲細(xì)胞數(shù)，以侵襲細(xì)胞數(shù)代表各組LNCap 細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1. 7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組 LNCap 細(xì)胞劃痕愈合率 將各組LNCap 細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。采用移液槍槍頭進(jìn)行劃痕，PBS 緩沖液洗滌。加入RPMI-1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分別于0 和24 h 拍攝細(xì)胞，計(jì)算各組細(xì)胞劃痕愈合率，以代表各組細(xì)胞遷移能力。細(xì)胞劃痕愈合率= （0 h 劃痕寬度-24 h 劃痕寬度） /0 h 劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1. 8 雙熒光素酶標(biāo)記檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性 采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測miR-30c-5p與DDIT4 之間的靶向關(guān)系。構(gòu)建DDIT4 的3'-UTR區(qū)的突變型（MUT-DDIT4） 和野生型（WTDDIT4）質(zhì)粒。將LNCap 細(xì)胞消化和離心， 采用不含血清RPMI-1640 培養(yǎng)基進(jìn)行重懸和培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h 后將mimic NC 和miR-30c-5p mimic 分別與MUT-DDIT4 及WT-DDIT4 共轉(zhuǎn)染至LNCap 細(xì)胞中，后更換為有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h 后，采用報(bào)告基因測定系統(tǒng)試劑盒檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。細(xì)胞熒光素酶活性= 螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1. 9 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)造模和分組 采用皮下注射LNCap 細(xì)胞和分別轉(zhuǎn)染agomir-NC 和agomiR-30c-5p的LNCap 細(xì)胞構(gòu)建腫瘤生長小鼠模型。將18 只雄性BALB/c 裸鼠隨機(jī)分為空白組、agomiR-30c-5p 組（轉(zhuǎn) 染 agomiR-30c-5p） 和 agomiR-NC 組（轉(zhuǎn) 染agomiR-30c-5p NC）， 每組6 只。將LNCap 細(xì)胞通過皮下注射至小鼠構(gòu)建體內(nèi)腫瘤生長模型，待瘤體生長后2 周開始向瘤體注射agomiR，注射劑量為每只每次5 nmol，每周注射2 次，共注射2 周，空白組裸鼠注射等量生理鹽水，小鼠瘤體長出并飼養(yǎng)4 周后進(jìn)行取材。每隔3 d 測量各組裸鼠腫瘤長徑及短徑，計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積= ［長徑× 短徑2］ /2。注射后30 d 對小鼠實(shí)施安樂死，收集各組小鼠瘤體備用。本實(shí)驗(yàn)獲得云南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：KYLX2024-132）。

1. 10 HE染色觀察各組小鼠前列腺癌組織形態(tài)表現(xiàn) 將小鼠瘤體組織于多聚甲醛溶液中固定，進(jìn)行脫水、透明和浸蠟處理，石蠟包埋，制備5 μm 厚度的切片，再經(jīng)脫蠟和蘇木精-伊紅染色，二甲苯透明和中性樹膠封片，顯微鏡下觀察各組小鼠前列腺癌組織形態(tài)表現(xiàn)，拍照并記錄。

1. 11 RT-qPCR法和免疫熒光染色法檢測各組小鼠前列腺癌組織中miR-30c-5p和DDIT4 mRNA表達(dá)水平及DDIT4蛋白熒光強(qiáng)度 RT-qPCR步驟同“1. 3”， 采用4% 多聚甲醛固定各組LNCap 細(xì)胞15 min，0. 3%Triton X-100 通透10 min，采用5%牛血清白蛋白于PBS+0. 1% Tween 20 溶液中阻斷，室溫下1 h。然后，采用抗DDIT4 抗體于4 ℃下孵育細(xì)胞過夜。洗滌后， 羊抗兔二抗室溫下孵育細(xì)胞2 h。共聚焦顯微鏡觀察各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度并拍照。采用Image J 軟件進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度半定量分析。

1. 12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 Graph-Pad Prism 8. 3 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞中miR-30C-5p表達(dá)水平和DDIT4 mRNA 及蛋白表達(dá)水平，各組細(xì)胞增殖率、侵襲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞劃痕愈合率及各組細(xì)胞中熒光素酶活性， 各組小鼠前列腺癌組織中miR-30c-5p 和DDIT4 mRNA 表達(dá)水平及DDIT4 蛋白熒光強(qiáng)度均符合正態(tài)分布， 以x ± s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組細(xì)胞中 miR-30c-5p 表達(dá)水平和 DDIT4mRNA 及蛋白表達(dá)水平 與人正常前列腺上皮RWPE-1 細(xì)胞（6. 07±0. 62、0. 34±0. 05 和0. 45±0. 04） 比較，前列腺癌LNCap 細(xì)胞中miR-30c-5p表達(dá)水平（1. 65±0. 57） 明顯降低（Plt;0. 01），DDIT4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平（1. 20±0. 18 和0. 80±0. 20） 均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。轉(zhuǎn)染48 h 后，與LNCap 組和mimic NC 組（3. 02±1. 77 和4. 09±0. 08） 比較， miR-30c-5p mimic 組LNCap 細(xì)胞中miR-30c-5p 表達(dá)水平（12. 30±0. 37）明顯升高（Plt;0. 01）。與LNCap 組和sh-NC 組（1. 15±0. 14 和1. 14±0. 13） 比較， sh-DDIT4 組LNCap 細(xì)胞中DDIT4 mRNA 表達(dá)水平（0. 36±0. 03）明顯降低（Plt;0. 01）。與miR-30c-5p mimic 組和miR-30c-5p mimic+pcDNA3. 1 NC 組（12. 30±0. 37 和1. 04±0. 11） 比較， miR-30c-5p mimic+pc-DNA3. 1-DDIT4 組LNCap 細(xì)胞中miR-30c-5p 表達(dá) 水 平（0. 30 ± 0. 01） 明 顯 降 低（Plt;0. 01）；與miR-30c-5p mimic 組和miR-30c-5p mimic+pcDNA3. 1 NC 組（0. 98±0. 04 和1. 12±0. 23）比較，miR-30c-5p mimic+pc-DNA3. 1-DDIT4 組LNCap細(xì)胞中DDIT4 mRNA 表達(dá)水平（6. 13±0. 68） 明顯升高（Plt;0. 01）。與miR-30c-5p mimic 組和miR-30c-5p mimic+pcDNA3. 1 NC 組（0. 59±0. 16 和0. 69±0. 06）比較， miR-30c-5p mimic+pc-DNA3. 1-DDIT4 組LNCap 細(xì)胞中DDIT4 蛋白表達(dá)水平（1. 04±0. 08） 明顯升高（Plt;0. 05）。見圖1。

2. 2 各 組 LNCap 細(xì) 胞 增 殖 率 與 LNCap 組 和mimic NC 組（125. 54%±2. 63% 和115. 28%±4. 73%）比較，miR-30c-5p mimic 組LNCap 細(xì)胞增殖率（85. 40%±3. 37%） 明顯降低（Plt;0. 01）。與LNCap 組和sh-NC 組（125. 53%±2. 63% 和125. 02%±0. 38%）比較， sh-DDIT4 組LNCap 細(xì)胞增殖率（91. 12%±1. 72%）明顯降低（Plt;0. 01）。與miR-30c-5p mimic 組和miR-30c-5p mimic+pcDNA3. 1 NC 組（85. 40%±3. 37% 和85. 87%±6. 73%） 比 較，miR-30c-5p mimic + pc-DNA3. 1-DDIT4 組LNCap 細(xì)胞增殖率（103. 92%±4. 10%）明顯升高（Plt;0. 01）。

2. 3 各組 LNCap 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù) 與 LNCap 組和mimic NC 組比較（200. 33±4. 51 和192. 00±5. 29）， miR-30c-5p mimic 組LNCap 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)（128. 33±6. 66） 明顯減少（Plt;0. 01）。與LNCap 組和sh-NC 組（200. 33±4. 51 和190. 67±6. 03） 比較，sh-DDIT4 組LNCap 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)（85. 67±4. 51） 明顯減少（Plt;0. 01）。與miR-30c-5pmimic 組和miR-30c-5p mimic+pcDNA3. 1 NC 組（128. 33±6. 66和116. 00±4. 00） 比較，miR-30c-5pmimic+pc-DNA3. 1-DDIT4 組LNCap 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)（225. 00±5. 00） 明顯增加（Plt;0. 01）。見圖2～4。

2. 4 各組 LNCap 細(xì)胞劃痕愈合率 與 LNCap 組和mimic NC 組（74. 33%±1. 30% 和57. 30%±1. 65%） 比較，miR-30c-5p mimic 組LNCap 細(xì)胞劃痕愈合率（44. 50%±4. 03%）明顯降低（Plt;0. 01）。與LNCap 組和sh-NC 組（74. 33%±1. 30% 和74. 30%±1. 05%） 比較，sh-DDIT4 組細(xì)胞劃痕愈合率（41. 07%±2. 63%） 明顯降低（Plt;0. 01）。與miR-30c-5p mimic 組和miR-30c-5p mimic+pcDNA3. 1 NC 組（44. 50%±4. 03% 和8. 60%±0. 82%）比較，miR-30c-5p mimic+pc-DNA3. 1-DDIT4組細(xì)胞劃痕愈合率（69. 67%±1. 80%） 明顯升高（Plt;0. 01）。見圖5。

2. 5 DDIT4與miR-30c-5p的靶向關(guān)系和各組細(xì)胞中熒光素酶活性 StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)DDIT4和miR-30c-5p 的潛在靶向基因， 二者之間的靶向結(jié)合序列見圖6。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示：與共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-DDIT4 和mimic NC 的LNCap細(xì)胞（0. 95±0. 04） 比較， 共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-DDIT4 和miR-30c-5p mimic 的LNCap 細(xì)胞中熒光素酶活性（0. 31±0. 03） 明顯降低（Plt;0. 01）； 與共轉(zhuǎn)染MUT-DDIT4 和mimic NC 的LNCap 細(xì)胞（1. 14±0. 04） 比較， 共轉(zhuǎn)染MUT-DDIT4 和miR-30c-5pmimic 的LNCap 細(xì)胞中熒光素酶活性（1. 08±0. 06） 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。

2. 6 各組小鼠移植瘤生長情況 細(xì)胞注射后第3、6、9、12 和15 天， 與空白組和agomiR-NC 組比較，agomiR-30c-5p 組裸鼠腫瘤體積明顯降低（Plt;0. 05）。見圖7 和表2。

2. 7 各組小鼠前列腺癌組織形態(tài)表現(xiàn) 空白組和agomiR-NC 組小鼠前列腺癌組織中細(xì)胞核增大，核仁突出且畸形；agomiR-30c-5p 組小鼠前列腺癌組織部分區(qū)域細(xì)胞排列整齊， 細(xì)胞核恢復(fù)正常形態(tài)。見圖8。

2. 8 各 組 小 鼠 前 列 腺 癌 組 織 中 miR-30c-5p 和DDIT4 mRNA 表 達(dá) 水 平 及 蛋 白 熒 光 強(qiáng) 度 與agomiR-NC組（1. 12±0. 10） 比較，agomiR-30c-5p組小鼠前列腺癌組織中miR-30c-5p 表達(dá)水平（4. 67±0. 56） 明顯升高（Plt;0. 01）。與空白組和agomiR-NC 組（1. 03±0. 03 和0. 99±0. 07）比較，agomiR-30c-5p 組小鼠前列腺癌組織中DDIT4mRNA 表達(dá)水平（0. 37±0. 09） 明顯降低（Plt;0. 01）。DDIT4 蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)， 與空白組和agomiR-NC 組（73. 76%±2. 57% 和70. 75%±2. 40%）比較，agomiR-30c-5p 組小鼠前列腺癌組織中DDIT4 蛋白熒光強(qiáng)度（41. 00%±1. 66%） 明顯降低（Plt;0. 01）。見圖9。

3 討 論

前列腺癌占全球癌癥死亡人數(shù)的3. 8% ［10］。盡管部分患者病程較為緩慢，但大多數(shù)患者易發(fā)展為局部晚期或轉(zhuǎn)移性癌癥［11］。前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)因素包括預(yù)期壽命延長、高紅肉飲食、前列腺癌易感基因的遺傳和慢性炎癥等［12］。研究［13］ 顯示： 超過90% 的癌癥相關(guān)死亡是由轉(zhuǎn)移引起的， 大部分前列腺癌患者死于癌癥轉(zhuǎn)移。識(shí)別與前列腺癌失控生長有關(guān)的生物標(biāo)志物和機(jī)制可以幫助制定治療此類癌癥的新策略。前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)分層或進(jìn)展是在臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)的支持下進(jìn)行的，如Gleason 評分和血清前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA） 水平的總和， 但目前關(guān)于PSA 作為前列腺癌的診斷、預(yù)后和篩查工具存在爭議，因此關(guān)注其他類型的分子標(biāo)志物尤其重要［14］。截至2020 年，在miRBase v22 數(shù)據(jù)庫中記錄了超過4 800 個(gè)人類成熟miRNA［15］。miR-375 是前列腺癌中研究最多的miRNA，作為前列腺癌檢測的候選生物標(biāo)志物具有應(yīng)用前景［16］。miRNA-182 和miRNA-187 為潛在的前列腺癌重要生物標(biāo)志物， 且miRNA-187 可用于提高前列腺癌診斷和預(yù)后準(zhǔn)確性［17］。

miRNA 參與細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等生物過程的調(diào)節(jié)， 根據(jù)其在癌癥中所發(fā)揮的作用， miRNA可分為腫瘤促進(jìn)劑和腫瘤抑制劑［18-19］。研究［20］顯示：血小板中含有的miR-30a-5p、miR-30d-5p 和miR-30c-5p 可作為2 型糖尿病并發(fā)癥動(dòng)脈粥樣硬化的潛在生物標(biāo)志物，參與凝血、血小板活化和葡萄糖代謝等過程。DU 等［21］ 發(fā)現(xiàn)： DDIT4 在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)， 而下調(diào)DDIT4 表達(dá)可抑制體外和體內(nèi)胃癌細(xì)胞增殖，并增加5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶反義RNA1（nicotinamide nucleotide transhydrogenase-antisenseRNA1， NNT-AS1） 通過靶向miR-496 上調(diào)DDIT4 表達(dá)， 促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的惡性表型［22］。本研究結(jié)果顯示：與人正常前列腺上皮RWPE-1 細(xì)胞比較， miR-30c-5p 在前列腺癌LNCap 細(xì)胞中低表達(dá)，DDIT4 在LNCap 細(xì)胞中高表達(dá)。轉(zhuǎn)染miR-30c-5p mimic 后，LNCap 細(xì)胞中miR-30c-5p 表達(dá)水平明顯升高。轉(zhuǎn)染sh-DDIT4 后，LNCap 中DDIT4mRNA 表達(dá)水平明顯降低。過表達(dá)miR-30c-5p 明顯抑制DDIT4 野生型質(zhì)粒的熒光素酶活性， 而在突變型質(zhì)粒中，過表達(dá)miR-30c-5p 組與mimic NC組熒光素酶活性比較無明顯差異。過表達(dá)miR-30c-5p 能夠抑制LNCap 的增殖、遷移和侵襲，而敲低DDIT4也可抑制LNCap 的增殖、遷移和侵襲。共轉(zhuǎn)染miR-30c-5p mimic 和pcDNA3. 1-DDIT4 后，LNCap細(xì)胞中DDIT4 mRNA 和蛋白均高表達(dá)，能夠促進(jìn)LNCap 的增殖、遷移和侵襲。體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染agomiR-30c-5p 后，小鼠腫瘤體積明顯降低、部分LNCap 細(xì)胞病理學(xué)形態(tài)改善、部分區(qū)域細(xì)胞排列整齊且細(xì)胞核恢復(fù)正常形態(tài)，DDIT4 mRNA 表達(dá)水平降低， miR-30c-5p 表達(dá)水平升高。過表達(dá)miR-30c-5p 通過靶向下調(diào)DDIT4表達(dá)，從而抑制LNCap 的增殖、遷移和侵襲能力，表明DDIT4 具有作為前列腺癌臨床診斷和治療的生物標(biāo)志物的潛力。

綜上所述， 過表達(dá)miR-30c-5p 可顯著抑制前列腺癌LNCap 細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。DDIT4是miR-30c-5p 的靶基因， 過表達(dá)DDIT4 可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-30c-5p 對LNCap 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：趙斌參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施和論文撰寫，楊金葉、李支堯、畢城偉和楊李波參與部分實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，施致裕、李心、張建朋和施遠(yuǎn)龍參與文獻(xiàn)檢索及數(shù)據(jù)收集和整理，楊勇和張國穎參與研究指導(dǎo)及論文審校。

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