趨化因子CCL19 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1 極化對(duì)小鼠慢性胰腺炎的促進(jìn)作用及其機(jī)制

［摘 要］ 目的：探討趨化因子C-C基序配體19（CCL19） 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1極化對(duì)小鼠慢性胰腺炎的促進(jìn)作用，并闡明其相關(guān)機(jī)制。方法：選取10只雄性C57BL/6N小鼠，提取小鼠胰腺腺泡細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞，構(gòu)建巨噬細(xì)胞-腺泡細(xì)胞共培養(yǎng)體系，共培養(yǎng)體系細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組和小干擾RNA CCL19 （si-CCL19） 組，顯微鏡下觀察各組腺泡細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。隨機(jī)選取40 只小鼠，分為正常組和慢性胰腺炎組，每組20 只。HE 染色觀察2 組小鼠胰腺組織病理形態(tài)表現(xiàn)，免疫熒光染色法觀察2 組小鼠胰腺組織中角質(zhì)蛋白19 （CK19）、淀粉酶、M1 型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS） 和F4/80 表達(dá)情況及各組共培養(yǎng)體系細(xì)胞中腺泡細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)及CK19 和淀粉酶表達(dá)情況，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 法檢測(cè)2 組小鼠血清和各組共培養(yǎng)體系細(xì)胞中腫瘤壞死因子α （TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6 和IL-1β 水平， 免疫組織化學(xué)法觀察2 組小鼠胰腺組織中CCL19 蛋白表達(dá)情況，Western blotting 法檢測(cè)2 組小鼠胰腺組織和各組共培養(yǎng)體系細(xì)胞中CCL19 蛋白和關(guān)鍵蛋白核因子κB（NF- κB） 信號(hào)通路相關(guān)蛋白P65、磷酸化P65 （p-P65）、κB 抑制物激酶α/β （IKKα/β）、磷酸化IKKα/β（p-IKKα/β）、IκBα和磷酸化IκBα（p-IκBα） 表達(dá)水平。結(jié)果：HE染色，正常組小鼠胰腺組織腺泡細(xì)胞的緊密排列；與正常組比較，慢性胰腺炎組小鼠胰腺組織腺泡細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的空泡化，即腺泡細(xì)胞導(dǎo)管化，小鼠胰腺炎模型制備成功。免疫熒光染色法，與對(duì)照組比較，模型組腺泡細(xì)胞嚴(yán)重的空泡化明顯，CK19 表達(dá)明顯增加，淀粉酶表達(dá)明顯減少；與模型組比較，si-CCL19 組中腺泡細(xì)胞導(dǎo)管化程度降低，CK19 表達(dá)明顯減少，淀粉酶表達(dá)明顯增加；與正常組比較，慢性胰腺炎組小鼠胰腺組織中淀粉酶表達(dá)明顯減少， CK19 和M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS 及F4/80 表達(dá)均明顯增加。ELISA 法， 與正常組比較， 慢性胰腺炎組小鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平均明顯升高（Plt;0. 05）；與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平均明顯升高（Plt;0. 05）；與模型組比較，si-CCL19 組細(xì)胞中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平均明顯降低（Plt;0. 05）。免疫組織化學(xué)法，與正常組比較，慢性胰腺炎組小鼠胰腺組織中CCL19 蛋白表達(dá)明顯增加。Western blotting 法，與正常組比較，慢性胰腺炎組小鼠胰腺組織中CCL19 蛋白表達(dá)水平和NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-IKKα/β、p-P65及p-IκBα 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中CCL19、p-IKKα/β、p-P65和p-IκBα 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）；與模型組比較，si-CCL19 組細(xì)胞中CCL19、p-IKKα/β、p-P65和p-IκBα蛋白表達(dá)水平均明顯降低 （Plt;0. 05）。結(jié)論：CCL19通過NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1 型極化，誘導(dǎo)炎癥微環(huán)境的產(chǎn)生，促進(jìn)胰腺炎的發(fā)生發(fā)展。

［關(guān)鍵詞］ 胰腺炎； C-C 基序配體19； 巨噬細(xì)胞； M1 型極化； 核因子κB

［中圖分類號(hào)］ R364. 5 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

胰腺是體內(nèi)僅次于肝臟的第二大腺體，由內(nèi)分泌部和外分泌部組成，外分泌部主要由腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞構(gòu)成。腺泡細(xì)胞可以產(chǎn)生和釋放大量消化酶，包括淀粉酶和脂肪酶等，這些消化酶經(jīng)過胰腺導(dǎo)管輸送至十二指腸，對(duì)機(jī)體消化過程發(fā)揮重要作用。在胰腺炎過程中，一部分胰腺腺泡細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，轉(zhuǎn)變?yōu)楣軤罱Y(jié)構(gòu)，成為導(dǎo)管細(xì)胞，不再表達(dá)腺泡細(xì)胞標(biāo)記物，但在治療后胰腺導(dǎo)管細(xì)胞同樣具有向腺泡細(xì)胞轉(zhuǎn)化的潛能［1］。慢性胰腺炎是由多種病因?qū)е碌模让冈谝认賰?nèi)被過度激活后引起胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的炎癥反應(yīng)［2］。

免疫微環(huán)境是炎癥微環(huán)境的重要組成部分，免疫微環(huán)境的改變是導(dǎo)致炎癥產(chǎn)生的主要因素，其中巨噬細(xì)胞是免疫微環(huán)境的重要組成部分［3］。研究［4］顯示：巨噬細(xì)胞的M1 型極化會(huì)通過分泌白細(xì)胞介素（interleukin， IL）-1β、IL-6 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） 等炎癥因子促進(jìn)炎癥的產(chǎn)生。核因子κB （nuclear factor-kappa B，NF-κB） 信號(hào)通路，即NF- κB/κB 抑制物激酶α/β（inhibitor of κB kinase-α/β， IKKα/β） /磷酸化IKKα/β（phosphorylated IKKα/β， p-IKKα/β） /P65/磷酸化P65 （phosphorylated P65， p-P65） /IκBα/磷酸化IκBα （phosphorylated IκBα， p-IκBα）， 其調(diào)控巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，是巨噬細(xì)胞M1 型極化的重要信號(hào)通路［5］。C-C基序配體19（C-C motif ligand 19，CCL19）是CC 類趨化因子家族成員，又稱為巨噬細(xì)胞炎性蛋白3β，是內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性趨化因子。其主要由中性粒細(xì)胞、淋巴內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴結(jié)Ｔ淋巴細(xì)胞釋放，趨化幼稚T 淋巴細(xì)胞和成熟樹突細(xì)胞（dendriticcells，DC）［6］。CCL19 在慢性胰腺炎中對(duì)免疫微環(huán)境具體的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。因此，本研究探討CCL19 對(duì)NF-κB 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，闡明其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1 型極化促進(jìn)胰腺炎發(fā)生的作用機(jī)制，為慢性胰腺炎的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 雄性C57BL/6N小鼠50 只，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （遼） 2020-0001。RPMI-1640 培養(yǎng)基、Waymouth 培養(yǎng)基、胎牛血清和RIPA 緩沖液購(gòu)自北京Biosharp 公司， NewSuper ECL 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百歐泰生物科技有限公司，兔抗CCL19 多克隆抗體、兔抗p-IKKα/β多克隆抗體、兔抗IKKα/β 多克隆抗體、兔抗p-P65多克隆抗體、兔抗P65 多克隆抗體、兔抗p-IκBα 多克隆抗體、兔抗CCL19 多克隆抗體和兔抗GAPDH多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司， 小干擾RNACCL19 （small interfering RNA CCL19，si-CCL19）購(gòu)自廣東省廣州銳博生物有限公司， 即用型HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自北京欣博盛生物科技有限公司，TNF-α、IL-6 和IL-1β 細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣東省深圳康肽生物科技有限公司，熒光標(biāo)記DAPI 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，IκBα一抗、 免疫熒光兔抗角質(zhì)蛋白19（ cytokeratin 19，CK19） 多克隆抗體、兔抗Amylase 多克隆抗體、兔抗F4/80 多克隆抗體、兔抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） 多克隆抗體、Alexa Fluo488 山羊抗兔二抗和Rhodamine 山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司，免疫組織化學(xué)試劑購(gòu)自青島海氏海諾醫(yī)療科技有限公司，其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。低溫高速離心機(jī)和-80°C 冰箱購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek 公司，倒置相差顯微鏡和倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司，電泳儀購(gòu)自北京六一有限公司。

1. 2 小鼠胰腺腺泡細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞提取 提取胰腺腺泡細(xì)胞： 胰蛋白酶抑制劑加入1% 青-鏈霉素雙抗和血清培養(yǎng)基混勻，磷酸二氫鉀溶液、丙酮酸鈉和1% 青-鏈霉素雙抗消化液備用。取5 只小鼠，脫臼處死，置于75% 乙醇溶液浸泡，立即切取小鼠胰腺組織，磷酸鹽緩沖液（phosphate bufferedsaline，PBS） 洗滌2 次，置于消化液中剪碎消化20 min。吸取上清液至離心管中， 皿中加入消化液，二次消化。吸出所有消化液，加入含大豆酶抑制劑的Waymouth 培養(yǎng)基終止消化， 1 720 r·min－1離心2 min， 棄上清液， 加入培養(yǎng)基， 重復(fù)離心1 次，棄上清。乙酸溶液中里加入鼠尾膠原后，加入到培養(yǎng)皿中，沖洗內(nèi)壁。紫外照射放置1 h，PBS 緩沖液沖洗2 次，獲得胰腺腺泡細(xì)胞，吸取培養(yǎng)液并加入新的培養(yǎng)基培養(yǎng)。提取腹腔巨噬細(xì)胞： 取5 只小鼠， 脫臼處死，置于75% 乙醇溶液中浸泡， 切開小鼠腹腔， 后用鑷子夾起腹膜， 吸取冷PBS 和酶緩沖液注入至腹腔中灌洗，手指揉小鼠腹部，用鑷子夾起腹膜再用針管吸出灌洗液，灌洗液中含有的巨噬細(xì)胞即為被采集的腹腔巨噬細(xì)胞。

1. 3 小鼠胰腺腺泡細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系制備和分組 采用巨噬細(xì)胞-腺泡細(xì)胞共培養(yǎng)體系，Transwell 小室培養(yǎng)， 下室為巨噬細(xì)胞， 上室為腺泡細(xì)胞。共培養(yǎng)體系分為對(duì)照組、模型組和si-CCL19 組， 對(duì)照組下室的巨噬細(xì)胞為未極化的原代巨噬細(xì)胞，模型組下室的巨噬細(xì)胞為40 μg·L－1γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ） 和400 μg·L－1 脂多糖（lipopolysaccharide， LPS） 誘導(dǎo)的與炎癥發(fā)展密切相關(guān)的M1 型巨噬細(xì)胞， si-CCL19 組下室為M1 型巨噬細(xì)胞并轉(zhuǎn)染si-CCL19，3 組培養(yǎng)體系的上室均為提取的原代腺泡細(xì)胞［7］。按照參考文獻(xiàn)［8］中方法培養(yǎng)腺泡細(xì)胞。共培養(yǎng)體系中的細(xì)胞制備結(jié)束后，加入RPMI-1640 培養(yǎng)基，孵育18 h，顯微鏡觀察腺泡細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。

1. 4 小鼠胰腺炎模型制備 選取 40 只體質(zhì)量為20～22 g 的C57BL/6N 小鼠， 分為正常組和慢性胰腺炎組， 每組20 只。慢性胰腺炎組小鼠腹腔注射雨蛙素50 μg·kg－1 誘導(dǎo)小鼠胰腺炎模型，每周給藥3 d，每日6 次，每次間隔1 h；正常組小鼠注射同等次數(shù)和劑量的生理鹽水，至第4 周造模結(jié)束，處死小鼠后解剖，取出小鼠胰腺組織［9］。顯微鏡下觀察胰腺炎模型小鼠胰腺組織導(dǎo)管化情況和CK19和淀粉酶表達(dá)情況，判定小鼠胰腺炎模型制備情況。

1. 5 HE 染色觀察 2組小鼠胰腺組織病理形態(tài)表現(xiàn) 小鼠胰腺組織石蠟切片脫蠟后， 蘇木素染色3～8 min，自來(lái)水沖洗，于1% 鹽酸乙醇溶液分化數(shù)秒， 自來(lái)水沖洗， 0. 6% 氨水返藍(lán)， 流水沖洗，伊紅染色1～3 min。切片脫水，中性樹膠封片，顯微鏡觀察2 組小鼠胰腺組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1. 6 免疫熒光染色法觀察 2 組小鼠胰腺組織中CK19、淀粉酶、iNOS和F4/80表達(dá)情況及各組共培養(yǎng)體系細(xì)胞中腺泡細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)及CK19和淀粉酶表達(dá)情況 小鼠胰腺組織石蠟切片脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)，置于抗原修復(fù)液體中，放入微波爐，中火處理30 min。冷卻至室溫后，回收抗原修復(fù)液。加入3% 過氧化氫溶液浸泡10 min， 沖洗。5% 山羊抗兔血清封閉， 水洗。加入兔抗CK19 一抗、兔抗Amylase 一抗、兔抗F4/80 一抗和兔抗iNOS 一抗，室溫孵育2 h?；厥找豢?， PBS 緩沖液洗滌3 次。孵育山羊抗兔二抗，置于室溫避光1 h，回收二抗，使用PBS 緩沖液沖洗。DAPI 染色5 min 后沖洗，顯微鏡觀察2 組小鼠胰腺組織中CK19、淀粉酶、iNOS 和F4/80 免疫熒光強(qiáng)度及各組共培養(yǎng)體系細(xì)胞中腺泡細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)及CK19 和淀粉酶免疫熒光強(qiáng)度。

1. 7 ELISA法檢測(cè) 2組小鼠血清和各組共培養(yǎng)體系細(xì)胞中TNF-α、IL-6和IL-1β水平 取2組小鼠血清，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)2 組樣本中炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平。酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm 處各樣本吸光度（A） 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算2 組小鼠血清和各組共培養(yǎng)體系細(xì)胞中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平。

1. 8 免疫組織化學(xué)法觀察 2 組小鼠胰腺組織中CCL19 蛋白表達(dá)情況 小鼠胰腺組織石蠟切片脫蠟后抗原修復(fù)， 血清封閉， 水洗。加入兔抗CCL19 一抗孵育1. 5 h。PBS 緩沖液洗滌3 次， 孵育山羊抗兔二抗，置于室溫30 min，蘇木素染色。將復(fù)染后切片置于水中， 沖洗后脫水， 中性樹膠封片。顯微鏡觀察2 組小鼠胰腺組織中CCL19 蛋白表達(dá)情況。

1. 9 Western blotting 法檢測(cè) 2 組小鼠胰腺組織和各組共培養(yǎng)體系細(xì)胞中CCL19蛋白及NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 將巨噬細(xì)胞和小鼠胰腺組織于RIPA 緩沖液中裂解，細(xì)胞置于冰上快速充分研磨1 min，胰腺組織于液氮中取出后，置于破碎機(jī)研磨充分破碎。冰上放置15 min。置于4 ℃、11 000 r·min－1 離心15 min， 吸上清于新的離心管中。加入含β-巰基乙醇的上樣緩沖液； 置于95 ℃的金屬浴模塊中加熱變性10 min。制備10%SDS-PAGE 濃縮膠和分離膠進(jìn)行電泳操作。使用聚偏二氟乙烯膜于300 mA 電流條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。TBST 溶液洗膜，脫脂牛奶封閉，兔抗CCL19 一抗（1∶ 1 000）、兔抗p-IKKα/β 一抗（1∶ 1 000）、兔抗IKKα/β 一抗（1∶ 1 000）、兔抗p-P65 一抗（1∶1 000）、兔抗P65 一抗（1∶1 000）、兔抗p-IκBα一抗（1∶ 1 000）、兔抗GAPDH 一抗（1∶ 1 000）和兔抗IκBα 一抗（1∶ 1 000）， 室溫孵育2 h 后回收， 再用TBST 溶液清洗3 次， 加入即用型HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗。孵育1h 后回收清洗。配制顯影液，均勻?yàn)⒃赑VDF 膜上，將膜置于顯影儀中顯影， 采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值， 以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 7. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 組小鼠血清和各組共培養(yǎng)體系細(xì)胞中TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平，CCL19 蛋白和NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以x±s 表示。2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 2組小鼠胰腺組織病理形態(tài)表現(xiàn) 正常組小鼠胰腺組織腺泡細(xì)胞緊密排列。與正常組比較，慢性胰腺炎組小鼠胰腺組織腺泡細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的空泡化，即腺泡細(xì)胞導(dǎo)管化，小鼠胰腺炎模型制備成功。見圖1。

2. 2 各組 M1極化巨噬細(xì)胞-腺泡細(xì)胞共培養(yǎng)體系中腺泡細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)和細(xì)胞中 CK19 和淀粉酶表達(dá)情況 熒光顯微鏡下，綠色熒光強(qiáng)度代表CK19的表達(dá)，紅色熒光強(qiáng)度代表淀粉酶的表達(dá)。與對(duì)照組比較， 模型組腺泡細(xì)胞嚴(yán)重的空泡化明顯，CK19 表達(dá)明顯增加，淀粉酶表達(dá)明顯減少。與模型組比較， si-CCL19 組中腺泡細(xì)胞導(dǎo)管化程度降低， CK19 表達(dá)明顯減少， 淀粉酶表達(dá)明顯增加。見圖2～5。

2. 3 2組小鼠胰腺組織中 CK19、淀粉酶、iNOS和F4/80表達(dá)情況 與正常組比較，慢性胰腺炎組小鼠胰腺組織中淀粉酶表達(dá)明顯減少，CK19 和M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS 及F4/80 表達(dá)均明顯增加。見圖6 和7。

2. 4 2 組 小 鼠 血 清 和 各 組 共 培 養(yǎng) 體 系 細(xì) 胞 中TNF-α、IL-6及 IL-1β水平 與正常組比較，慢性胰腺炎組小鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中TNF- α、IL-6 和IL-1β 水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較，si-CCL19 組細(xì)胞中炎癥因子TNF- α、IL-6 和IL-1β 水平均明顯降低（Plt;0. 05）。見圖8～9。

2. 5 2 組小鼠胰腺組織中 CCL19 蛋白表達(dá)情況 與正常組比較， 慢性胰腺炎組小鼠胰腺組織中CCL19 蛋白表達(dá)明顯增加。見圖10。

2. 6 2組小鼠胰腺組織和各組共培養(yǎng)體系細(xì)胞中CCL19蛋白及 NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與正常組比較， 慢性胰腺炎組小鼠胰腺組織中CCL19、p-IKKα/β、p-P65 和p-IκBα 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與對(duì)照組比較， 模型組細(xì)胞中CCL19、p-IKKα/β、p-P65 和p-IκBα 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較，si-CCL19 組細(xì)胞中CCL19、p-IKKα/β、p-P65 和p-I κ B α 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05）。圖11～13。

3 討 論

慢性胰腺炎是一種胰腺進(jìn)行性炎癥， 病發(fā)后會(huì)伴隨出現(xiàn)腹痛及內(nèi)、外分泌失調(diào)等癥狀［10］。長(zhǎng)期的慢性胰腺炎是誘發(fā)胰腺癌的主要誘因之一，因此治療慢性胰腺炎對(duì)預(yù)防胰腺癌的發(fā)生具有重要意義［11-12］。慢性胰腺炎患者胰腺腺泡細(xì)胞導(dǎo)管化的過程可以通過多種機(jī)制發(fā)生， 包括細(xì)胞類型的選擇性增殖或丟失及祖細(xì)胞的分化或轉(zhuǎn)分化［13-14］。胰腺炎患者胰腺組織中CK19 表達(dá)增加，淀粉酶表達(dá)減少［10］。本研究結(jié)果顯示： 胰腺炎小鼠胰腺組織中M1 型巨噬細(xì)胞數(shù)量增加， CCL19蛋白及NF- κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平升高，提示CCL19 可能與小鼠慢性胰腺炎中M1 型巨噬細(xì)胞NF- κB 信號(hào)通路有密切關(guān)聯(lián)。敲低CCL19后，NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯降低，且si-CCL19 組腺泡細(xì)胞導(dǎo)管化程度降低， 提示抑制CCL19 蛋白表達(dá)可以抑制NF- κ B 信號(hào)通路， 進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞M1 型極化，抑制慢性胰腺炎的產(chǎn)生。

在慢性胰腺炎中，免疫微環(huán)境的改變是導(dǎo)致慢性胰腺炎發(fā)生發(fā)展的重要因素［15］。巨噬細(xì)胞是胰腺炎中豐富的免疫細(xì)胞群體，且具有高度異質(zhì)性，可以響應(yīng)微環(huán)境發(fā)生表型轉(zhuǎn)化， 包括經(jīng)典激活巨噬細(xì)胞（M1 型） 和交替激活巨噬細(xì)胞（M2 型）［16］。M1 型巨噬細(xì)胞具有促炎作用， 會(huì)在炎癥部位富集并產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子， 如IL-1β、IL-6 和TNF-α 等［17-18］。CK19 和淀粉酶表達(dá)情況為評(píng)價(jià)慢性胰腺炎的重要指標(biāo)，而iNOS 和F4/80 表達(dá)情況是評(píng)價(jià)M1 巨噬細(xì)胞的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示：M1 型巨噬細(xì)胞-腺泡細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，模型組腺泡細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的空泡化，即腺泡細(xì)胞導(dǎo)管化，且CK19 表達(dá)增加， 淀粉酶表達(dá)減少， 證實(shí)M1 型極化的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞導(dǎo)管化，進(jìn)而導(dǎo)致胰腺炎的產(chǎn)生。

CCL19 是CC 類趨化因子家族成員，是內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性趨化因子［19］。CCL19 與免疫微環(huán)境有密切關(guān)聯(lián)，同時(shí)還可以通過調(diào)控免疫微環(huán)境對(duì)多種炎癥具有促進(jìn)作用［20］。例如，CCL19 可以通過趨化巨噬細(xì)胞加重小鼠結(jié)腸炎，通過招募中性粒細(xì)胞加重LPS 誘導(dǎo)的急性肺部炎癥， 也可通過抑制中性粒細(xì)胞的積累抑制皮膚炎癥的發(fā)生［21-23］。本研究成功構(gòu)建小鼠胰腺炎模型，胰腺炎小鼠胰腺組織中CCL19 蛋白表達(dá)水平明顯升高， 并伴有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加。在脂多糖處理的肝細(xì)胞中，多功能干細(xì)胞與轉(zhuǎn)錄激活因子相互作用激活了CCL19 的轉(zhuǎn)錄，CCL19 反作用于巨噬細(xì)胞， 促進(jìn)了其在肝臟中的積累［24］。本研究結(jié)果顯示：CCL19 可以通過促進(jìn)NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)， 進(jìn)而對(duì)巨噬細(xì)胞M1 型極化發(fā)揮促進(jìn)作用，誘導(dǎo)小鼠慢性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展， 提示CCL19 在炎癥中是一個(gè)重要的免疫微環(huán)境調(diào)控靶點(diǎn)， 可以通過干預(yù)CCL19 對(duì)炎癥過程中的免疫微環(huán)境起調(diào)控作用， 從而達(dá)到治療目的。

綜上所述， CCL19 通過NF-κB 信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1 型極化，誘導(dǎo)炎癥微環(huán)境的產(chǎn)生，從而促進(jìn)胰腺炎的發(fā)生發(fā)展。CCL19 可以作為治療慢性胰腺炎的靶點(diǎn)，本研究為后續(xù)胰腺炎相關(guān)疾病的臨床治療提供了新的思路。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：崔連鷙參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和論文撰寫，張曉偉參與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，翟悅和潘悅參與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，于秀艷參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)整理。

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